<em>In-vivo</em> Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Johannes Kepler Universitat Linz

&#x83B7;&#x53D6;&#x5927;&#x4E8E;&#x6574;&#x4E2A;&#x65B9;&#x5F0F;&#x5176;&#x5404;&#x4E2A;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x603B;&#x548C;&#x3002;

How the sum of its parts gets greater than the whole.

Comment la somme de ses parties Obtient sup&#xE9;rieure &#xE0; la totalit&#xE9;

Wie bekommt die Summe seiner Teile gr&ouml;&szlig;er als das ganze.

Come la somma delle sue parti ottiene maggiore di tutto.

&#x305D;&#x306E;&#x90E8;&#x5206;&#x306E;&#x7DCF;&#x548C;&#x306F;&#x5168;&#x4F53;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x53D6;&#x5F97;&#x65B9;&#x6CD5;

&#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; &#xADF8; &#xBD80;&#xD488;&#xC758; &#xD569;&#xC774; &#xC804;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD070; &#xAC00;&#xC838;&#xC635;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBF;C&#xF3;mo la suma de sus partes Obtiene mayor que el todo

&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x51FA;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x786E;&#x5B9A;&#x548C;&#x8FA8;&#x522B;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; (&#39;&#x730E;&#x7269;&#39;) &#x548C;&#x6D3B;&#x7684;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; (&#x8BF1;&#x9975;&#xFF09; &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x662F; micropatterned &#x8868;&#x9762;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x8BF1;&#x9975;&#x80DE;&#x5B98;&#x80FD;&#x4E0A;&#x9540;&#x91D1;&#x7684;&#x3002;&#x8BF1;&#x9975;&#x6355;&#x98DF;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x88AB;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x901A;&#x8FC7;&#x8367;&#x5149;&#x730E;&#x7269;&#x7684;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4EBA;&#x7C7B; CD4&#xFF0C;&#x6FC0;&#x6D3B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5728;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684; co-receptor &#x548C;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x8354;&#x679D;&#xFF0C;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x65E9;&#x671F; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x7684;&#x5FC5;&#x8981;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CF;&#x5316;&#x8354;&#x679D;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x7ED9; CD4 &#x611F;&#x5149;&#x6027;&#x8861;&#x91CF;&#x5E73;&#x8861;&#x534F;&#x4F1A;&#x548C;&#x6F02;&#x767D;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x53CA;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6210;&#x50CF;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x9664;&#x4E86;&#x5DF2;&#x77E5;&#x7684;&#x950C;&#x6263;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x8354;&#x679D;&#x819C;&#x951A;&#x7279;&#x522B;&#x662F;&#x5BF9;&#x4E3B;&#x8981;&#x5F71;&#x54CD;&#x8354;&#x679D; CD4 &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x8C03;&#x89E3;&#x76F4;&#x63A5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x548C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x7A33;&#x5B9A;&#x5176;&#x4ED6;&#x8354;&#x679D;&#x57DF;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x603B;&#x5171;&#x819C;&#x7887;&#x6CCA;&#x5904;&#x589E;&#x52A0;&#x4E92;&#x52A8;&#x751F;&#x5B58;&#x671F;&#x7531;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6570;&#x91CF;&#x7EA7;&#x3002;

Micropatterning &#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x3002;

We present a method to identify and characterize interactions between a fluorophore-labeled protein ('prey') and a membrane protein ('bait') in live mammalian cells. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies to the bait extracellular domain. Bait-prey interactions are assayed through the redistribution of the fluorescent prey. We used the method to characterize the interaction between human CD4, the major co-receptor in T-cell activation, and human Lck, the protein tyrosine kinase essential for early T-cell signaling. We measured equilibrium associations by quantifying Lck redistribution to CD4 micropatterns and studied interaction dynamics by photobleaching experiments and single-molecule imaging. In addition to the known zinc clasp structure, the Lck membrane anchor in particular had a major impact on the Lck-CD4 interaction, mediating direct binding and further stabilizing the interaction of other Lck domains. In total, membrane anchorage increased the interaction lifetime by two orders of magnitude.

Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.

Nous pr&#xE9;sentons une m&#xE9;thode pour identifier et caract&#xE9;riser les interactions entre une prot&#xE9;ine fluorophore marqu&#xE9; (&#xAB;proie&#xBB;) et une prot&#xE9;ine de la membrane (&#xAB;l&#x26;#39;app&#xE2;t&#xBB;) dans les cellules vivantes de mammif&#xE8;res. Les cellules sont &#xE9;tal&#xE9;es sur des surfaces fonctionnalis&#xE9;es micro&#xE9;lectrodes avec des anticorps &#xE0; domaine extracellulaire d&#x26;#39;app&#xE2;t. Bait-proies interactions sont dos&#xE9;s par la redistribution de la proie fluorescente. Nous avons utilis&#xE9; la m&#xE9;thode pour caract&#xE9;riser l&#x26;#39;interaction entre le CD4 humain, les principaux co-r&#xE9;cepteur dans activation des lymphocytes T, et l&#x26;#39;homme LCK, la prot&#xE9;ine tyrosine kinase essentielle pour le d&#xE9;but de signalisation des cellules T. Nous avons mesur&#xE9; les associations d&#x26;#39;&#xE9;quilibre en quantifiant Lck redistribution &#xE0; micropatterns CD4 et ont &#xE9;tudi&#xE9; la dynamique d&#x26;#39;interaction par photoblanchiment exp&#xE9;riences et une seule mol&#xE9;cule d&#x26;#39;imagerie. En plus de la structure fermoir de zinc connus, l&#x26;#39;ancrage de la membrane Lck en particulier ont eu un impact majeur sur l&#x26;#39;interaction Lck-CD4, la m&#xE9;diation directe liant les parties et la stabilisation de l&#x26;#39;interaction d&#x26;#39;autres domaines Lck. Au total, la membrane d&#x26;#39;ancrage augment&#xE9; la dur&#xE9;e de vie d&#x26;#39;interaction de deux ordres de grandeur.

Micromodelage pour l&#x26;#39;analyse quantitative des interactions prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine dans les cellules vivantes

Wir stellen eine Methode zur Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionen zwischen einem Fluorophore beschriftet Protein (&#39;Beute&#39;) und einem Membranprotein (&#39;K&ouml;der&#39;) in lebenden S&auml;ugetier-Zellen. Zellen sind auf Micropatterned Oberfl&auml;chen, die Antik&ouml;rper gegen die K&ouml;der extrazellul&auml;ren funktionalisierten beschichtet. K&ouml;der-Beute Interaktionen werden durch die Umverteilung der fluoreszierenden Beute normalisiert. Wir verwendet die Methode, um die Interaktion zwischen menschlichen CD4, die gro&szlig;en Co-receptor in T-Zell-Aktivierung und menschlichen Lck, notwendig f&uuml;r die fr&uuml;hen T-Zell-Signalisierung Proteintyrosinkinase zu charakterisieren. Wir Ma&szlig;en Gleichgewicht Verb&auml;nde durch Quantifizierung Lck Umverteilung zu CD4-Micropatterns und studierte Interaktion Dynamik durch Photobleichung Experimente und Einzelmolek&uuml;l-Bildgebung. Neben der bekannten Zink-Verschluss-Struktur hatte der Lck-Membran-Anker insbesondere einen wichtigen Einfluss auf die Lck-CD4-Interaktion, Vermittlung, direkte Bindung und die Interaktion anderer Lck-Dom&auml;nen weiter zu stabilisieren. Insgesamt stieg das Membran Ankerplatz die Interaktion-Lebensdauer von zwei Gr&ouml;&szlig;enordnungen.

Micropatterning f&uuml;r die Quantitative Analyse von Protein-Protein Interaktionen in lebenden Zellen.

Vi presentiamo un metodo per identificare e caratterizzare le interazioni tra una proteina fluoroforo (&#39;preda&#39;) e una proteina di membrana (&#39;esca&#39;) in cellule di mammifero dal vivo. Le cellule sono placcate su superfici micropatterned funzionalizzate con anticorpi contro il dominio extracellulare di esca. Esca-preda interazioni sono analizzate attraverso la ridistribuzione della preda fluorescente. Abbiamo utilizzato il metodo per caratterizzare l&#39;interazione tra umani CD4, il ricettore pi&ugrave; importanti nell&#39;attivazione delle cellule T e umano Lck, la chinasi della tirosina della proteina essenziale per la segnalazione precoce T-cellulare. Abbiamo misurato le associazioni equilibrio da quantificare Lck ridistribuzione di CD4 microdisegni e studiato la dinamica di interazione di singola molecola imaging e photobleaching esperimenti. Oltre la struttura di chiusura conosciuto zinco, l&#39;ancoraggio della membrana Lck in particolare ha avuto un impatto importante sull&#39;interazione Lck-CD4, mediando il binding diretto e stabilizzare ulteriormente l&#39;interazione di altri domini Lck. In totale, ancoraggio della membrana aumentata la durata dell&#39;interazione di due ordini di grandezza.

