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Ice-Cap: A Method for Growing <em>Arabidopsis</em> and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

University of Wisconsin-Madison

&#x635F;&#x5931;&#x7684;&#x51FD;&#x6570;&#x3001; &#x663E;&#x6027;&#x8D1F;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x65B9;&#x6CD5;&#x88AB;&#x7528;&#x6765;&#x8C03;&#x67E5;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5; &#xFF08;&#x56FE;&#xFF09; &#x4E1D;&#x88C2;&#x7D20;&#x6D3B;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; MPK6 &#x6574;&#x4E2A;&#x53D1;&#x5C55;&#x6240;&#x8D77;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x690D;&#x7269;&#x7684; MPK6 &#x663E;&#x793A; T DNA &#x7A7A;&#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x7EAF;&#x5408;&#x964D;&#x4F4E;&#x7537;&#x6027;&#x751F;&#x80B2;&#x529B;&#x548C;&#x5F02;&#x5E38;&#x82B1;&#x836F;&#x53D1;&#x80B2;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;mpk6 &#x5DE5;&#x5382;&#x6240;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x79CD;&#x5B50;&#x7684;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x88AB;&#x53D1;&#x73B0;&#x542B;&#x6709;&#x4ECE;&#x5176;&#x79CD;&#x76AE;&#x7834;&#x88C2;&#x4E86;&#x7684;&#x80DA;&#x80CE;&#x3002;&#x529F;&#x80FD;&#x5197;&#x4F59;&#xFF0C;&#x663E;&#x6027;&#x8D1F;&#x7248;&#x672C;&#x7684; MPK6 &#x6784;&#x9020;&#x7684;&#x7EE7;&#x627F;&#x6CD5;&#x7684;&#x89C4;&#x5B9A;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x5FAA;&#x73AF;&#x6BCD;&#x9898;&#x6539;&#x4E3A;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x7684;&#x9178;&#x5E8F;&#x5217; AEF &#x5730;&#x5740;&#x6F5C;&#x529B;&#x3002;&#x690D;&#x7269;&#x901A;&#x8FC7; MPK6 &#x672C;&#x673A;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x8868;&#x8FBE; MPK6AEF &#x53D1;&#x73B0;&#x4EA7;&#x751F;&#x8FC7;&#x5EA6;&#x7684;&#x6C14;&#x5B54;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x6C14;&#x5B54;&#x9635;&#x5217;&#x4E2D;&#x7684; MPK6 &#x6700;&#x8FD1;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4F5C;&#x7528;&#x76F8;&#x4E00;&#x81F4;&#x3002;&#x65B0;&#x578B;&#x82B1;&#x5349;&#x8868;&#x578B;&#x5F02;&#x5E38;&#x843C;&#x7247;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x6709;&#x4EBA;&#x5728; MPK6AEF &#x884C;&#x3002;MPK6 &#x672C;&#x673A;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x6A21;&#x5F0F;&#x786E;&#x5B9A;&#x4F7F;&#x7528; YFP MPK6 &#x878D;&#x5408;&#x7684;&#x6784;&#x9020;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E14;&#x8868;&#x8FBE;&#x89C2;&#x5BDF;&#x6574;&#x4E2A;&#x5927;&#x591A;&#x6570;&#x690D;&#x7269;&#x7EC4;&#x7EC7;&#xFF0C;&#x7B26;&#x5408; MPK6 &#x5728;&#x591A;&#x4E2A;&#x53D1;&#x5C55;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;YFP MPK6 &#x6784;&#x9020;&#x627E;&#x6765;&#x62EF;&#x6551;&#x751F;&#x80B2;&#x8868;&#x578B;&#x7684; mpk6 &#x7A7A;&#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x6307;&#x793A;&#x878D;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x4FDD;&#x7559;&#x5176;&#x751F;&#x7269;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x8FD8;&#x6307;&#x51FA;&#x690D;&#x7269;&#x8868;&#x8FBE; YFP MPK6 &#x663E;&#x793A;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x9876;&#x7AEF;&#x4F18;&#x52BF;&#x548C;&#x82B1;&#x5E8F;&#x50AC;&#x719F;&#x7684;&#x7F29;&#x77ED;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; YFP &#x6807;&#x8BB0;&#x4FEE;&#x6539;&#x7684; MPK6 &#x4E2D;&#x5F71;&#x54CD;&#x82B1;&#x5E8F;&#x53D1;&#x5C55;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x82B1;&#x836F;&#x53D1;&#x80B2;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x4E24;&#x8005;&#x5408;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x672C;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; MPK6 &#x53C2;&#x4E0E;&#x8C03;&#x63A7;&#x690D;&#x7269;&#x53D1;&#x80B2;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x65B9;&#x9762;&#x3002;

&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x8BC1;&#x636E;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5; MAP &#x6FC0;&#x9176; MPK6 &#x53C2;&#x4E0E;&#x82B1;&#x836F;&#x3001; &#x82B1;&#x5E8F;&#x548C;&#x80DA;&#x80CE;&#x53D1;&#x80B2;&#x3002;

Loss-of-function, dominant-negative, and change-of-function genetic approaches were used to investigate the role played by the Arabidopsis mitogen-activated protein (MAP) kinase MPK6 throughout development. Plants homozygous for T-DNA null alleles of MPK6 displayed reduced male fertility and abnormal anther development. In addition, a portion of the seed produced by mpk6 plants was found to contain embryos that had burst out of their seed coats. To address potential functional redundancy, a dominant-negative version of MPK6 was constructed by changing the TEY activation loop motif to the amino acid sequence AEF. Plants expressing MPK6AEF via the MPK6 native promoter were found to produce excessive stomata, consistent with the recently described role of MPK6 in stomatal patterning. A novel floral phenotype characterized by abnormal sepal development was also observed in MPK6AEF lines. The gene expression pattern of the MPK6 native promoter was determined using a YFP-MPK6 fusion construct, and expression was observed throughout most plant tissues, consistent with a role for MPK6 in multiple developmental processes. The YFP-MPK6 construct was found to rescue the fertility phenotype of mpk6 null alleles, indicating that the fusion protein retains its biological activity. It was also observed, however, that plants expressing YFP-MPK6 displayed reduced apical dominance and a shortening of inflorescence internodes. These results suggest that the YFP tag modifies the activity of MPK6 in a manner that affects inflorescence development but not anther development. Taken together, the present results indicate that MPK6 is involved in the regulation of multiple aspects of plant development.

Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.

Perte de fonction, dominante-n&#xE9;gative, et le changement de fonction des approches g&#xE9;n&#xE9;tiques ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;es pour &#xE9;tudier le r&#xF4;le jou&#xE9; par l&#x26;#39;Arabidopsis mitogen-activated protein (MAP) kinase MPK6 au long du d&#xE9;veloppement. Plantes homozygotes pour les all&#xE8;les nuls d&#x26;#39;ADN-T de la fertilit&#xE9; MPK6 affich&#xE9; masculine r&#xE9;duit et d&#xE9;veloppement de l&#x26;#39;anth&#xE8;re anormale. En outre, une partie de la semence produite par les plantes mpk6 s&#x26;#39;est r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; contenir des embryons qui avaient fait irruption hors de leurs t&#xE9;guments. &#xC0; traiter le potentiel de redondance fonctionnelle, une version n&#xE9;gative dominante d&#x26;#39;MPK6 a &#xE9;t&#xE9; construit en changeant le motif d&#x26;#39;activation TEY boucle &#xE0; la s&#xE9;quence d&#x26;#39;acides amin&#xE9;s AArF. Les plantes exprimant MPK6AEF par le promoteur natif MPK6 ont &#xE9;t&#xE9; trouv&#xE9;s &#xE0; produire stomates excessive, compatible avec le r&#xF4;le r&#xE9;cemment d&#xE9;crit des MPK6 dans la structuration des stomates. Un nouveau ph&#xE9;notype floral caract&#xE9;ris&#xE9; par le d&#xE9;veloppement anormal des s&#xE9;pales a &#xE9;galement &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;e dans les lignes MPK6AEF. Le profil d&#x26;#39;expression g&#xE9;nique du promoteur natif MPK6 a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;termin&#xE9;e en utilisant une construction YFP-MPK6 fusion, et d&#x26;#39;expression a &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;e tout au long de la plupart des tissus v&#xE9;g&#xE9;taux, compatible avec un r&#xF4;le pour MPK6 dans plusieurs processus de d&#xE9;veloppement. La construction YFP-MPK6 a &#xE9;t&#xE9; trouv&#xE9; pour sauver le ph&#xE9;notype de la fertilit&#xE9; mpk6 all&#xE8;les nuls, ce qui indique que la prot&#xE9;ine de fusion conserve son activit&#xE9; biologique. Il a &#xE9;galement &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;e, cependant, que les plantes exprimant YFP-MPK6 affich&#xE9; r&#xE9;duit la dominance apicale et un raccourcissement des entre-n&#x153;uds inflorescence. Ces r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent que la balise YFP modifie l&#x26;#39;activit&#xE9; de MPK6 d&#x26;#39;une mani&#xE8;re qui affecte le d&#xE9;veloppement inflorescence, mais pas le d&#xE9;veloppement des anth&#xE8;res. Pris dans leur ensemble, les r&#xE9;sultats actuels indiquent que MPK6 est impliqu&#xE9;e dans la r&#xE9;gulation des multiples aspects du d&#xE9;veloppement des plantes.

Preuve mutation qui l&#x26;#39;Arabidopsis MAP Kinase MPK6 est impliqu&#xE9; dans Anth&#xE8;re, Inflorescence, et le d&#xE9;veloppement embryonnaire

Verlust der Funktion, Dominant-negativen und der &Auml;nderungsfunktion genetische Ans&auml;tze wurden verwendet, um die Rolle der Arabidopsis Mitogen-aktivierte Protein (MAP) Kinase MPK6 in der gesamten Entwicklung zu untersuchen. Pflanzen homozygot f&uuml;r T-DNA-null-Allele des MPK6 angezeigt reduziert m&auml;nnliche Fruchtbarkeit und abnorme Anthere Entwicklung. Dar&uuml;ber hinaus wurde ein Teil des Samens von mpk6 Pflanzen produziert Embryonen enthalten, die ihre Samen-M&auml;ntel zerbrechen und hatte gefunden. Adresse-Potenzial, die funktionelle Redundanz, eine Dominant-negativen-Version des MPK6 erstellt wurde, durch &Auml;ndern des TEY Aktivierung Schleife Motivs auf die amino-S&auml;ure-Sequenz AEF. Pflanzen zum Ausdruck MPK6AEF &uuml;ber die MPK6 native Projekttr&auml;ger wurden gefunden, um &uuml;berm&auml;&szlig;ige Spalt&ouml;ffnungen, konsistent mit der k&uuml;rzlich beschriebene Rolle der MPK6 in stomatal Musterung zu produzieren. Ein neuartiger floral Ph&auml;notyp zeichnet sich durch abnorme Kelchblatt Entwicklung wurde auch in MPK6AEF Linien beobachtet. Das Muster des Gen-Ausdrucks des Projekttr&auml;gers MPK6 native wurde mit einem YFP-MPK6-Fusion-Konstrukt ermittelt und Ausdruck wurde beobachtet, w&auml;hrend die meisten Pflanzengewebe, mit eine Rolle f&uuml;r MPK6 in mehreren Entwicklungsprozesse. Das YFP-MPK6-Konstrukt wurde festgestellt, dass um die Fruchtbarkeit-Ph&auml;notyp mpk6 null-Allele, darauf hinweist, dass das Schmelzverfahren Protein seine biologischen Aktivit&auml;t beh&auml;lt zu retten. Es wurde jedoch auch beobachtet, dass Pflanzen Ausdr&uuml;cken YFP-MPK6 reduzierten Apical Dominanz und eine Verk&uuml;rzung des Bl&uuml;tenstandes Internodien angezeigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Tag YFP die Aktivit&auml;t von MPK6 in einer Weise &auml;ndert, die Bl&uuml;tenstand Entwicklung aber nicht Anthere Entwicklung beeinflusst. Zusammengenommen deuten die vorliegenden Ergebnisse, dass MPK6 die Verordnung mehrere Aspekte der Pflanzenentwicklung beteiligt ist.

Teilhabende Beweise, dass das Arabidopsis MAP-Kinase MPK6 Anthere, Bl&uuml;tenstand und Embryo Entwicklung beteiligt ist.

