体内研究 使用酵母中的生物发光报告基因监测代谢转变过程中的转录活性

我们的研究或主要研究集中在微生物多样性、系统发育组学和发酵应用上，强调酵母多样性、适应性，特别是酵母生物学的工业应用。具体到该应用，我们研究了酵母的发酵效率、风味产生和抗逆性。因此，我们最近的进展与酵母系统发育组学有关，特别是来自巴塔哥尼亚的酵母系统发育组学。

然后我们用它来生成用于啤酒发酵的新型贮藏酵母，但我们也将新型酵母用于低酒精度啤酒。总的来说，我们使用不同的组学技术和实验进化来开发这种用于生物基因组学应用的新型酵母。我们目前正在使用不同的技术，如基因组测序、长读长基因组测序和转录组学。

然后，我们总而言之，使用这些信息对我们拥有的不同菌株进行一些实验进化，然后我们尝试使用 CRISPR 技术或不同的酵母转化技术来验证一些基因组变化，通过这种方式，我们了解酵母适应发酵环境的分子细节。因此，我们面临两大挑战。一种是通过高效的啤酒发酵来生产新型拉格酵母，另一种则完全相反。

我们希望获得能够产生低酒精度啤酒的新型菌株，特别是来自巴塔哥尼亚的菌株。我想强调我们实验室的两个主要结果。其中之一是我们确定了拉格酵母的母体 Saccharomyces eubayanus 的巴塔哥尼亚起源。

现在，我们还生产了数十种用于啤酒发酵的新型拉格杂交种。我认为这是我们研究的两个主要发现。首先，从转化的酵母菌株贴剂中挑选样品，并将其接种到含有 5% 葡萄糖和 200 微摩尔潮霉素的酵母蛋白胨培养基中。

在 25 摄氏度下孵育培养物 24 小时，不要摇晃。在新鲜培养基中以 1 至 10 倍稀释度刷新培养物，然后再孵育 24 小时。用无糖酵母蛋白胨培养基洗涤细胞，然后以 1 至 10 倍的稀释度将它们接种到测试培养基中。

在测试培养基中补充荧光素至终浓度为 3 毫摩尔，并补充 200 微摩尔潮霉素以保持质粒稳定性。对于混合糖生长测试，在酵母蛋白胨培养基中使用葡萄糖-麦芽糖基质，葡萄糖和麦芽糖浓度增加。将 200 微升培养物分配到 96 孔板的每个孔中。

现在使用光度计读板器每 30 分钟测量 620 纳米的发光和光密度，持续 72 小时。将积分时间设置为 1 秒并禁用衰减，以确保持续的报告基因活动和细胞密度监测。对于发酵取样和发光监测，首先将麦芽提取物溶解在水中，以制备麦芽提取物培养基。

在 20 摄氏度的 5 ml YPD 培养基中预培养转化的酵母菌株，并以 200 RPM 搅拌 24 小时。将预培养物转移到 50 毫升麦芽提取物培养基中，然后在 20 摄氏度下以每分钟 200 转的速度搅拌孵育 24 小时。在室温下以 21， 380 G 离心培养物 1 分钟以收获细胞。

然后将细胞重悬于 12 度板的麦芽提取物培养基中，一式三份，进行 50 毫升微发酵。在培养基中补充 0.3 毫克/升氯化锌，以提高发酵性能。计算接种量以确保不同重复的细胞密度一致。

用计算的接种量接种制备的培养基。然后将培养物置于 20 摄氏度下，不要摇晃 14 天。通过记录每天损失的二氧化碳来监控发酵进度。

每天对容器进行称重，以测量累积失重量作为二氧化碳产生的指标。对于发光监测，定期从每个微发酵中取样 200 μL。添加荧光素以达到 3 毫摩尔的最终浓度。

使用光度计读板器测量 620 纳米处的发光和光密度，无衰减和一秒积分时间。游离型报告基因质粒 pRS426-PMAL32-LUC-HphMX 用 PMAL32 启动子荧光素酶 ORF 和 hphMX 盒成功构建。在不同葡萄糖和麦芽糖浓度下，三种转化菌株的荧光素酶活性存在差异。

CBS12357T 和 CL467.1 显示无葡萄糖激活，而 QC18 需要超过 1% 葡萄糖浓度才能激活。在微发酵条件下，3 株转化菌株均在不同时间表现出强烈的发光峰值。野生型菌株中没有发光。