Micropatterning per l&#39;analisi quantitativa delle interazioni della proteina-proteina in cellule viventi.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;#39;&#x7372;&#x7269;&#x26;#39;&#xFF09;&#x3001;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x3001;&#x54FA;&#x4E73;&#x52D5;&#x7269;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;#39;&#x990C;&#x26;#39;&#xFF09;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x3001;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x990C;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x3067;&#x5B98;&#x80FD;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306B;&#x30E1;&#x30C3;&#x30AD;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x990C; - &#x6355;&#x98DF;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x3092;&#x901A;&#x3057;&#x3066;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;CD4 T&#x7D30;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x30E1;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;Lck&#x304C;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x3001;&#x521D;&#x671F;&#x306E;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306B;&#x5FC5;&#x9808;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;CD4&#x306E;&#x5FAE;&#x7D30;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x3078;&#x306E;&#x518D;&#x5206;&#x914D;Lck&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5747;&#x8861;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x3001;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3068;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5149;&#x9000;&#x8272;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x65E2;&#x77E5;&#x306E;&#x4E9C;&#x925B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30D7;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x819C;&#x30A2;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;Lck&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;Lck&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3092;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x3001;Lck&#x304C;-CD4&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305F;&#x3002;&#x5408;&#x8A08;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x819C;&#x306E;&#x505C;&#x6CCA;&#x306F;2&#x6841;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5BFF;&#x547D;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;

&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;

&#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558; &#xACE0; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; fluorophore &#xB77C;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&#39;&#xBA39;&#xC774;&#39;)&#xC640; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&#39;&#xBBF8;&#xB07C;&#39;) &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC18C;&#xAC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC140; &#xBBF8;&#xB07C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC640; functionalized micropatterned &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xAE08; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBBF8;&#xB07C; &#xBA39;&#xC774; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD615;&#xAD11; &#xBA39;&#xC774;&#xC758; &#xC7AC;&#xBD84;&#xBC30;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC778;&#xAC04;&#xC758; CD4, T &#xC138;&#xD3EC; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC758; &#xC8FC;&#xC694; co-receptor &#xC778;&#xAC04;&#xC758; Lck, &#xCD08;&#xAE30; T &#xC138;&#xD3EC; &#xC2DC;&#xADF8;&#xB110;&#xB9C1;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; tyrosine kinase&#xC758; &#xC0C1;&#xD638;&#xC791;&#xC6A9; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; Lck &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC; CD4 micropatterns &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xD3C9;&#xD615; &#xB2E8;&#xCCB4;&#xB97C; &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xACE0; photobleaching &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC5ED;&#xD559;&#xC744; &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4;&#xB41C; &#xC544;&#xC5F0; &#xAC78;&#xC1E0; &#xAD6C;&#xC870; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; Lck &#xB9C9; &#xC575;&#xCEE4; &#xD2B9;&#xD788; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBC0F; &#xCD94;&#xAC00; &#xB2E4;&#xB978; Lck &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC548;&#xC815; &#xC2DC;&#xD0A4;&#xB294; &#xC911;&#xC7AC; Lck CD4 &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xD070; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xCD1D;, &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC575;&#xCEE4;&#xB9AC;&#xC9C0; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC218;&#xBA85; &#xB450; &#xBC30;&#xB098; &#xC99D;&#xAC00;.

&#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; Micropatterning.

Se presenta un m&#xE9;todo para identificar y caracterizar las interacciones entre una prote&#xED;na marcada con fluor&#xF3;foro (&#x26;quot;presa&#x26;quot;) y una prote&#xED;na de membrana (&#xAB;cebo&#xBB;) en c&#xE9;lulas de mam&#xED;feros vivos. Las c&#xE9;lulas se cultivaron sobre superficies micropatterned funcionalizados con anticuerpos contra el dominio extracelular de cebo. Bait-presa se analizan las interacciones a trav&#xE9;s de la redistribuci&#xF3;n de la presa fluorescente. Se us&#xF3; el m&#xE9;todo para caracterizar la interacci&#xF3;n entre los linfocitos CD4 humanos, los principales co-receptor de activaci&#xF3;n de c&#xE9;lulas T, y Lck humana, la prote&#xED;na tirosina quinasa esencial para principios de c&#xE9;lulas T de se&#xF1;alizaci&#xF3;n. Medimos las asociaciones de equilibrio mediante la cuantificaci&#xF3;n de la redistribuci&#xF3;n de Lck micropatrones CD4 y estudi&#xF3; la din&#xE1;mica de interacci&#xF3;n por photobleaching experimentos y las im&#xE1;genes de una sola mol&#xE9;cula. Adem&#xE1;s de la estructura de zinc broche conocido, el anclaje de membrana Lck en particular ten&#xED;a un impacto importante en la interacci&#xF3;n Lck-CD4, mediando la uni&#xF3;n directa y a&#xFA;n m&#xE1;s la estabilizaci&#xF3;n de la interacci&#xF3;n de otro Lck dominios. En total, la membrana de anclaje aumentado el tiempo de vida por la interacci&#xF3;n de dos &#xF3;rdenes de magnitud.

Micropatterning para el an&#xE1;lisis cuantitativo de las interacciones prote&#xED;na-prote&#xED;na en las c&#xE9;lulas vivas

&#x8840;&#x6E05;&#x4E2D;&#x7684;&#x6C27;&#x5316;&#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x542F;&#x52A8;&#x52A8;&#x8109;&#x7CA5;&#x6837;&#x786C;&#x5316;&#x5F62;&#x6210;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E25;&#x91CD;&#x7684;&#x75C5;&#x7406;&#x751F;&#x7406;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0A;&#x5DF2;&#x77E5;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8102;&#x8D28;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x51CB;&#x4EA1; &#xFF1B;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5438;&#x6536;&#x673A;&#x5236;&#x4ECD;&#x7136;&#x662F;&#x795E;&#x79D8;&#x7684;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x8C03;&#x67E5; (PGPE-Alexa647) &#x7684;&#x5404;&#x79CD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x8367;&#x5149;&#x7684;&#x6C27;&#x5316;&#x78F7;&#x8102; 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine &#x7684;&#x884C;&#x4E3A;&#x3002;&#x63A2;&#x5934;&#x662F;&#x7531; unspecifically &#x901A;&#x8FC7;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x7A74;&#x6837;&#x5185;&#x9677;&#x6216;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x6D82;&#x5C42;&#x5751;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x3002;&#x6709;&#x8DA3;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x5438;&#x6536;&#x6240;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x6E05;&#x9053;&#x592B;&#x53D7;&#x4F53;&#x7C7B;&#x578B;&#x4E00;&#x3001; B &#x8D85;&#x7075;&#x654F;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x5141;&#x8BB8;&#x6211;&#x4EEC;&#x8DDF;&#x968F;&#x5728;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6C34;&#x5E73; &#xFF1B; &#x5438;&#x6536;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4FBF;&#x5229;&#x6211;&#x4EEC;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#xFF0C;&#x4E2D;&#x65AD;&#x7684;&#x77AC;&#x6001;&#x6682;&#x505C;&#x6301;&#x7EED;&#x65F6;&#x95F4;&#x4E3A;&#x5927;&#x7EA6; 0.9 PGPE Alexa647 &#x7684;&#x5FEB;&#x901F;&#x6269;&#x6563; s endocytotic &#x5730;&#x70B9;&#x3002;&#x6E05;&#x9053;&#x592B;&#x53D7;&#x4F53; B I &#x578B;&#x9AD8;&#x6548;&#x8868;&#x8FBE;&#x4EA7;&#x751F;&#x4E86;&#x663E;&#x8457;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x5728;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6D41;&#x52A8;&#x6027;&#xFF0C;&#x548C;&#x540E;&#x679C;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x7684;&#x9891;&#x7387;&#x662F;&#x5426;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x6216;&#x8005;&#xFF0C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x6D41;&#x52A8;&#x6027;&#x8FD8;&#x53EF;&#x589E;&#x52A0;&#x6CBB;&#x7597;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6C34;&#x5E73;&#x9AD8;&#x7684;&#x672A;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x6C27;&#x5316;&#x78F7;&#x8102; 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine &#xFF1B;&#x4E5F;&#x5728;&#x8FD9;&#x79CD;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;PGPE Alexa647 &#x7684;&#x56FA;&#x5B9A;&#x9891;&#x7387;&#x662F;&#x540C;&#x65F6;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x6570;&#x636E;&#x8BC1;&#x660E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x6C27;&#x5316;&#x78F7;&#x8102;&#xFF0C;&#x5438;&#x6536;&#x7684;&#x5C5E;&#x6027;&#x7684;&#x5173;&#x8054;&#x6027;&#xFF0C;&#x5E76;&#x8868;&#x660E;&#x63A7;&#x5236;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x95F4;&#x63A5;&#x673A;&#x5236;&#x3002;

&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x6D41;&#x52A8;&#x6027;&#x5F71;&#x54CD;&#x77AC;&#x6001;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x7684;&#x6C27;&#x5316;&#x78F7;&#x8102;&#x542B;&#x91CF;&#x4E3A;&#x968F;&#x540E;&#x5438;&#x6536;&#x7684; endocytotic &#x7F51;&#x7AD9;&#x3002;

Oxidized phospholipids in serum initiate severe pathophysiological responses during the process of atherogenesis. On the cellular level it is known that these lipids induce apoptosis; however, the uptake mechanism remains enigmatic. We investigated here the behavior of the fluorescent oxidized phospholipid 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) in the plasma membrane of various cell lines. The probe was taken up by the cells unspecifically via caveolae or clathrin-coated pits. Interestingly, we found the uptake to be facilitated by the overexpression of the scavenger receptor class B type I. Ultra-sensitive microscopy allowed us to follow the uptake process at the single molecule level; we observed rapid diffusion of PGPE-Alexa647 in the plasma membrane, interrupted by transient halts with duration of approximately 0.9 s at endocytotic sites. Scavenger receptor class B type I overexpression yielded a pronounced increase in the single molecule mobility, and in consequence an increased frequency of immobilization. Alternatively, the plasma membrane fluidity could also be increased by treating cells with high levels of the unlabeled oxidized phospholipid 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine; also in this case, the immobilization frequency of PGPE-Alexa647 was concomitantly increased. The data demonstrate the relevance of plasma membrane properties for uptake of oxidized phospholipids, and indicate a novel indirect mechanism for the control of endocytosis.