Perdita di funzione, dominante-negativo e cambiamento di funzione approcci genetici sono stati utilizzati per indagare il ruolo svolto dalla proteina mitogene-attivata Arabidopsis chinasi (mappa) MPK6 durante lo sviluppo. Piante omozigoti per alleli null T-DNA di MPK6 visualizzato ridotta fertilit&agrave; maschile e sviluppo anormale antera. Inoltre, una parte del seme prodotto da piante di mpk6 &egrave; stata trovata per contenere gli embrioni che avevano scoppiato fuori dal loro cappotti di seme. Potenziale di indirizzo ridondanza funzionale, una versione dominante negativo di MPK6 &egrave; stato costruito modificando il motivo del ciclo di attivazione TEY alla sequenza amino acida AEF. Piante che esprimono MPK6AEF tramite il promotore nativo di MPK6 sono stati trovati per produrre eccessiva stomi, coerenti con il recentemente descritto ruolo di MPK6 nel patterning stomatica. Un romanzo fenotipo floreale caratterizzato da sepalo anormale sviluppo inoltre &egrave; stato osservato nelle linee di MPK6AEF. Il modello di espressione del gene del promotore nativo MPK6 &egrave; stato determinato utilizzando un costrutto di fusione YFP-MPK6, ed espressione &egrave; stata osservata in tutta la maggior parte dei tessuti vegetali, coerenti con un ruolo per MPK6 in molteplici processi di sviluppo. Il costrutto di YFP-MPK6 &egrave; stato trovato a salvare il fenotipo di fertilit&agrave; di mpk6 alleli null, che indica che la proteina di fusione mantiene la sua attivit&agrave; biologica. &Egrave; stato anche osservato, tuttavia, che piante esprimendo YFP-MPK6 visualizzato ridotta Dominanza apicale e un accorciamento di internodi infiorescenza. Questi risultati suggeriscono che l&#39;etichetta YFP modifica l&#39;attivit&agrave; di MPK6 in un modo che colpisce lo sviluppo infiorescenza, ma non lo sviluppo antera. Presi insieme, i risultati attuali indicano che MPK6 &egrave; coinvolto nella regolazione di molteplici aspetti dello sviluppo della pianta.

Mutational prove che la chinasi di Arabidopsis mappa MPK6 &egrave; coinvolto nello sviluppo antera, infiorescenza ed embrione.

&#x6A5F;&#x80FD;&#x55AA;&#x5931;&#x3001;&#x30C9;&#x30DF;&#x30CA;&#x30F3;&#x30C8;&#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5909;&#x66F4;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x958B;&#x767A;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x30DE;&#x30A4;&#x30C8;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;MAP&#xFF09;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;MPK6&#x304C;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x305F;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002; MPK6&#x306E;T-DNA&#x30CC;&#x30EB;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30DB;&#x30E2;&#x63A5;&#x5408;&#x6027;&#x306E;&#x690D;&#x7269;&#x304C;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x3001;&#x7537;&#x6027;&#x4E0D;&#x598A;&#x3068;&#x7570;&#x5E38;&#x846F;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x304C;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;MPK6&#x690D;&#x7269;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7A2E;&#x5B50;&#x306E;&#x4E00;&#x90E8;&#x306F;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306E;&#x7A2E;&#x76AE;&#x304B;&#x3089;&#x98DB;&#x3073;&#x51FA;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x80DA;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x5197;&#x9577;&#x6027;&#x306B;&#x5BFE;&#x51E6;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;MPK6&#x306E;&#x30C9;&#x30DF;&#x30CA;&#x30F3;&#x30C8;&#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x914D;&#x5217;&#x306E;AEF&#x306B;TEY&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3092;&#x5909;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3057;&#x305F;&#x3002; MPK6&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;MPK6AEF&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x690D;&#x7269;&#x306F;&#x3001;&#x6C17;&#x5B54;&#x306E;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x5F62;&#x6210;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;MPK6&#x306E;&#x6700;&#x8FD1;&#x8A18;&#x8F09;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5F79;&#x5272;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3001;&#x904E;&#x5EA6;&#x306E;&#x6C17;&#x5B54;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x7570;&#x5E38;&#x306A;&#x843C;&#x7247;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x82B1;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x3082;MPK6AEF&#x7DDA;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x767A;&#x9054;&#x904E;&#x7A0B;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;MPK6&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3001;MPK6&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;YFP-MPK6&#x878D;&#x5408;&#x69CB;&#x7BC9;&#x7269;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x5F0F;&#x306F;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x690D;&#x7269;&#x7D44;&#x7E54;&#x5168;&#x4F53;&#x306B;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002; YFP-MPK6&#x69CB;&#x7BC9;&#x7269;&#x306F;&#x3001;&#x878D;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x304C;&#x305D;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3001;MPK6&#x30CC;&#x30EB;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x4E0D;&#x598A;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x3092;&#x6551;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x767A;&#x898B;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;YFP-MPK6&#x8868;&#x793A;&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x690D;&#x7269;&#x306F;&#x9802;&#x82BD;&#x512A;&#x52E2;&#x3068;&#x82B1;&#x5E8F;&#x4F38;&#x9577;&#x306E;&#x77ED;&#x7E2E;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3001;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;YFP&#x30BF;&#x30B0;&#x306F;&#x82B1;&#x5E8F;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x846F;&#x306E;&#x767A;&#x9054;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;MPK6&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x4FEE;&#x98FE;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;MPK6&#x306F;&#x690D;&#x7269;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x5074;&#x9762;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x5909;&#x7570;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;MAP&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;MPK6&#x306F;&#x846F;&#x3001;&#x82B1;&#x5E8F;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x8A3C;&#x62E0;&#x3068;&#x3001;&#x80DA;&#x767A;&#x751F;

