우리의 연구는 단핵구와 대식세포 계통을 조사하여 놀라운 가소성과 염증, 조직 복구 및 감염 시 효과기 반응을 형성하기 위해 환경으로부터의 여러 신호를 통합하는 능력을 강조했습니다. 대식세포는 몸 전체에서 발견되며 보호 및 면역 매개 병리에 영향을 미치는 선천성 및 적응 면역의 시작과 해결을 조정합니다. 대식세포를 재프로그래밍하는 것은 이 분야에서 가장 유망한 기능입니다.
새롭게 등장하는 오믹스 기술은 대식세포 생물학에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으켰으며, 대식세포의 표현형 다양성, 기능적 특성, 프로그래밍 잠재력 및 이러한 세포의 발달 기원에 대한 통찰력을 제공합니다. 대식세포 분화 및 편광을 발견하는 데 있어 주요 장애물과 함정은 문헌 전반에 걸쳐 이질적인 실험 조건과 프로토콜, 그리고 대식세포 용어를 정의하는 데 있어 합의가 이루어지지 않았다는 것입니다. 우리는 대식세포 분극에 대한 약물 및 지질 매개체의 재프로그래밍 효과를 입증하고 대식세포와 교모세포종 세포 간의 상호 작용에 대한 3D 체외 모델을 개발합니다.
또한, 우리는 혈소판이 N1 표현형에 대한 단핵구 유래 대식세포 분화를 허가한다는 것을 보여주었습니다. 시작하려면 항응고된 말초 혈액 샘플을 원심분리기에 넣습니다. 실온에서 200G으로 15분 회전시킵니다.
위에는 혈소판이 풍부한 혈장이 분리되고 아래에는 적혈구와 백혈구를 포함한 세포 분획이 분리되는 것을 관찰합니다. 첫 번째 원심분리에서 얻은 세포 분획을 실온으로 예열된 멸균 PBS로 희석합니다. Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리를 진행하기 전에 용액을 부드럽게 균질화합니다.
15ml의 Ficoll-Hypaque를 멸균 15ml 튜브에 넣습니다. Ficoll 위에 30ml의 희석된 혈액을 조심스럽게 천천히 첨가하여 상 간의 혼합을 최소화합니다. Ficoll과 희석된 혈액이 들어 있는 튜브를 실온에서 600G에서 25분간 원심분리합니다.
멸균 3 밀리리터 파스퇴르 피펫으로 노란색 상층의 일부를 제거하십시오. 멸균 파스퇴르 피펫으로 노란색 층과 Ficoll 층 사이의 계면을 조심스럽게 수집하십시오. 수집된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 최소 3ml의 멸균 PBS가 들어 있는 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다.
멸균 PBS로 튜브를 채우면 총 부피가 12-15밀리리터에 도달합니다. 그런 다음 600G에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 섭씨 8도에서 10도에서 5분 동안 300G에서 PBMC 서스펜션을 회전시킵니다.
2%FBS를 사용하여 원하는 부피의 멸균 콜드 PBS로 세포를 다시 현탁시킵니다. 다음 단계까지 셀을 섭씨 4도로 유지합니다. 원하는 부피의 PBMC 현탁액을 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 세포 현탁액 100마이크로리터당 10마이크로리터의 포지티브 선택 칵테일을 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양하기 전에 현탁액을 철저히 혼합하십시오. 다음으로, 세포 현탁액 100마이크로리터당 10마이크로리터의 자성 나노입자를 피펫팅합니다.
자성 나노 입자의 균일 한 현탁을 보장하기 위해 5 번 이상 위아래로 격렬하게 피펫팅합니다. 실온에서 10분 배양 후 FBS와 EDTA가 포함된 PBS를 현탁액에 첨가하여 총 부피를 2.5ml로 만듭니다. 세포를 위아래로 두세 번 부드럽게 피펫팅합니다.
튜브를 자석 분류기에 삽입하고 5분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 튜브와 함께 자석을 한 번의 연속 동작으로 뒤집습니다. 자석과 튜브를 2-3초 동안 거꾸로 세운 후 똑바로 세운 상태로 되돌립니다.
자석에서 튜브를 제거한 다음 튜브에 2.5ml의 PBS-FBS-EDTA 버퍼를 다시 추가합니다. 세포 현탁액을 위아래로 2-3회 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 자석에 다시 삽입하고 5분 동안 따로 둡니다.
한 번의 연속 동작으로 자석과 튜브를 다시 반전시켜 상등액 분획을 버립니다. 자석에서 튜브를 제거하고 EDTA 없이 적절한 양의 PBS-FBS에 셀을 다시 현탁시킵니다. 이제 양으로 선택된 셀을 사용할 준비가 되었습니다.
이제 분류된 CD14 세포에 PBS-FBS 버퍼를 추가하여 총 부피를 12-14밀리리터로 만들어 남아 있는 EDTA를 희석합니다. 600G에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 버린 후, 양성으로 선택된 CD14 단핵구를 2mL의 PBS-FBS 완충액에 다시 현탁시킵니다.
자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 배양 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오. 배양을 위해 펠릿을 보충된 RPMI 1640 배지에서 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 다시 현탁시킵니다.
250마이크로리터의 준비된 세포 현탁액을 48웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 대식세포 집락 자극 인자 1밀리리터당 50나노그램을 함유한 항생제 보충 RPMI 배지 250마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 세포 배양 플레이트를 가습된 인큐베이터에서 배양하여 대식세포 분화를 시작합니다.
대식세포 분화 4일차에 각 웰에서 배양 배지의 절반을 교체합니다. 원하는 분극 조건에 대한 사이토카인 또는 시약을 추가하고 3일 더 배양을 계속합니다. 표현형 특성 분석을 위해 7일째에 대식세포 유래 단핵구를 채취합니다.
인터페론 감마-플러스 리포다당류에 의해 유도된 M1 대식세포는 CD64가 가장 높았고, CD206이 없었으며, CD163 및 MERTK는 낮은 수치를 보였다. 인터루킨 4에 의해 유도된 M2a 대식세포는 CD206 발현이 증가하고 CD64, CD163 및 MERTK 수치가 감소하는 것이 특징이었습니다. 인터루킨 10 또는 덱사메타손에 의해 유도된 M2c 대식세포는 CD163 및 CD14 발현 증가, CD64의 중간 수준 및 MERTK 발현 증가를 나타냈습니다.