Plasma membrane fluidity affects transient immobilization of oxidized phospholipids in endocytotic sites for subsequent uptake.

Phospholipides oxyd&#xE9;s dans le s&#xE9;rum engager graves r&#xE9;actions physiopathologiques au cours du processus d&#x26;#39;ath&#xE9;rogen&#xE8;se. Sur le plan cellulaire, il est connu que ces lipides induisent l&#x26;#39;apoptose, mais le m&#xE9;canisme d&#x26;#39;absorption reste &#xE9;nigmatique. Nous avons &#xE9;tudi&#xE9; ici le comportement de la phospholipide oxyd&#xE9; fluorescente 1-palmitoyl-2-glutaroyle-sn-glyc&#xE9;ro-3-phospho-N-Alexa647-&#xE9;thanolamine (PGPE-Alexa647) dans la membrane plasmique de diff&#xE9;rentes lign&#xE9;es cellulaires. La sonde a &#xE9;t&#xE9; prise par les cellules non sp&#xE9;cifique par le biais des fosses cav&#xE9;oles ou recouvertes de clathrine. Fait int&#xE9;ressant, nous avons trouv&#xE9; l&#x26;#39;adoption doit &#xEA;tre facilit&#xE9;e par la surexpression du r&#xE9;cepteur scavenger de classe B de type I. ultra-sensible de microscopie nous a permis de suivre le processus de capture &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle de la mol&#xE9;cule unique; nous avons observ&#xE9; la diffusion rapide des PGPE-Alexa647 dans la membrane plasmique , interrompue par des haltes transitoires d&#x26;#39;une dur&#xE9;e d&#x26;#39;environ 0,9 s sur les sites d&#x26;#39;endocytose. R&#xE9;cepteur scavenger de classe B type I surexpression conduit &#xE0; une augmentation marqu&#xE9;e de la mobilit&#xE9; seule mol&#xE9;cule, et en cons&#xE9;quence une augmentation de la fr&#xE9;quence d&#x26;#39;immobilisation. Alternativement, la fluidit&#xE9; de la membrane plasmatique pourrait &#xE9;galement &#xEA;tre augment&#xE9; par le traitement des cellules avec des niveaux &#xE9;lev&#xE9;s de la phospholipide oxyd&#xE9; non marqu&#xE9; 1-palmitoyl-2-glutaroyle-sn-glyc&#xE9;ro-3-phosphocholine; dans ce cas &#xE9;galement, la fr&#xE9;quence immobilisation de PGPE-Alexa647 &#xE9;tait concomitamment augment&#xE9;. Les donn&#xE9;es d&#xE9;montrent la pertinence de propri&#xE9;t&#xE9;s de la membrane plasmatique de l&#x26;#39;absorption des phospholipides oxyd&#xE9;s, et d&#x26;#39;indiquer un nouveau m&#xE9;canisme pour le contr&#xF4;le indirect de l&#x26;#39;endocytose.

Fluidit&#xE9; de la membrane du plasma affecte immobilisation transitoire de phospholipides oxyd&#xE9;s dans les sites d&#x26;#39;endocytose pour absorption ult&#xE9;rieure

Oxidierte Phospholipide im Serum initiieren schwere pathophysiologische Reaktionen w&auml;hrend des Prozesses der Atherogenesis. Auf zellul&auml;rer Ebene ist es bekannt, dass diese Lipide Apoptose induzieren; der Aufnahme-Mechanismus bleibt jedoch r&auml;tselhaft. Hier untersuchten wir das Verhalten von der fluoreszierenden oxidierte Phospholipide, die 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) in der Plasmamembran von verschiedenen Zelllinien. Die Sonde wurde durch die Zellen unspecifically &uuml;ber Caveolae oder Clathrin-beschichtete Gruben aufgegriffen. Interessanterweise fanden wir die Aufnahme durch die &Uuml;berexpression der Scavenger Rezeptor Klasse B Typ I. &auml;u&szlig;erst sensiblen Mikroskopie erlaubte uns, folgen den Aufnahme-Prozess auf der Einzelmolek&uuml;l-Ebene erleichtert werden; Wir beobachteten raschen Verbreitung von PGPE-Alexa647 in der Plasmamembran, unterbrochen von Transienten Haltepunkte mit Dauer von etwa 0,9 s an endocytotic Standorten. Scavenger-Rezeptor-Klasse B Typ I eine &Uuml;berexpression ergeben einer ausgepr&auml;gten Erh&ouml;hung der Einzelmolek&uuml;l-Mobilit&auml;t und in der Folge eine erh&ouml;hte Frequenz der Immobilisierung. Alternativ k&ouml;nnte die Plasmamembran-Fl&uuml;ssigkeit auch durch Behandlung von Zellen mit hoher die unbeschriftete oxidierte Phospholipide, die 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine erh&ouml;ht werden; auch in diesem Fall wurde die Immobilisierung-Frequenz des PGPE-Alexa647 begleitend erh&ouml;ht. Die Daten zeigen die Relevanz der Plasmamembran Eigenschaften f&uuml;r Aufnahme von oxidierte Phospholipide, und geben einen neuen indirekten Mechanismus zur Kontrolle der Endozytose.

Plasmamembran Fl&uuml;ssigkeit betrifft vor&uuml;bergehende Immobilisierung von oxidierte Phospholipide in endocytotic Websites f&uuml;r die nachfolgende Aufnahme.

Fosfolipidi ossidati nel siero avviano risposte patofisiologici gravi durante il processo di aterogenesi. Livello cellulare &egrave; noto che questi lipidi inducono apoptosi; Tuttavia, il meccanismo di assorbimento rimane enigmatico. Abbiamo studiato qui il comportamento dei fosfolipidi ossidati fluorescente 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) nella membrana del plasma di varie linee cellulari. La sonda &egrave; stato preso dalle cellule non specifico via caveolae o pozzi rivestite da Clatrina. &Egrave; interessante notare, abbiamo trovato l&#39;assorbimento essere facilitati dalla sovraespressione della classe recettore scavenger B tipo I. ultrasensibile microscopia ci ha permesso di seguire il processo di assorbimento a livello di singola molecola; abbiamo osservato la rapida diffusione di PGPE-Alexa647 nella membrana del plasma, interrotta da soste transitori con durata di circa 0,9 s endocitotiche siti. Classe di recettori Scavenger B tipo I sovraespressione ceduto un marcato aumento nella mobilit&agrave; singola molecola e di conseguenza un aumento della frequenza di immobilizzazione. In alternativa, la fluidit&agrave; della membrana del plasma anche potrebbe essere aumentata trattando le cellule con alti livelli dei fosfolipidi ossidati adenoide 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine; anche in questo caso, la frequenza di immobilizzazione di PGPE-Alexa647 simultaneamente &egrave; stata aumentata. I dati dimostrano la rilevanza delle propriet&agrave; della membrana plasmatica per assorbimento di fosfolipidi ossidati e indicano un romanzo meccanismo indiretto per il controllo di endocitosi.

Fluidit&agrave; di membrana plasmatica colpisce transitoria immobilizzazione dei fosfolipidi ossidati nei siti endocitotiche per assorbimento successiva.