&#xAE30;&#xB2A5; &#xC190;&#xC2E4;, &#xC9C0;&#xBC30; &#xC74C;&#xC218; &#xBC0F; &#xBCC0;&#xACBD; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC811;&#xADFC; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; Arabidopsis &#xBB3C;&#xC9C8; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&#xC9C0;&#xB3C4;) &#xB2C8; mpk6&#xAC00; &#xC5F0;&#xAE30;&#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC2DD;&#xBB3C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; mpk6&#xC758; T-DNA null &#xB300;&#xB9BD; homozygous &#xB0A8;&#xC131; &#xBD88; &#xC784; &#xBC0F; &#xBE44;&#xC815;&#xC0C1;&#xC801;&#xC778; &#xAF43; &#xBC25; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xAC10;&#xC18C;. &#xB610;&#xD55C;, mpk6 &#xC2DD;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD558;&#xB294; &#xC528;&#xC557;&#xC758; &#xC77C;&#xBD80; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC528;&#xC557; &#xCF54;&#xD2B8; &#xBC16;&#xC73C;&#xB85C; &#xD30C;&#xC5F4; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC30;&#xC544;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. &#xC8FC;&#xC18C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC911;&#xBCF5;, mpk6&#xC758; &#xC9C0;&#xBC30;&#xC801;&#xC778; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xBC84;&#xC804; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178; &#xC0B0; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; AEF TEY &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB8E8;&#xD504; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC74;&#xC124; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. MPK6 &#xAE30;&#xBCF8; &#xBAA8;&#xD130;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; mpk6aef&#xC744; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xACFC;&#xB3C4; &#xD55C; stomata, stomatal &#xD328;&#xD134;&#xD654;&#xC5D0; mpk6&#xC758; &#xCD5C;&#xADFC; &#xC124;&#xBA85;&#xB41C; &#xC5ED;&#xD560; &#xC77C;&#xCE58; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBE44;&#xC815;&#xC0C1;&#xC801;&#xC778; sepal &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xC18C;&#xC124; &#xAF43; &#xD615;&#xB3C4; MPK6AEF &#xB77C;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. MPK6 &#xAE30;&#xBCF8; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;&#xC758; &#xC9C4; &#xC2DD; &#xD328;&#xD134; YFP MPK6 &#xD4E8;&#xC804; &#xAD6C;&#xBB38;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xACB0;&#xC815; &#xD558; &#xACE0; &#xC2DD; &#xC77C;&#xAD00;&#xC131; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; mpk6&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xAD00;&#xCC30; &#xD588;&#xB2E4;. YFP MPK6 &#xAD6C;&#xBB38; mpk6 null &#xB300;&#xB9BD;, &#xC735;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xD65C;&#xB3D9; &#xC720;&#xC9C0;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294;&#xC758; &#xB2E4; &#xC0B0; &#xD615; &#xAD6C;&#xC870; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xB610;&#xD55C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;,, &#xC2DD;&#xBB3C; YFP MPK6 &#xD45C;&#xD604; &#xAC10;&#xC18C; apical &#xC9C0;&#xBC30;&#xC640; &#xAF43;&#xC774; &#xD54C; internodes&#xC758; &#xB2E8;&#xCD95; &#xD45C;&#xC2DC;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; YFP &#xD0DC;&#xADF8; &#xC218;&#xC815; &#xAF43;&#xC774; &#xD54C; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xB9CC; &#xD558;&#xC9C0; &#xAF43; &#xBC25; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xB294; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; mpk6&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD568;&#xAED8; &#xCC0D;&#xC740;, &#xD604;&#xC7AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; MPK6 &#xC2DD;&#xBB3C; &#xBC1C;&#xB2EC;&#xC758; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xCE21;&#xBA74;&#xC758; &#xADDC;&#xC81C; &#xAD00;&#xB828; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Mutational &#xC99D;&#xAC70; Arabidopsis &#xC9C0;&#xB3C4; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; MPK6 &#xAF43; &#xBC25;, &#xAF43;&#xC774; &#xD54C;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xBC30;&#xC544; &#xBC1C;&#xB2EC;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

La p&#xE9;rdida de la funci&#xF3;n, dominante-negativa, y el cambio de la funci&#xF3;n de los enfoques gen&#xE9;ticos han sido utilizados para investigar el papel desempe&#xF1;ado por la Arabidopsis activadas por mit&#xF3;genos (MAP) quinasa MPK6 lo largo del desarrollo. Las plantas homocigotos para alelos nulos de T-ADN de MPK6 muestran reducci&#xF3;n de la fertilidad masculina y desarrollo de la antera anormal. Adem&#xE1;s, una porci&#xF3;n de la semilla producida por mpk6 plantas se encontr&#xF3; que conten&#xED;a embriones que hab&#xED;an salido de sus capas de semillas. Para hacer frente a la redundancia funcional potencial, una versi&#xF3;n dominante negativo de MPK6 se construy&#xF3; cambiando el motivo de activaci&#xF3;n bucle TEY a la AEF secuencia de amino&#xE1;cidos. Las plantas que expresan a trav&#xE9;s de la promotora MPK6AEF MPK6 nativa se encontr&#xF3; que producen exceso de estomas, en consonancia con el papel de la recientemente descrita MPK6 en los patrones de los estomas. Un nuevo fenotipo floral caracterizado por el desarrollo anormal de los s&#xE9;palos tambi&#xE9;n se observ&#xF3; en l&#xED;neas MPK6AEF. El patr&#xF3;n de expresi&#xF3;n g&#xE9;nica del promotor MPK6 nativa se determin&#xF3; usando un YFP-MPK6 construcci&#xF3;n de la fusi&#xF3;n, y la expresi&#xF3;n se observ&#xF3; a lo largo de la mayor&#xED;a de los tejidos de las plantas, en consonancia con el papel de MPK6 en m&#xFA;ltiples procesos de desarrollo. El constructo YFP-MPK6 se encontr&#xF3; para rescatar el fenotipo de la fertilidad mpk6 alelos nulos, lo que indica que la prote&#xED;na de fusi&#xF3;n retiene su actividad biol&#xF3;gica. Tambi&#xE9;n se observ&#xF3;, sin embargo, que las plantas que expresan YFP-MPK6 muestra reduce la dominancia apical y un acortamiento de los entrenudos inflorescencia. Estos resultados sugieren que la etiqueta YFP modifica la actividad de MPK6 de una manera que afecta al desarrollo inflorescencia pero no el desarrollo antera. En conjunto, los resultados indican que MPK6 est&#xE1; implicado en la regulaci&#xF3;n de los m&#xFA;ltiples aspectos de desarrollo de la planta.

