具有体外转录mRNA的初级巨噬细胞的高效转染

由于巨噬细胞专门检测非自源性分子，它们特别难以转染。我们描述了一种协议，它允许利用从DNA模板（如质粒）生成的mRNA对原食巨噬细胞进行高效的转染。我们方法的主要优点是，在没有任何可检测的细胞毒性或免疫原性的情况下，可以达到高转染率。

演示这个程序将是马克赫伯从我的实验室博士后。首先解冻RNA转录试剂盒的所有成分。将试剂旋出5秒钟，以2000倍g旋转两秒钟，然后将它们放在冰上直到使用。

根据稿稿说明在0.5微升微离心管中准备体外RNA转录反应。旋转管，然后旋转下来。然后在37摄氏度下孵育30分钟，同时在热混合器上以400转/分混合。

孵育后，将DNase I的两微升直接加入反应混合物中。涡流和旋转管下来，并在热混合器中孵育15分钟。为控制凝胶保留 Dnase 处理产品的两微升等分，并将其储存在零下 80 摄氏度。

对于聚A尾矿，在Dnase处理的反应中加入5个10X聚A聚合酶反应缓冲液和5微升聚A聚合酶。漩涡和旋转下来的混合。然后在热混合器中孵育30分钟。

当反应完成后，为控制凝胶服用两微升等分，并将其储存在零下80摄氏度。根据手稿说明，将 5 个主要脱磷酸酯试剂直接添加到聚A尾产品中。涡流和旋转下管，并在热混合器中孵育30分钟。

遵循脱磷反应，在80摄氏度下孵育两分钟，以加热灭活南极磷酸酶。然后使用专用的RNA纯化试剂盒纯化体外转录mRNA。使用微卷分光光度计测量洗样mRNA的浓度和纯度。

使用先前收集的等分，运行变性阿加罗斯凝胶，以验证单个产品是否存在、正确的转录长度和聚A尾随。通过将 mRNA 转染缓冲液的预计算体积减去 mRNA 转染试剂和 mRNA 的体积添加到反应管中，为转染做好准备。解冻 mRNA 库存，通过翻转管子轻轻混合。

然后将mRNA的预计算体积添加到反应管中。涡流并旋转反应混合物和mRNA转染试剂，然后将mRNA转染试剂的适当体积添加到反应混合管中。旋转管，然后旋转下来。

然后在室温下孵育15分钟。同时，用清新温暖的培养媒介代替巨噬细胞的培养媒介。转染混合物的孵育完成，将混合物加入含有巨噬细胞的板井中，并在井外到井中间的圆圈中加入。

确保转染混合物的均匀分布，以垂直和水平方向轻轻摇动板。然后在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育至少6小时。孵育后，用荧光显微镜、流式细胞仪或免疫布洛特分析转染效率。

这个程序最重要的部分是确保转染组合的均匀分布，使所有巨噬细胞接触相同数量的mRNA。该协议成功地用于生成 mRNA 编码 FLAG 标记 NEMO 和 IKK-beta 变种，用于原发巨噬细胞的转染。通过红糖凝胶电泳验证了mRNA的正确尺寸和聚A尾随。

通过生成mRNA编码GFP并进行流细胞学分析，证实了转染效率。转染率随转染mRNA的量而增加，PM达到50%至65%，BMDM达到80至85%。在PM和BMDM中，转染细胞中的EGFP表达水平以时间和剂量依赖的方式增加。

重要的是，对碘化阳性或附件V阳性巨噬细胞的分析证实，转染程序没有诱发细胞解或凋亡细胞死亡。利用免疫荧光显微镜对编码 FLAG 标记的尼莫或 IKK-beta 变种的 mRNA 的转染效率进行了分析。尼莫 mRNA 的费率约为 60%，IKK-beta mRNA 的费率约为 55%。

该协议还用于生成 mRNA 编码 Cre 重组酶。40万BMDM转染与400纳米的Cre重组酶mRNA导致48小时后尼莫蛋白几乎完全耗尽，表明高效的转染。没有任何可检测量的白细胞素1β、白细胞素-6和肿瘤坏死因子表明转染程序不会激活亲炎信号。

我们相对简单的方法最终允许有效地表达原发巨噬细胞中的突变或标记蛋白。这将大大进一步分析分子水平上的巨噬细胞功能。