&#x8840;&#x6E05;&#x4E2D;&#x306E;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306F;&#x30A2;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30E0;&#x767A;&#x751F;&#x306E;&#x904E;&#x7A0B;&#x3067;&#x6DF1;&#x523B;&#x306A;&#x75C5;&#x614B;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x306F;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3092;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306F;&#x8B0E;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x86CD;&#x5149;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x682A;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306E;1  - &#x30D1;&#x30EB;&#x30DF;&#x30C8;&#x30A4;&#x30EB;-2  - &#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30EB;-sn-&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30ED;-3  - &#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;-N-Alexa647-&#x30A8;&#x30BF;&#x30CE;&#x30FC;&#x30EB;&#x30A2;&#x30DF;&#x30F3;&#xFF08;PGPE-Alexa647&#xFF09;&#x306E;&#x632F;&#x308B;&#x821E;&#x3044;&#x200B;&#x200B;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306F;&#x3001;&#x30AB;&#x30D9;&#x30AA;&#x30E9;&#x3084;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x88AB;&#x8986;&#x30D4;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x975E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306B;PGPE-Alexa647&#x306E;&#x6025;&#x901F;&#x306A;&#x666E;&#x53CA;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x3001;&#x8208;&#x5473;&#x6DF1;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30B9;&#x30AB;&#x30D9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;B&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;I&#x8D85;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x306E;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4FC3;&#x9032;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306F;&#x3001;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306F;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x5F93;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x8A31;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3001;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x7D04;0.9&#x79D2;&#x306E;&#x671F;&#x9593;&#x306E;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x505C;&#x6B62;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4E2D;&#x65AD;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B9;&#x30AB;&#x30D9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;B&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;I&#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x79FB;&#x52D5;&#x5EA6;&#x306E;&#x9855;&#x8457;&#x306A;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x3001;&#x3068;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3067;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x5468;&#x6CE2;&#x6570;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306E;&#x6D41;&#x52D5;&#x6027;&#x306F;&#x3001;&#x975E;&#x6A19;&#x8B58;&#x306E;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;1-&#x30D1;&#x30EB;&#x30DF;&#x30C8;&#x30A4;&#x30EB;-2  - &#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30EB;-sn-&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30ED;-3  - &#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30B3;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x51E6;&#x7406;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x5834;&#x5408;&#x3082;&#x3001;PGPE-Alexa647&#x306E;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5468;&#x6CE2;&#x6570;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x4ED8;&#x968F;&#x3057;&#x3066;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x7279;&#x6027;&#x306E;&#x59A5;&#x5F53;&#x6027;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3001;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x9593;&#x63A5;&#x7684;&#x306A;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30DE;&#x819C;&#x306E;&#x6D41;&#x52D5;&#x6027;&#x306F;&#x3001;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3005;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x304C;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x904E;&#x6E21;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;

&#xD608; &#xCCAD;&#xC5D0; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; atherogenesis&#xC758; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2EC;&#xD55C; pathophysiological &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xC2DC;&#xC791;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC138;&#xD3EC; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC9C0;&#xC9C8;; apoptosis &#xC720;&#xB3C4; &#xC54C;&#xB824;&#xC838; &#xC788;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xD1B5;&#xD48D; &#xAD00; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xC218;&#xC218;&#xAED8;&#xB07C;&#xC758; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC5EC;&#xAE30;&#xC758; &#xB3D9;&#xC791; 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine &#xD615;&#xAD11; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; (PGPE-Alexa647) &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC870;&#xC0AC;. &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB294; &#xB300;&#xC0C1;&#xC774; caveolae &#xB610;&#xB294; &#xAD6C; &#xB369;&#xC774; clathrin &#xCF54;&#xD305;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCC44;&#xD0DD; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD765;&#xBBF8;&#xB86D;&#xAC8C;&#xB3C4;, &#xD3D0;&#xD488; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xD074;&#xB798;&#xC2A4; B &#xD0C0;&#xC785; &#xB098; &#xACE0;&#xAC10;&#xB3C4; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xD574; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; overexpression&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCD09;&#xC9C4;&#xC5D0; &#xAE00;&#xADC0;&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xAD00;&#xCC30; &#xAE30;&#xAC04;&#xC774; &#xC57D; 0.9&#xC758; &#xC77C;&#xC2DC;&#xC801;&#xC778; &#xC911;&#xB2E8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xB2E8; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; PGPE alexa647&#xC758; &#xAE09;&#xC18D; &#xD55C; &#xBCF4;&#xAE09;&#xC5D0; &#xC2A4; endocytotic &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C;. &#xD3D0;&#xD488; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xD074;&#xB798;&#xC2A4; B &#xD0C0;&#xC785; overexpression &#xB098;&#xC654;&#xACE0; &#xB69C;&#xB837;&#xD55C; &#xC99D;&#xAC00; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9;&#xC131; &#xBC0F; &#xACB0;&#xACFC; immobilization &#xBE48;&#xB3C4;&#xAC00; &#xC99D;&#xAC00; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xB9C9; &#xC720;&#xB3D9;&#xC131; &#xB610;&#xD55C; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xC5C6;&#xB294; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine; &#xB192;&#xC740; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC99D;&#xAC00; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xACBD;&#xC6B0; &#xB610;&#xD55C; PGPE Alexa647 immobilization &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218; &#xC99D;&#xAC00; concomitantly &#xD588;&#xB2E4;. &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8;&#xC758; &#xD1B5;&#xD48D; &#xAD00;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC18D;&#xC131;&#xC758; &#xAD00;&#xB828;&#xC131;&#xC744; &#xC785;&#xC99D; &#xD558; &#xACE0; endocytosis &#xC81C;&#xC5B4;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xAC04;&#xC811; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC720;&#xB3D9;&#xC131; &#xD6C4;&#xC18D; &#xD1B5;&#xD48D; &#xAD00;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; endocytotic &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; &#xACFC;&#xB3C4; immobilization&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Fosfol&#xED;pidos oxidados en el suero iniciar severas respuestas fisiopatol&#xF3;gicos durante el proceso de la aterog&#xE9;nesis. En el nivel celular, se sabe que estos l&#xED;pidos inducir apoptosis, sin embargo, el mecanismo de captaci&#xF3;n sigue siendo enigm&#xE1;tica. Hemos investigado aqu&#xED; el comportamiento del fosfol&#xED;pido fluorescente oxidado 1-palmitoil-2-glutaroyl-sn-glicero-3-fosfato-N-Alexa647-etanolamina (PGPE-Alexa647) en la membrana plasm&#xE1;tica de diversas l&#xED;neas de c&#xE9;lulas. La sonda fue tomada por las c&#xE9;lulas inespec&#xED;fica a trav&#xE9;s de pozos de caveolae o revestido de clatrina. Curiosamente, hemos observado la absorci&#xF3;n que ser&#xE1; facilitado por la sobreexpresi&#xF3;n del receptor scavenger clase B tipo I. ultra sensible microscopio nos permiti&#xF3; seguir el proceso de absorci&#xF3;n en el nivel de mol&#xE9;culas individuales, se observ&#xF3; una r&#xE1;pida difusi&#xF3;n de PGPE-Alexa647 en la membrana plasm&#xE1;tica , interrumpido por paradas transitorias, con una duraci&#xF3;n de aproximadamente 0,9 s en los sitios de endocytotic. Receptor scavenger clase B tipo I sobreexpresi&#xF3;n produjo un pronunciado aumento en la movilidad de una sola mol&#xE9;cula, y en consecuencia un aumento de la frecuencia de la inmovilizaci&#xF3;n. Alternativamente, la fluidez de la membrana plasm&#xE1;tica tambi&#xE9;n podr&#xED;a ser aumentada por tratamiento de c&#xE9;lulas con altos niveles de la fosfol&#xED;pido no marcado oxidado 1-palmitoil-2-glutaroyl-sn-glicero-3-fosfocolina; tambi&#xE9;n en este caso, la frecuencia de inmovilizaci&#xF3;n PGPE-Alexa647 era concomitantemente aumentado. Los datos demuestran la importancia de las propiedades de la membrana de plasma para la captaci&#xF3;n de fosfol&#xED;pidos oxidados, e indicar un nuevo mecanismo indirecto para el control de la endocitosis.

La fluidez de la membrana plasm&#xE1;tica afecta inmovilizaci&#xF3;n transitoria de los fosfol&#xED;pidos oxidados en los sitios de captaci&#xF3;n endoc&#xED;tica posterior