La evidencia de mutaci&#xF3;n que la Arabidopsis MAP quinasa MPK6 est&#xE1; involucrado en la antera, inflorescencia, y el desarrollo embrionario

&#x9676;&#x74F7;&#x7816;&#x7C98;&#x7ED3;&#x5242; &#xFF08;&#x7528;&#x4E8E;&#x57FA;&#x56E0;&#x9776;&#x5411;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x5C40;&#x90E8;&#x75C5;&#x53D8;&#x4E2D;&#x7EC4;) &#x662F;&#x7528;&#x4E8E;&#x6807;&#x8BC6;&#x6267;&#x884C;&#x4E2D;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x690D;&#x7269;&#x65E2;&#x5B9A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x4F20;&#x7EDF;&#x7684;&#x9676;&#x74F7;&#x7816;&#x7C98;&#x7ED3;&#x5242;&#x9879;&#x76EE;&#x9700;&#x8981;&#x6295;&#x5165;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x548C;&#x8D44;&#x6E90;&#x6765;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4EBA;&#x53E3;&#x548C;&#x7B5B;&#x9009;&#x7684;&#x57FA;&#x7840;&#x8BBE;&#x65BD;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E86;&#x4FEE;&#x6539;&#x540E;&#x7684;&#x9676;&#x74F7;&#x7816;&#x7C98;&#x7ED3;&#x5242;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x5927;&#x5927;&#x964D;&#x4F4E;&#x4E86;&#x6267;&#x884C;&#x7A81;&#x53D8;&#x7B5B;&#x67E5;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x6295;&#x8D44;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x5C55; iTILLING &#x7684;&#x52A8;&#x673A;&#x662F;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x5176;&#x5B9E;&#x9645;&#x7684;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x6765;&#x8FC5;&#x901F;&#x6267;&#x884C;&#x7A81;&#x53D8;&#x5C4F;&#x5E55;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E13;&#x95E8;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x80CC;&#x666F;&#x3002;&#x4E0E; iTILLING&#xFF0C;mutagenized &#x4EBA;&#x53E3;&#x7684;&#x690D;&#x7269;&#xFF0C;&#x5927;&#x5927;&#x964D;&#x4F4E;&#x4E86;&#x7BA1;&#x7406;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x884C;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x52B3;&#x52A8;&#x529B;&#x4ECE;&#x6536;&#x96C6;&#x6563;&#x88C5; M2 &#x79CD;&#x5B50;&#x3002;&#x6240;&#x6709;&#x6267;&#x884C; 96 &#x4E95;&#x683C;&#x5F0F;&#x4E3A;&#x8BF1;&#x53D8;&#x9009;&#x80B2;&#x3001; &#x7EC4;&#x7EC7;&#x6536;&#x96C6;&#x548C;&#x63D0;&#x53D6; DNA M2 &#x5E7C;&#x82D7;&#x751F;&#x957F;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x662F;&#x7136;&#x540E;&#x786E;&#x5B9A;&#x4F7F;&#x7528;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7194;&#x70B9;&#x66F2;&#x7EBF;&#x5206;&#x6790;&#x7279;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x4EA7;&#x7269;&#x3002;&#x4E2A;&#x522B;&#x690D;&#x7269;&#x643A;&#x5E26;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x5174;&#x8DA3;&#x4ECE; 96 &#x4E95;&#x751F;&#x957F;&#x677F;&#x8F6C;&#x5230;&#x571F;&#x58E4;&#x3002;&#x4E00;&#x4F4D;&#x79D1;&#x5B66;&#x5BB6;&#x5728;&#x4E0D;&#x5C11;&#x4E8E; 4 &#x4E2A;&#x6708;&#x5373;&#x53EF;&#x5B8C;&#x6210; iTILLING &#x5C4F;&#x5E55;&#x3002;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x8BC1;&#x660E;&#x7684;&#x539F;&#x5219;&#x6D4B;&#x8BD5;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x8FD0;&#x7528; (&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;) &#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x690D;&#x7269;&#x5408;&#x5B50; mekk1-1 &#xFF08;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x6FC0;&#x9176; 1 MAPK/ERK) &#x7A81;&#x53D8;&#x5E76;&#x8FD8;&#x8FDB;&#x884C; MEKK1 &#x6551;&#x63F4;&#x6784;&#x9020; iTILLING&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x662F;&#x5C4F;&#x5E55;&#x7684;&#x786E;&#x5B9A;&#x5728;&#x5BC6;&#x5207;&#x76F8;&#x5173;&#x7684; MEKK2 &#x548C; MEKK3 &#x57FA;&#x56E0;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x83B7;&#x5F97;&#x4E86;&#x4E94;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684; MEKK2 &#x548C; MEKK3&#xFF0C;&#x6240;&#x6709;&#x4F4D;&#x4E8E;&#x5185; 20 kb mekk1 1 T DNA &#x63D2;&#x5165;&#x7684;&#x4E03;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x91CD;&#x590D;&#x7684;&#x8FED;&#x4EE3;&#x7684; iTILLING &#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x751F;&#x6210;&#x4E09;&#x4E2A;&#x6216;&#x591A;&#x4E2A;&#x4E32;&#x8054;&#x91CD;&#x590D;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;

iTILLING&#xFF1A; &#x5728;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x4E2D;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x7A81;&#x53D8;&#x91C7;&#x53D6;&#x4E2A;&#x6027;&#x5316;&#x7684;&#x505A;&#x6CD5;&#x3002;

TILLING (for Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) is a well-established method for identifying plants carrying point mutations in genes of interest. A traditional TILLING project requires a significant investment of time and resources to establish the mutant population and screening infrastructure. Here, we describe a modified TILLING procedure that substantially reduces the investment needed to perform mutation screening. Our motivation for developing iTILLING was to make it practical for individual laboratories to rapidly perform mutation screens using specialized genetic backgrounds. With iTILLING, M2 seeds are collected in bulk from the mutagenized population of plants, greatly reducing the labor needed to manage the mutant lines. Growth of the M2 seedlings for mutation screening, tissue collection, and DNA extraction are all performed in 96-well format. Mutations are then identified using high-resolution melt-curve analysis of gene-specific polymerase chain reaction products. Individual plants carrying mutations of interest are transferred from the 96-well growth plates to soil. One scientist can complete an iTILLING screen in less than 4 months. As a proof-of-principle test, we applied iTILLING to Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) plants that were homozygous for the mekk1-1 (for MAPK/ERK kinase kinase 1) mutation and also carried a MEKK1 rescue construct. The goal of our screen was to identify mutations in the closely linked MEKK2 and MEKK3 loci. We obtained five mutations in MEKK2 and seven mutations in MEKK3, all located within 20 kb of the mekk1-1 T-DNA insertion. Using repeated iterations of the iTILLING process, mutations in three or more tandemly duplicated genes could be generated.

iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.