&#x5916;&#x56FD;&#x7684; T &#x6DCB;&#x5DF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x7684;&#x8BC6;&#x522B;&#x662F;&#x5173;&#x952E;&#x6700;&#x9002;&#x5E94;&#x6027;&#x514D;&#x75AB;&#x5E94;&#x7B54;&#x3002;&#x5B83;&#x662F;&#x7531;&#x53D7;&#x7279;&#x5B9A; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x4F53; (&#x901A;&#x4EA7;&#x6DA6;&#x76DB;&#xFF09; &#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x76F8;&#x5BB9;&#x6297;&#x539F;&#x80BD;&#x4E3B;&#x8981;&#x6027;&#x590D;&#x6742; &#xFF08;&#x62B5;&#x62BC;&#xFF09; &#x4E0A;&#x7684;&#x5176;&#x4ED6;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x9A71;&#x52A8;&#x7684;&#x3002;&#x5982;&#x679C;&#x751F;&#x4EA7;&#x6027;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4EA4;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x514D;&#x75AB;&#x7A81;&#x89E6;&#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x7A81;&#x89E6; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x52A8;&#x6001;&#x4E0E; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x4E2D;&#x4FDD;&#x6301;&#x5F88;&#x5927;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x3001; &#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB; &#xFF08;&#x97F3;&#x54C1;&#xFF09; &#x4E4B;&#x95F4;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x8BB0;&#x901A;&#x4EA7;&#x6DA6;&#x76DB;&#x548C;&#x5176;&#x540C;&#x6E90;&#x62B5;&#x62BC;&#x914D;&#x4F53;&#x6765;&#x8861;&#x91CF;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x539F;&#x4F4D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x7EFC;&#x5408;&#x4F53;&#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#x4E0E;&#x6D4B;&#x91CF;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x76F8;&#x6BD4;&#xFF0C;&#x5927;&#x5E45;&#x589E;&#x52A0; (4-12-&#x6298;&#x53E0;&#xFF09;&#x3002;&#x4E2D;&#x65AD;&#x7684;&#x808C;&#x52A8;&#x86CB;&#x767D;&#x805A;&#x5408;&#x7269;&#x626D;&#x8F6C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x9AA8;&#x67B6;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7834;&#x574F;&#x8FD9;&#x79CD;&#x4E92;&#x52A8;&#xFF0C;&#x76F4;&#x63A5;&#x6216;&#x95F4;&#x63A5;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5982;&#x6B64;&#xFF0C;TCR &#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x4E3A;&#x62B5;&#x62BC;&#x88AB;&#x5927;&#x5927;&#x63D0;&#x5347;&#x5927;&#x578B;&#x7ED3;&#x679C; &#xFF08;&#x7EA6; 100 &#x500D;&#xFF09; &#x589E;&#x52A0;&#x534F;&#x4F1A;&#x7387;&#xFF0C;&#x4E92;&#x8865;&#x5206;&#x5B50;&#x53D6;&#x5411;&#x548C;&#x805A;&#x7C7B;&#x5206;&#x6790;&#x53EF;&#x80FD;&#x53D1;&#x751F;&#x7684;&#x540E;&#x679C;&#x3002;&#x8F85;&#x52A9; T &#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;CD4 &#x5206;&#x5B50;&#x62DF;&#x5408;&#x4F5C;&#x5230;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x540C;&#x4E00;&#x62B5;&#x62BC; tcr &#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;CD4 &#x5C01;&#x9501;&#x4E86;&#x7A81;&#x89E6; TCR &#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x6CA1;&#x6709;&#x7834;&#x574F;&#x7A33;&#x5B9A; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#xFF0C;&#x6307;&#x793A; TCR &#x7ED1;&#x5B9A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x4E8E; CD4 &#x7684;&#x62B5;&#x62BC;&#x3002;

&#x539F;&#x4F4D; TCR-&#x80BD;-MHC &#x4EA4;&#x4E92;&#x663E;&#x793A;&#x52A0;&#x901F;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x548C;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x3002;

The recognition of foreign antigens by T lymphocytes is essential to most adaptive immune responses. It is driven by specific T-cell antigen receptors (TCRs) binding to antigenic peptide-major histocompatibility complex (pMHC) molecules on other cells. If productive, these interactions promote the formation of an immunological synapse. Here we show that synaptic TCR-pMHC binding dynamics differ significantly from TCR-pMHC binding in solution. We used single-molecule microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET) between fluorescently tagged TCRs and their cognate pMHC ligands to measure the kinetics of TCR-pMHC binding in situ. When compared with solution measurements, the dissociation of this complex was increased significantly (4-12-fold). Disruption of actin polymers reversed this effect, indicating that cytoskeletal dynamics destabilize this interaction directly or indirectly. Nevertheless, TCR affinity for pMHC was significantly elevated as the result of a large (about 100-fold) increase in the association rate, a likely consequence of complementary molecular orientation and clustering. In helper T cells, the CD4 molecule has been proposed to bind cooperatively with the TCR to the same pMHC complex. However, CD4 blockade had no effect on the synaptic TCR affinity, nor did it destabilize TCR-pMHC complexes, indicating that the TCR binds pMHC independently of CD4.

TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.

La reconnaissance des antig&#xE8;nes &#xE9;trangers par les lymphocytes T est indispensable &#xE0; la plupart des r&#xE9;ponses immunitaires adaptatives. Elle est entra&#xEE;n&#xE9;e par des r&#xE9;cepteurs sp&#xE9;cifiques de l&#x26;#39;antig&#xE8;ne des cellules T (TCR) de liaison au complexe d&#x26;#39;histocompatibilit&#xE9; peptide antig&#xE9;nique-major (pMHC) mol&#xE9;cules sur d&#x26;#39;autres cellules. Si productive, ces interactions favorisent la formation d&#x26;#39;une synapse immunologique. Ici, nous montrons que synaptiques TCR-PMHC la dynamique de liaison diff&#xE8;rent consid&#xE9;rablement de TCR-pMHC contraignant en solution. Nous avons utilis&#xE9; une seule mol&#xE9;cule de la microscopie et la fluorescence de transfert d&#x26;#39;&#xE9;nergie par r&#xE9;sonance (FRET) entre TCR marqu&#xE9;es par fluorescence et de leurs ligands apparent&#xE9;s PMHC pour mesurer la cin&#xE9;tique de TCR-pMHC liaison in situ. En comparaison avec mesures de la solution, la dissociation de ce complexe a &#xE9;t&#xE9; augment&#xE9; de mani&#xE8;re significative (de 4 &#xE0; 12 fois). Perturbation des polym&#xE8;res d&#x26;#39;actine a renvers&#xE9; cet effet, indiquant que la dynamique du cytosquelette d&#xE9;stabiliser cette interaction, directement ou indirectement. N&#xE9;anmoins, TCR affinit&#xE9; pour pMHC a &#xE9;t&#xE9; significativement plus &#xE9;lev&#xE9;e que le r&#xE9;sultat d&#x26;#39;une grande (environ 100 fois) augmentation de la vitesse d&#x26;#39;association, une cons&#xE9;quence probable de l&#x26;#39;orientation mol&#xE9;culaire compl&#xE9;mentaire et le clustering. Dans les cellules T auxiliaires, la mol&#xE9;cule CD4 a &#xE9;t&#xE9; propos&#xE9; de lier en collaboration avec le TCR au m&#xEA;me complexe pMHC. Cependant, le blocus CD4 n&#x26;#39;a eu aucun effet sur la synaptique affinit&#xE9; du TCR, et n&#x26;#39;a pas d&#xE9;stabiliser TCR-PMHC complexes, ce qui indique que le TCR se lie pMHC ind&#xE9;pendamment de CD4.

TCR-peptide-CMH Interactions in situ pr&#xE9;sentent des cin&#xE9;tiques acc&#xE9;l&#xE9;r&#xE9;es et une affinit&#xE9; accrue

Die Anerkennung der fremde Antigene von T-Lymphozyten ist wichtig, die adaptive Immunantworten. Es wird durch spezifische T-Zell-Antigenrezeptoren (TCRs) binden an Antigene Peptid-Major Histocompatibility complex (pMHC) Molek&uuml;le auf andere Zellen angetrieben. Wenn produktiv, f&ouml;rdern diese Interaktionen die Bildung von eine immunologische Synapse. Hier zeigen wir, dass synaptische TCR-pMHC Bindung Dynamik von TCR-pMHC Bindung in L&ouml;sung deutlich unterscheiden. Wir verwendeten Einzelmolek&uuml;l-Mikroskopie und Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) zwischen Leuchtstoff markierte TCRs und ihrer Verwandten pMHC-Liganden, um die Kinetik der TCR-pMHC Bindung an Ort und Stelle zu messen. Im Vergleich zu L&ouml;sung Messungen der Dissoziation dieses Komplexes deutlich erh&ouml;ht (4-12-fach). Unterbrechung der Aktin-Polymere umgekehrt dieser Effekt, der darauf hinweist, dass Zytoskelett Dynamik dieser Interaktion direkt oder indirekt zu destabilisieren. Dennoch war TCR Affinit&auml;t f&uuml;r pMHC deutlich erh&ouml;ht, wie das Ergebnis einer gro&szlig;en (ca. 100-fold) zu erh&ouml;hen, in der Vereinigung Rate, eine wahrscheinlich Folge der komplement&auml;re Molekulare Orientierung und clustering. In T-Helferzellen schl&auml;gt das CD4-Molek&uuml;l, kooperativ mit TCR auf der gleichen pMHC Komplex zu binden. Jedoch CD4-Blockade hatte keine Auswirkung auf die synaptische TCR-Affinit&auml;t, noch hat es destabilisieren TCR-pMHC-komplexe, die darauf hinweist, dass TCR pMHC unabh&auml;ngig von der CD4 bindet.

TCR-Peptid-MHC-Interaktion in-situ zeigen beschleunigte Kinetik und erh&ouml;hte Affinit&auml;t.

Il riconoscimento di antigeni estranei dai linfociti T &egrave; essenziale a pi&ugrave; risposte immunitarie. Esso &egrave; guidato da cellule T antigene recettori specifici (TCRs) associazione di molecole su altre cellule a antigenica del peptide-maggiore istocompatibilit&agrave; complesse (pMHC). Se produttive, queste interazioni promuovono la formazione di una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo che synaptic TCR-pMHC associazione dinamica differisce significativamente dalla associazione di TCR-pMHC in soluzione. Abbiamo usato la singola molecola fluorescenza e microscopia resonance energy transfer (FRET) tra TCRs fluorescente contrassegnati e loro ligandi pMHC affine per misurare la cinetica del legame del TCR-pMHC in situ. Quando confrontato con misurazioni di soluzione, la dissociazione di questo complesso &egrave; stata aumentata significativamente (4-12-fold). Interruzione dei polimeri di actina invertito questo effetto, che indica che la dinamica del citoscheletro destabilizzer&agrave; questa interazione direttamente o indirettamente. Tuttavia, affinit&agrave; TCR per pMHC era significativamente elevati come il risultato di un grande (circa 100 volte) aumento del tasso di associazione, una probabile conseguenza dell&#39;orientamento molecolare complementare e clustering. In cellule T helper, la molecola CD4 &egrave; stato proposto di associare in modo cooperativo con il TCR per il pMHC stesso complesso. Tuttavia, CD4 blocco ha avuto alcun effetto sull&#39;affinit&agrave; del TCR sinaptica, n&eacute; fatto destabilizzare complessi TCR-pMHC, che indica che il TCR si lega pMHC indipendentemente dai CD4.

TCR-peptide-MHC interazioni in situ Visualizza cinetica accelerata e maggiore affinit&agrave;.

T&#x30EA;&#x30F3;&#x30D1;&#x7403;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5916;&#x6765;&#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x8A8D;&#x8B58;&#x306F;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x9069;&#x5FDC;&#x514D;&#x75AB;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x4E0A;&#x306E;&#x6297;&#x539F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x4E3B;&#x8981;&#x7D44;&#x7E54;&#x9069;&#x5408;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#xFF08;pMHC&#xFF09;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x7279;&#x7570;&#x7684;T&#x7D30;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;TCR&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x99C6;&#x52D5;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x751F;&#x7523;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x5834;&#x5408;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x514D;&#x75AB;&#x5B66;&#x7684;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;&#x306E;TCR-pMHC&#x7D50;&#x5408;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306F;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x3067;TCR-pMHC&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3068;&#x306F;&#x5927;&#x304D;&#x304F;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3001;in situ&#x3067;TCR-pMHC&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x52D5;&#x614B;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;TCR&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x540C;&#x65CF;pMHC&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#xFF08;FRET&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x5024;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x89E3;&#x96E2;&#x306F;&#x3001;&#xFF08;4&#x304B;&#x3089;12&#x500D;&#xFF09;&#x304C;&#x6709;&#x610F;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x91CD;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x7834;&#x58CA;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x9AA8;&#x683C;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9593;&#x63A5;&#x7684;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x9006;&#x8EE2;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;pMHC&#x305F;&#x3081;&#x306E;TCR&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30BD;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7387;&#x306E;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#xFF08;100&#x500D;&#x7A0B;&#x5EA6;&#xFF09;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x914D;&#x5411;&#x3068;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x9AD8;&#x3044;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x4E0A;&#x6607;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;CD4&#x5206;&#x5B50;&#x306F;&#x540C;&#x3058;pMHC&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;TCR&#x3068;&#x5354;&#x8ABF;&#x7684;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x63D0;&#x6848;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;CD4&#x306E;&#x5C01;&#x9396;&#x306F;&#x3001;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;TCR&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3055;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;TCR-pMHC&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;TCR&#x306F;CD4&#x304B;&#x3089;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x3066;pMHC&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x4E0A;&#x76AE;&#x5185;TCR-&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;-MHC&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x52A0;&#x901F;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x3068;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3059;&#x308B;

T &#xB9BC;&#xD504; &#xD1A8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC678;&#xAD6D; &#xD56D; &#xC6D0; &#xC778;&#xC2DD; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC801;&#xC751; &#xBA74;&#xC5ED; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801; &#xC774;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xB978; &#xC140;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBD84;&#xC790; &#xC870;&#xC9C1; &#xD56D; &#xC6D0; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;-&#xC804;&#xACF5; &#xC801;&#xD569;&#xC131; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C; (pMHC)&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD2B9;&#xC815; T &#xC138;&#xD3EC; &#xD56D; &#xC6D0; &#xC218;&#xC6A9; (TCRs)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAD6C;&#xB3D9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xACBD;&#xC6B0; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC131;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBA74;&#xC5ED; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4;&#xC758; &#xD615;&#xC131;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; TCR pMHC &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC5ED;&#xD559; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; TCR-Pmhc&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD06C;&#xAC8C; &#xCC28;&#xC774;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xBC0F; &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; (FRET) &#xC0AC;&#xC774; &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xD0DC;&#xADF8; TCRs &#xBC0F; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xB3D9;&#xC871; pMHC ligands TCR pMHC &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD604;&#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC18D;&#xB3C4; &#xCE21;&#xC815;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574;,&#xC774; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C;&#xC758; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4; (4-12 &#xBC30;). &#xC911;&#xB2E8; &#xB9D0;&#xB77C; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD6A8;&#xACFC; &#xC9C1;&#xC811; &#xB610;&#xB294; &#xAC04;&#xC811;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; cytoskeletal &#xC5ED;&#xD559;&#xC774;&#xC774; &#xC791;&#xC6A9; &#xBD88;&#xC548;&#xC815;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBC18;&#xC804;. &#xADF8;&#xB7FC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0;, &#xD611;&#xD68C; &#xC694;&#xAE08;, &#xC0C1;&#xD638; &#xBCF4;&#xC644;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xC790; &#xBC29;&#xD5A5; &#xBC0F; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130;&#xB9C1;&#xC758; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0; &#xD070; &#xACB0;&#xACFC; (&#xC57D; &#xC57D;) &#xC99D;&#xAC00; &#xD568;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; Pmhc&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; TCR &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC0C1;&#xC2B9; &#xB41C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBCF4;&#xC870; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; CD4 &#xBD84;&#xC790; &#xD611;&#xB825; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; pMHC TCR&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC81C;&#xC548; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, CD4 &#xBD09;&#xC1C4; &#xD588;&#xB2E4; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; TCR &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0;&#xB3C4; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4; &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; TCR pMHC &#xB2E8;&#xC9C0;, TCR &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; CD4 &#xBCC4;&#xB3C4;&#xB85C; pMHC &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBD88;&#xC548;&#xC815;.

TCR-&#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC;-MHC &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC6D0;&#xB798;&#xC758; &#xC7A5;&#xC18C;&#xC5D0; &#xAC00;&#xC18D;&#xB41C; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xBC0F; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El reconocimiento de ant&#xED;genos extra&#xF1;os por los linfocitos T es esencial para la mayor&#xED;a de las respuestas inmunitarias adaptativas. Es conducido por los receptores espec&#xED;ficos de ant&#xED;genos de c&#xE9;lulas T (TCR) de uni&#xF3;n al complejo de histocompatibilidad antig&#xE9;nica del p&#xE9;ptido mayor (pMHC) mol&#xE9;culas en otras c&#xE9;lulas. Si productiva, estas interacciones promover la formaci&#xF3;n de una sinapsis inmunol&#xF3;gica. Aqu&#xED; nos muestran que sin&#xE1;pticas TCR-pMHC la din&#xE1;mica de uni&#xF3;n difieren significativamente de TCR-pMHC vinculante en la soluci&#xF3;n. Se utiliz&#xF3; una sola mol&#xE9;cula de la microscop&#xED;a y la transferencia de energ&#xED;a de resonancia fluorescente (FRET) entre el TCR marcado con fluorescencia y sus ligandos afines pMHC para medir la cin&#xE9;tica de la TCR-pMHC uni&#xF3;n in situ. Cuando se compara con las mediciones de la soluci&#xF3;n, la disociaci&#xF3;n de este complejo fue significativamente mayor (4-12 veces). La interrupci&#xF3;n de pol&#xED;meros de actina invierte este efecto, lo que indica que la din&#xE1;mica del citoesqueleto desestabilizar esta interacci&#xF3;n directa o indirectamente. No obstante, TCR afinidad por pMHC fue significativamente elevado como el resultado de un grande (aproximadamente 100-veces) en la velocidad de asociaci&#xF3;n, una probable consecuencia de la orientaci&#xF3;n molecular y complementaria agrupaci&#xF3;n. En las c&#xE9;lulas T auxiliares, la mol&#xE9;cula CD4 se ha propuesto para enlazar cooperativamente con el TCR al complejo pMHC mismo. Sin embargo, el bloqueo de CD4 no tuvo efecto sobre la afinidad sin&#xE1;ptica TCR, ni tampoco desestabilizar TCR-pMHC complejos, lo que indica que el TCR se une pMHC independientemente de CD4.