TILLING (pour le ciblage des l&#xE9;sions induites par locaux Dans les g&#xE9;nomes) est une m&#xE9;thode bien &#xE9;tablie pour identifier les plantes porteuses de mutations ponctuelles dans les g&#xE8;nes d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t. Un projet de TILLING traditionnelle n&#xE9;cessite un investissement important de temps et de ressources pour &#xE9;tablir la population mutante et des infrastructures de d&#xE9;pistage. Ici, nous d&#xE9;crivons une proc&#xE9;dure TILLING modifi&#xE9;e qui r&#xE9;duit consid&#xE9;rablement l&#x26;#39;investissement n&#xE9;cessaire pour r&#xE9;aliser un d&#xE9;pistage de mutation. Notre motivation pour d&#xE9;velopper iTILLING &#xE9;tait de rendre pratique pour les laboratoires individuels &#xE0; effectuer rapidement des &#xE9;crans de mutation &#xE0; l&#x26;#39;aide sp&#xE9;cialis&#xE9;s origines g&#xE9;n&#xE9;tiques. Avec iTILLING, graines M2 sont collect&#xE9;es en vrac de la population mutag&#xE9;nis&#xE9; de plantes, r&#xE9;duisant consid&#xE9;rablement le travail n&#xE9;cessaire pour g&#xE9;rer les lign&#xE9;es mutantes. La croissance des plants M2 pour le d&#xE9;pistage de mutation, la collecte de tissus, et l&#x26;#39;extraction d&#x26;#39;ADN sont tous r&#xE9;alis&#xE9;s en format 96 puits. Les mutations sont ensuite identifi&#xE9;es &#xE0; l&#x26;#39;aide de haute r&#xE9;solution &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;tat fondu courbe d&#x26;#39;analyse de produits sp&#xE9;cifiques du g&#xE8;ne polym&#xE9;rase Chain Reaction. Les plantes individuelles porteuses de mutations d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t sont transf&#xE9;r&#xE9;s &#xE0; partir des plaques de croissance de 96 puits dans le sol. Un scientifique peut compl&#xE9;ter un &#xE9;cran iTILLING en moins de 4 mois. Comme un test de validation de principe, nous avons appliqu&#xE9; &#xE0; iTILLING (Arabidopsis thaliana) Arabidopsis plantes qui &#xE9;taient homozygotes pour la MEKK1-1 (pour MAPK / ERK kinase kinase 1) mutation et &#xE9;galement r&#xE9;alis&#xE9; une op&#xE9;ration de sauvetage MEKK1 construire. Le but de notre &#xE9;cran &#xE9;tait d&#x26;#39;identifier des mutations dans les MEKK2 et MEKK3 &#xE9;troitement li&#xE9;s loci. Nous avons obtenu cinq mutations dans MEKK2 et sept mutations dans MEKK3, tous situ&#xE9;s dans les 20 ko de l&#x26;#39;insertion MEKK1-1 ADN-T. Utilisation de multiples it&#xE9;rations du processus iTILLING, des mutations dans trois g&#xE8;nes ou plus en tandem double pourrait &#xEA;tre g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;e.

ITILLING: une approche personnalis&#xE9;e pour l&#x26;#39;identification des mutations induites chez Arabidopsis

TILLING (f&uuml;r Targeting Induced Local L&auml;sionen IN Genomen) ist eine allgemein anerkannte Methode zur Identifizierung von Pflanzen, die mit Punkt-Mutationen in Genen von Interesse. Ein traditionelles TILLING-Projekt erfordert eine bedeutende Investition von Zeit und Ressourcen zur Etablierung mutant Bev&ouml;lkerung und Screening-Infrastruktur. Hier beschreiben wir eine modifizierte TILLING-Prozedur, die die Mutation Screening durchf&uuml;hren erforderlichen Investitionen erheblich reduziert. Unsere Motivation f&uuml;r die Entwicklung von iTILLING wurde um es praktisch f&uuml;r einzelne Laboratorien Mutation Bildschirme verwenden spezielle genetische Hintergr&uuml;nde schnell durchf&uuml;hren. Mit iTILLING sind mutagenized Bev&ouml;lkerung der Pflanzen stark reduziert die Arbeit ben&ouml;tigt, um die Mutanten Linien M2 Samen in gro&szlig;en Mengen gesammelt. Wachstum der S&auml;mlinge M2 f&uuml;r Mutation Screening, Gewebe-Auflistung und DNA-Extraktion werden in 96-Well-Format ausgef&uuml;hrt. Die Mutationen sind dann mit hochaufl&ouml;senden Schmelze-Kurvenanalyse Gen-spezifischen Polymerase-Kettenreaktion-Produkte. Einzelpflanzen mit Mutationen des Interesses werden von den Wachstum 96-Well-Platten zum Boden &uuml;bertragen. Ein Wissenschaftler kann einen iTILLING-Bildschirm in weniger als 4 Monaten abgeschlossen werden. Als Beweis-des-Prinzip Test wir iTILLING auf Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana) Pflanzen, die homozygot f&uuml;r die Mutation mekk1-1 (f&uuml;r MAPK/ERK-Kinase-Kinase 1) wurden und auch ein MEKK1-Rettung-Konstrukt angewendet. Das Ziel von unserem Bildschirm war Mutationen in der eng verbundenen MEKK2 und MEKK3 Loci identifiziert. Wir erhielten f&uuml;nf Mutationen im MEKK2 und sieben Mutationen im MEKK3, alle gelegen innerhalb der mekk1-1 T-DNA Einf&uuml;gung 20 kb. Mit wiederholte Iterationen des iTILLING Prozesses, konnten Mutationen in drei oder mehr tandemly duplizierten Genen generiert werden.

iTILLING: eine personalisierte Ansatz zur Identifizierung der induzierten Mutationen in Arabidopsis.