TCR-p&#xE9;ptido-MHC Interacciones in situ muestra una cin&#xE9;tica acelerada y una mayor afinidad

&#x6700;&#x8FD1;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x5236;&#x8BA2;&#x4E86;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x91CF;&#x5316;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; (&quot;&#x8BF1;&#x9975;&quot;) &#x4E0E;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x86CB;&#x767D; (&quot;&#x730E;&#x7269;&quot;&#xFF09; &#x76F4;&#x63A5;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528; &#xFF08;Schwarzenbacher &#x4E2D;&#x5357;&#x5DE5;&#x4E1A;&#x5927;&#x5B66;&#x81EA;&#x7136;&#x65B9;&#x6CD5; 5:1053-1060&#x5E74; 2008&#x5E74;&#xFF09;&#x3002;&#x60F3;&#x6CD5;&#x5230;&#x79CD;&#x5B50;&#x7EC6;&#x80DE;&#x542B;&#x6709;&#x5FAE;&#x56FE;&#x6848;&#x6297;&#x4F53; exoplasmic &#x57DF;&#x7684;&#x8BF1;&#x9975;&#xFF0C;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x662F;&#xFF0C;&#x76D1;&#x6D4B;&#x901A;&#x8FC7;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x8367;&#x5149;&#x730E;&#x7269;&#x7684; co-patterning&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x65F6;&#x95F4;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x7684;&#x8BF1;&#x9975;&#x548C;&#x730E;&#x7269;&#x5FAE;&#x5F62;&#x6210;&#x540E;&#x64AD;&#x79CD;&#x5230;&#x5FAE;&#x82AF;&#x7247;&#x4E0A;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x3002;&#x4E0E;&#x8868;&#x9762;&#x7EC6;&#x80DE;&#x63A5;&#x89E6;&#x540E;&#x7ACB;&#x5373;&#x6210;&#x7ACB;&#x4E86;&#x6A21;&#x5F0F;&#x3002;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5F97;&#x4EE5;&#x5728;&#x82AF;&#x7247;&#x8868;&#x9762;&#x8FC1;&#x79FB;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x5FAE;&#x5BF9;&#x6BD4;&#x5EA6;&#xFF0C;&#x800C;&#x968F;&#x7740;&#x65F6;&#x95F4;&#x7684;&#x63A8;&#x79FB;&#x4FDD;&#x6301;&#x4E0D;&#x53D8;&#x3002;&#x5BF9;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x8BF1;&#x9975;&#x5BF9;&#x6BD4;&#x5EA6;&#x53EF;&#x80FD;&#x6709;&#x6CE2;&#x52A8;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4ECE;&#x91CA;&#x653E;&#xFF0C;&#x5728;&#x611F;&#x5149;&#x6027;&#x593A;&#x56DE;&#x8BF1;&#x9975;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F97;&#x51FA;&#x7684;&#x7ED3;&#x8BBA;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5728;&#x4EFB;&#x4F55;&#x65F6;&#x95F4;&#x70B9;&#x4ECE; 5 &#x5206;&#x949F;&#x5230;&#x51E0;&#x5C0F;&#x65F6;&#x540E;&#x64AD;&#x79CD;&#x6267;&#x884C;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x76D1;&#x6D4B;&#x65F6;&#x95F4;&#x4E0E;&#x4E92;&#x52A8;&#x5F00;&#x8F9F;&#x4E86;&#x65B0;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#xFF0C;&#x90FD;&#x7B80;&#x8981;&#x52FE;&#x52D2;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x90E8;&#x5206;&#x4E2D;&#x7684;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3002;

&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x3002;

We have recently devised a method to quantify interactions between a membrane protein ("bait") and a fluorophore-labeled protein ("prey") directly in the live-cell plasma membrane (Schwarzenbacher et al. Nature Methods 5:1053-1060 2008). The idea is to seed cells on surfaces containing micro-patterned antibodies against the exoplasmic domain of the bait, and monitor the co-patterning of the fluorescent prey via fluorescence microscopy. Here, we characterized the time course of bait and prey micropattern formation upon seeding the cells onto the micro-biochip. Patterns were formed immediately after contact of the cells with the surface. Cells were able to migrate over the chip surface without affecting the micropattern contrast, which remained constant over hours. On single cells, bait contrast may be subject to fluctuations, indicating that the bait can be released from and recaptured on the micropatterns. We conclude that interaction studies can be performed at any time-point ranging from 5 min to several hours post seeding. Monitoring interactions with time opens up the possibility for new assays, which are briefly sketched in the discussion section.

Temporal resolution of protein-protein interactions in the live-cell plasma membrane.

Nous avons r&#xE9;cemment mis au point une m&#xE9;thode pour quantifier les interactions entre une prot&#xE9;ine membranaire (&#xAB;app&#xE2;t&#xBB;) et une prot&#xE9;ine fluorophore marqu&#xE9; (&#xAB;proie&#xBB;) directement dans la membrane plasmatique des cellules vivantes (Schwarzenbacher et de ses m&#xE9;thodes al Nature. 5:1053-1060 2008 ). L&#x26;#39;id&#xE9;e est de cellules de semence sur des surfaces contenant des micro-textur&#xE9;es anticorps contre le domaine exoplasmique de l&#x26;#39;app&#xE2;t, et de surveiller le co-structuration de la proie fluorescente par microscopie &#xE0; fluorescence. Ici, nous avons caract&#xE9;ris&#xE9; l&#x26;#39;&#xE9;volution temporelle de l&#x26;#39;app&#xE2;t et la proie micromotif formation sur l&#x26;#39;ensemencement des cellules sur la micro-biopuce. Motifs ont &#xE9;t&#xE9; form&#xE9;s imm&#xE9;diatement apr&#xE8;s le contact des cellules avec la surface. Les cellules ont &#xE9;t&#xE9; en mesure de migrer sur la surface de la puce sans affecter le contraste micromotif, qui est rest&#xE9;e constante pendant des heures. Sur des cellules individuelles, contraste app&#xE2;t peut &#xEA;tre sujet &#xE0; des fluctuations, ce qui indique que l&#x26;#39;app&#xE2;t peut &#xEA;tre lib&#xE9;r&#xE9; de et repris sur les micropatterns. Nous concluons que les &#xE9;tudes d&#x26;#39;interaction peut &#xEA;tre effectu&#xE9;e &#xE0; n&#x26;#39;importe quel point dans le temps allant de 5 min &#xE0; l&#x26;#39;ensemencement apr&#xE8;s plusieurs heures. Suivi des interactions avec le temps ouvre la possibilit&#xE9; pour de nouveaux tests, qui sont bri&#xE8;vement esquiss&#xE9;es dans la section discussion.

R&#xE9;solution temporelle de interactions prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine dans la membrane plasmique des cellules vivantes

Vor kurzem haben wir eine Methode zur Quantifizierung der Interaktionen zwischen einem Membranprotein (&quot;K&ouml;der&quot;) und einem Fluorophore beschriftet Protein (&quot;Beute&quot;) direkt in der Plasmamembran Leben-Zelle entwickelt (Schwarzenbacher Et Al. Nature Methods 5:1053-1060 2008). Die Idee ist auf Saatgut Zellen auf Oberfl&auml;chen, die mit Mikro-gemustert-Antik&ouml;rpern gegen die Exoplasmic-Dom&auml;ne des K&ouml;ders und &uuml;berwacht die Co-patterning der fluoreszierenden Beute per Fluoreszenzmikroskopie. Hier wir charakterisiert den zeitlichen Verlauf des K&ouml;ders und micropat-Bildung bei der Aussaat der Zellen auf der Mikro-Biochip zum Opfer. Muster bildeten sich sofort nach dem Kontakt mit der Oberfl&auml;che der Zellen. Zellen konnten &uuml;ber die Chip-Fl&auml;che ohne Auswirkungen auf den micropat-Kontrast, der &uuml;ber Stunden konstant zu migrieren. Auf einzelne Zellen unterliegen K&ouml;der Kontrast Schwankungen, die darauf hinweist, dass der K&ouml;der entbunden und auf die Micropatterns zur&uuml;ckerobert werden kann. Wir schlie&szlig;en, dass Interaktion Studien durchgef&uuml;hrt werden k&ouml;nnen, zu jeder Zeit-Punkt zwischen 5 min. bis mehrere Stunden Post Aussaat. &Uuml;berwachung von Interaktionen mit der Zeit er&ouml;ffnet sich die M&ouml;glichkeit f&uuml;r neue Assays, die im Abschnitt kurz skizziert werden.

Zeitliche Aufl&ouml;sung von Protein-Protein-Interaktionen in der Plasmamembran Leben-Zelle.

Noi abbiamo recentemente messo a punto un metodo per quantificare le interazioni tra una proteina di membrana (&quot;esca&quot;) e una proteina fluoroforo (&quot;preda&quot;) direttamente nella membrana del plasma live-cella (metodi di natura Schwarzenbacher et al. 5:1053-1060 2008). L&#39;idea &egrave; di cellule seme su superfici contenenti micro-fantasia di anticorpi contro il dominio di exoplasmic dell&#39;esca e monitorare il co-patterning della preda fluorescente tramite microscopia di fluorescenza. Qui, abbiamo caratterizzato il decorso dell&#39;esca e la preda micropattern formazione sulla semina delle cellule sul micro-biochip. Modelli si formarono immediatamente dopo il contatto delle cellule con la superficie. Le cellule sono state in grado di migrare sulla superficie del chip senza alterare il contrasto micropattern, che &egrave; rimasto costante per ore. Su singole cellule, esca contrasto possa essere soggetti a fluttuazioni, che indica che l&#39;esca pu&ograve; essere rilasciato da e riconquistarono sul microdisegni. Possiamo concludere che gli studi di interazione possono essere eseguiti in qualsiasi punto di tempo dai 5 min a parecchie ore post semina. Monitoraggio interazioni con il tempo si apre la possibilit&agrave; per nuove analisi, che vengono brevemente abbozzato nella sezione discussione.