TILLING (per Targeting Induced Local lesioni IN genomi) &egrave; un metodo consolidato per l&#39;identificazione di piante che trasportano le mutazioni puntiformi nei geni di interesse. Un progetto TILLING tradizionale richiede un notevole investimento di tempo e risorse per stabilire la popolazione mutante e infrastruttura di screening. Qui, descriviamo una procedura TILLING modificata che riduce notevolmente gli investimenti necessari per eseguire lo screening della mutazione. La nostra motivazione per lo sviluppo di iTILLING era di rendere pratico per singoli laboratori eseguire rapidamente schermi mutazione utilizzando specializzati background genetico. Con iTILLING, M2 semi sono raccolti in massa della popolazione mutagenized delle piante, riducendo notevolmente il lavoro necessario per gestire le linee mutanti. Crescita dei semenzali M2 per lo screening della mutazione, tessuto insieme ed estrazione del DNA sono tutte eseguite in formato a 96 pozzetti. Vengono quindi identificate mutazioni utilizzando l&#39;analisi della curva di fusione ad alta risoluzione dei prodotti di reazione a catena della polimerasi di gene-specific. Singole piante portatrici di mutazioni di interesse vengono trasferiti dalle piastre a 96 pozzetti crescita al suolo. Uno scienziato pu&ograve; completare uno schermo iTILLING in meno di 4 mesi. Come un test di prova di principio, abbiamo applicato iTILLING piante di Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) che erano omozigoti per la mutazione mekk1-1 (per la chinasi della chinasi MAPK/ERK 1) e inoltre ha trasportato un costrutto di salvataggio MEKK1. L&#39;obiettivo del nostro schermo era di identificare mutazioni in loci MEKK2 e MEKK3 strettamente collegati. Abbiamo ottenuto cinque mutazioni in MEKK2 e sette mutazioni in MEKK3, tutti situati all&#39;interno di 20 kb di inserimento mekk1-1 T-DNA. Utilizzando ripetute iterazioni del processo iTILLING, mutazioni nei geni tandemly ripetuti tre o pi&ugrave; potrebbero essere generate.

iTILLING: un approccio personalizzato per l&#39;identificazione di mutazioni indotte in Arabidopsis.

&#x8015;&#x8D77;&#x306F;&#x3001;&#xFF08;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x8A98;&#x5C0E;&#x5C40;&#x90E8;&#x75C5;&#x6591;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#xFF09;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306B;&#x70B9;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x904B;&#x3076;&#x690D;&#x7269;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5341;&#x5206;&#x306B;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x4F1D;&#x7D71;&#x7684;&#x306A;&#x8015;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B8;&#x30A7;&#x30AF;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x96C6;&#x56E3;&#x3068;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C1;&#x30E3;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6642;&#x9593;&#x3068;&#x30EA;&#x30BD;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x5927;&#x5E45;&#x306A;&#x6295;&#x8CC7;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x6295;&#x8CC7;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x8015;&#x624B;&#x9806;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; iTILLING&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x52D5;&#x6A5F;&#x306F;&#x3001;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x5C02;&#x9580;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x80CC;&#x666F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x753B;&#x9762;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x5B9F;&#x7528;&#x7684;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002; iTILLING&#x3067;&#x3001;M2&#x7A2E;&#x5B50;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x7CFB;&#x7D71;&#x3092;&#x7BA1;&#x7406;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x52B4;&#x50CD;&#x529B;&#x3092;&#x524A;&#x6E1B;&#x3057;&#x3001;&#x690D;&#x7269;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x96C6;&#x56E3;&#x304B;&#x3089;&#x5927;&#x91CF;&#x306B;&#x53CE;&#x96C6;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5909;&#x7570;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x7D44;&#x7E54;&#x53CE;&#x96C6;&#x3001;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;M2&#x82D7;&#x306E;&#x6210;&#x9577;&#x306F;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;96&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067;&#x5B9F;&#x884C;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x9023;&#x9396;&#x53CD;&#x5FDC;&#x751F;&#x6210;&#x7269;&#x306E;&#x9AD8;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x878D;&#x89E3;&#x66F2;&#x7DDA;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8208;&#x5473;&#x306E;&#x3042;&#x308B;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x690D;&#x7269;&#x304C;&#x571F;&#x58CC;&#x306B;96&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x6210;&#x9577;&#x677F;&#x304B;&#x3089;&#x8EE2;&#x9001;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x79D1;&#x5B66;&#x8005;&#x306F;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;4&#x30F6;&#x6708;&#x3067;iTILLING&#x753B;&#x9762;&#x3092;&#x5B8C;&#x4E86;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8A3C;&#x660E;&#x306E;&#x539F;&#x7406;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;MEKK1-1&#xFF08;MAPK / ERK&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;1&#xFF09;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x304C;&#x30DB;&#x30E2;&#x63A5;&#x5408;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3068;&#x3082;MEKK1&#x6551;&#x52A9;&#x30B3;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#xFF08;Arabidopsis thaliana&#xFF09;&#x690D;&#x7269;&#x306B;iTILLING&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x753B;&#x9762;&#x306E;&#x76EE;&#x6A19;&#x306F;&#x5BC6;&#x63A5;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;MEKK2&#x3068;MEKK3&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;MEKK1-1 T-DNA&#x633F;&#x5165;&#x306E;20&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#x306B;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3057;&#x3001;MEKK3&#x3067;MEKK2&#x3068;7&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;5&#x3064;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x5F97;&#x305F;&#x3002; iTILLING&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x7E70;&#x308A;&#x8FD4;&#x3057;&#x306E;&#x53CD;&#x5FA9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;3&#x3064;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30C7;&#x30E0;&#x91CD;&#x8907;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

ITILLING&#xFF1A;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x8A98;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;&#x306B;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BD;&#x30CA;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;

TILLING (&#xD0C0;&#xAC9F;&#xD305; &#xC720;&#xBC1C; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xBCD1; &#xBCC0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC8C;&#xB188;)&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xC810; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC6B4;&#xBC18; &#xD558;&#xB294; &#xC2DD;&#xBB3C;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xAE30;&#xCD08;&#xAC00; &#xD2BC;&#xD2BC;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC778; TILLING &#xD504;&#xB85C;&#xC81D;&#xD2B8; &#xC2DC;&#xAC04;&#xACFC; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC778;&#xAD6C;&#xC640; &#xAC80;&#xC5F4; &#xC778;&#xD504;&#xB77C;&#xB97C; &#xAD6C;&#xCD95; &#xD558;&#xB294; &#xC790;&#xC6D0;&#xC758; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xD22C;&#xC790;&#xB97C; &#xC694;&#xAD6C; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC2E4;&#xC9C8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC80;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xD22C;&#xC790;&#xB97C; &#xC904;&#xC5EC; &#xC218;&#xC815;&#xB41C; TILLING &#xD504;&#xB85C;&#xC2DC;&#xC800;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Itilling&#xB97C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB3D9;&#xAE30; &#xBE60;&#xB974;&#xAC8C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC2A4;&#xD06C;&#xB9B0; &#xC804;&#xBB38;&#xB41C; &#xC720;&#xC804;&#xC801; &#xBC30;&#xACBD;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2E4;&#xC6A9;&#xC801; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xD588;&#xB2E4;. ITILLING&#xC640; M2 &#xC528;&#xC557; &#xC2DD;&#xBB3C;&#xC758; mutagenized &#xC778;&#xAD6C; &#xD06C;&#xAC8C; &#xAC10;&#xC18C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB77C;&#xC778;&#xC744; &#xAD00;&#xB9AC; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xB178;&#xB3D9;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xB7C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218;&#xC9D1; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC80;&#xC0AC;, &#xC870;&#xC9C1; &#xCEEC;&#xB809;&#xC158; &#xBC0F; DNA &#xCD94;&#xCD9C; M2 &#xBB18; &#xBAA9;&#xC758; &#xC131;&#xC7A5; &#xBAA8;&#xB450; 96-&#xC798; &#xD615;&#xC2DD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xD589; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAD00;&#xB828; &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC5F0;&#xC1C4; &#xBC18;&#xC751; &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC6A9;&#xC735; &#xACE1;&#xC120; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xB2E4;&#xC74C;. &#xAD00;&#xC2EC;&#xC758; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB4E4;&#xACE0; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xD1A0;&#xC591; 96-&#xC798; &#xC131;&#xC7A5; &#xD310;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC804;&#xC1A1; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD55C; &#xACFC;&#xD559;&#xC790;&#xAC00; 4 &#xAC1C;&#xC6D4; &#xBBF8;&#xB9CC;&#xC5D0; iTILLING &#xD654;&#xBA74;&#xC744; &#xC644;&#xB8CC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6D0;&#xB9AC; &#xC99D;&#xBA85; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB85C; &#xC6B0;&#xB9AC; homozygous mekk1-1 (MAPK/ERK &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; 1)&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB300; &#xD55C; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xB610;&#xD55C; &#xC2E4;&#xC2DC; MEKK1 &#xAD6C;&#xC870; &#xAD6C;&#xBB38; Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) &#xC2DD;&#xBB3C;&#xC5D0; iTILLING &#xC801;&#xC6A9;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC2A4;&#xD06C;&#xB9B0;&#xC758; &#xBAA9;&#xD45C;&#xB294; &#xBC00;&#xC811; &#xD558; &#xAC8C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; MEKK2 &#xBC0F; MEKK3 loci&#xC758; &#xBCC0;&#xC774; &#xD655;&#xC778; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; mekk2&#xC5D0;&#xC11C; 5 &#xAC1C;&#xC758; &#xBCC0;&#xC774; MEKK3, mekk1-1 T DNA &#xC0BD;&#xC785;&#xC758; 20 kb &#xB0B4; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC704;&#xCE58;&#xC5D0;&#xC11C; 7 &#xAC1C;&#xC758; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCDE8;&#xB4DD;. ITILLING &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xBC18;&#xBCF5;&#xB41C; &#xBC18;&#xBCF5;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC138; &#xAC1C; &#xC774;&#xC0C1;&#xC758; tandemly &#xBCF5;&#xC81C; &#xB41C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC0DD;&#xC131; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

iTILLING: Arabidopsis &#xC720;&#xBC1C;&#xB41C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xC5D0; &#xB9DE;&#xCDA4;&#xD615;&#xB41C; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;.

TILLING (de orientaci&#xF3;n inducida lesiones locales en los genomas) es un m&#xE9;todo bien establecido para la identificaci&#xF3;n de las plantas portadoras de mutaciones puntuales en los genes de inter&#xE9;s. Un proyecto TILLING tradicional requiere una importante inversi&#xF3;n de tiempo y recursos para establecer la poblaci&#xF3;n mutante y la infraestructura de detecci&#xF3;n. A continuaci&#xF3;n, describimos un procedimiento TILLING modificado que reduce sustancialmente la inversi&#xF3;n necesaria para llevar a cabo la detecci&#xF3;n de mutaciones. Nuestra motivaci&#xF3;n para el desarrollo de iTILLING era para que sea pr&#xE1;ctico para los laboratorios individuales para llevar a cabo con rapidez pantallas sobre mutaciones especializados antecedentes gen&#xE9;ticos. Con iTILLING, semillas M2 se recogen en la mayor parte de la poblaci&#xF3;n mutagenizada de las plantas, reduciendo el trabajo necesario para gestionar las l&#xED;neas mutantes. El crecimiento de las plantas M2 para la detecci&#xF3;n de mutaciones, la recogida de tejidos, y la extracci&#xF3;n de ADN son todas realizadas en formato de 96 pocillos. Las mutaciones se identificaron utilizando entonces de alta resoluci&#xF3;n en fusi&#xF3;n curva de an&#xE1;lisis de genes espec&#xED;ficos de los productos de reacci&#xF3;n en cadena de polimerasa. Las plantas individuales que llevan mutaciones de inter&#xE9;s son transferidos desde las placas de crecimiento 96-y al suelo. Un cient&#xED;fico puede completar una pantalla de iTILLING en menos de 4 meses. Como prueba de la prueba de principio, se aplic&#xF3; a iTILLING (Arabidopsis thaliana) de Arabidopsis plantas que eran homocigotos para la MEKK1-1 (para MAPK / ERK quinasa quinasa 1) la mutaci&#xF3;n y tambi&#xE9;n llev&#xF3; a la construcci&#xF3;n de un rescate MEKK1. El objetivo de nuestra pantalla fue identificar las mutaciones en los estrechamente vinculados MEKK2 y MEKK3 loci. Se obtuvieron cinco mutaciones en MEKK2 y siete mutaciones en MEKK3, todos ellos situados dentro de los 20 kb de la inserci&#xF3;n MEKK1-1 T-ADN. Utilizando m&#xFA;ltiples iteraciones del proceso iTILLING, las mutaciones en tres o m&#xE1;s genes en t&#xE1;ndem duplicados se podr&#xED;a generar.

Susan M. Bush

Horticulture Department

University of Wisconsin-Madison

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Susan M. Bush

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Horticulture Department

University of Wisconsin-Madison

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Horticulture Department