Risoluzione temporale delle interazioni della proteina-proteina nella membrana del plasma live-cella.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x6700;&#x8FD1;&#x3001;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x990C;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x76F4;&#x63A5;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#xFF08;Schwarzenbacher&#x3089;&#x3001;Nature&#x65B9;&#x6CD5;5:1053-1060&#x3001;2008&#x5E74;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x7372;&#x7269;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x8003;&#x6848;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#xFF09;&#x30A2;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A2;&#x306F;&#x3001;&#x990C;&#x306E;exoplasmic&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x542B;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306E;&#x7A2E;&#x5B50;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x86CD;&#x5149;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x5171;&#x540C;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x4E0A;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x64AD;&#x7A2E;&#x6642;&#x306B;&#x990C;&#x3068;&#x7372;&#x7269;&#x5FAE;&#x7D30;&#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x7D4C;&#x6642;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x306F;&#x8868;&#x9762;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x63A5;&#x89E6;&#x306E;&#x76F4;&#x5F8C;&#x306B;&#x5F62;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x6642;&#x9593;&#x306B;&#x308F;&#x305F;&#x308A;&#x4E00;&#x5B9A;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x5FAE;&#x7D30;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x3092;&#x3001;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306B;&#x79FB;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5358;&#x4E00;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x990C;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x304C;&#x990C;&#x3092;&#x304B;&#x3089;&#x653E;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x5FAE;&#x7D30;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x3067;&#x596A;&#x9084;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3001;&#x5909;&#x52D5;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x308B;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;5&#x5206;&#x304B;&#x3089;&#x6570;&#x6642;&#x9593;&#x5F8C;&#x64AD;&#x7A2E;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x4EFB;&#x610F;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x306E;&#x6642;&#x70B9;&#x3067;&#x5B9F;&#x884C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x7D50;&#x8AD6;&#x4ED8;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x6642;&#x9593;&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x7C21;&#x5358;&#x306B;&#x8B70;&#x8AD6;&#x306E;&#x30BB;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x30B9;&#x30B1;&#x30C3;&#x30C1;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x958B;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBBF8;&#xB07C;&quot;)&#xC640; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C1;&#xC811; fluorophore &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBA39;&#xC774;&quot;) &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xCE21;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xACE0;&#xC548; (Schwarzenbacher &#xC678;. &#xC790;&#xC5F0; &#xBC29;&#xBC95; 5:1053-1060 2008). &#xC544;&#xC774;&#xB514;&#xC5B4;, &#xBBF8;&#xB07C;&#xC758; exoplasmic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD56D; &#xCCB4; &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB85C; &#xD328;&#xD134;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xC2DC;&#xB4DC; &#xC140; &#xC774;&#xBA70; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD615;&#xAD11; &#xBA39;&#xC774;&#xC758; co-patterning&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBBF8;&#xB07C;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04; &#xACFC;&#xC815; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xBC0F; micropattern &#xD615;&#xC131; &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB85C; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xCE69;&#xC5D0; &#xC140; &#xC2DC;&#xB4DC;&#xB97C; &#xB530;&#xB77C; &#xBA39;&#xC774;. &#xD328;&#xD134; &#xC140; &#xC11C;&#xD53C;&#xC2A4;&#xC640; &#xC811;&#xCD09; &#xC9C1;&#xD6C4; &#xD615;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC140; &#xC2DC;&#xAC04; &#xB3D9;&#xC548; &#xC77C;&#xC815; &#xD558; &#xAC8C; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; micropattern &#xB300;&#xBE44;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xCE69; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xC140;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xB07C; &#xB300;&#xBE44; &#xBBF8;&#xB07C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xD45C; &#xD558;&#xB294; micropatterns&#xC5D0; &#xC0DD;&#xD3EC; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBCC0;&#xB3D9; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xC2DC;&#xAC04; &#xD3EC;&#xC778;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xAE4C;&#xC9C0; 5 &#xBD84; &#xC2DC;&#xB4DC; &#xBA87; &#xC2DC;&#xAC04; &#xAC8C;&#xC2DC;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC218;&#xD589;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xACB0;&#xB860; &#xC9C0;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC0C1;&#xD638; &#xD1A0;&#xB860; &#xC139;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC04;&#xB2E8; &#xD558; &#xAC8C; &#xC2A4;&#xCF00;&#xCE58; &#xB41C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC744; &#xC5FD;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC801; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;.

Recientemente, hemos ideado un m&#xE9;todo para cuantificar las interacciones entre una prote&#xED;na de membrana (&#x26;quot;carnada&#x26;quot;) y una prote&#xED;na marcada con fluor&#xF3;foro (&#x26;quot;presa&#x26;quot;) directamente en la membrana plasm&#xE1;tica de c&#xE9;lulas vivas (Schwarzenbacher et al. Nature Methods 5:1053-1060 2008 ). La idea es que las c&#xE9;lulas de semilla en las superficies que contienen micro-estampados anticuerpos contra el dominio exoplasmic del cebo, y monitorear la co-patr&#xF3;n de la presa fluorescente a trav&#xE9;s de microscop&#xED;a de fluorescencia. En este caso, se caracteriz&#xF3; la evoluci&#xF3;n en el tiempo de cebo y la formaci&#xF3;n de presas micropattern a la siembra de las c&#xE9;lulas en el micro-biochip. Los patrones se formaron inmediatamente despu&#xE9;s del contacto de las c&#xE9;lulas con la superficie. Las c&#xE9;lulas fueron capaces de migrar a la superficie del chip sin afectar el contraste micropattern, que se mantuvo constante durante horas. En las c&#xE9;lulas individuales, contraste cebo puede estar sujeto a fluctuaciones, lo que indica que el cebo puede ser liberado desde y recapturados en las micropatrones. Se concluye que los estudios de interacci&#xF3;n se puede realizar en cualquier punto de tiempo que oscila desde 5 minutos a varias horas despu&#xE9;s de la siembra. Seguimiento de las interacciones con el tiempo se abre la posibilidad de nuevos ensayos, que son brevemente esbozadas en la secci&#xF3;n de discusi&#xF3;n.

La resoluci&#xF3;n temporal de las interacciones prote&#xED;na-prote&#xED;na en la membrana plasm&#xE1;tica de las c&#xE9;lulas en vivo

&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#x590D;&#x6742;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5E76;&#x884C;&#x5316;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x9AD8;&#x8D28;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x5F53;&#x524D;&#x7B5B;&#x9009;&#x5E73;&#x53F0;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x6D4B;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x800C;&#x662F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x5448;&#x73B0;&#x7ED3;&#x679C;&#x96BE;&#x8D4B;&#x4E88;&#x7684;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x6B64;&#x5904;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x548C;&#x5EFA;&#x8BBE;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x67E5;&#x660E;&#x548C;&#x91CF;&#x5316;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; (&quot;&#x730E;&#x7269;&quot;) &#x548C;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; (&quot;&#x8BF1;&#x9975;&quot;&#xFF09; &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x7684;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x534F;&#x8BAE;&#x3002;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x662F; micropatterned &#x8868;&#x9762;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x8BF1;&#x9975; exoplasmic &#x57DF;&#x5B98;&#x80FD;&#x4E0A;&#x9540;&#x91D1;&#x7684;&#x3002;&#x8BF1;&#x9975;&#x6355;&#x98DF;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x730E;&#x7269;&#x7684;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x9AD8;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x4E0B;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5F31;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x5B83;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x7B5B;&#x67E5;&#x5DE5;&#x5177;&#x9002;&#x7528;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x6982;&#x5FF5;&#x8BC1;&#x660E;&#x88AB;&#x8BC1;&#x660E; CD4&#xFF0C;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684; hiv &#x611F;&#x67D3;&#x6291;&#x5236; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3001; &#x4E2D;&#x548C;&#x8354;&#x679D;&#xFF0C;&#x57FA;&#x672C;&#x4E3A;&#x65E9;&#x671F; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x5728;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CF;&#x5316;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x730E;&#x7269;&#x9975; micropatterning &#x540E;&#x7684;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x3002;

Our understanding of complex biological systems is based on high-quality proteomics tools for the parallelized detection and quantification of protein interactions. Current screening platforms, however, rely on measuring protein interactions in rather artificial systems, rendering the results difficult to confer on the in vivo situation. We describe here a detailed protocol for the design and the construction of a system to detect and quantify interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in living cells. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies to the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput, making it applicable as a screening tool. The proof-of-concept is demonstrated for the interaction between CD4, a major coreceptor in T-cell signaling, and Lck, a protein tyrosine kinase essential for early T-cell signaling.

Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.

Notre compr&#xE9;hension des syst&#xE8;mes biologiques complexes est bas&#xE9;e sur des outils prot&#xE9;omiques de haute qualit&#xE9; pour la d&#xE9;tection et la quantification des parall&#xE9;lis&#xE9; les interactions entre prot&#xE9;ines. Plates-formes de d&#xE9;pistage actuelles, toutefois, compter sur mesure les interactions entre prot&#xE9;ines dans des syst&#xE8;mes artificiels, plut&#xF4;t, ce qui rend les r&#xE9;sultats difficiles &#xE0; conf&#xE9;rer &#xE0; la situation in vivo. Nous d&#xE9;crivons ici un protocole d&#xE9;taill&#xE9; pour la conception et la construction d&#x26;#39;un syst&#xE8;me pour d&#xE9;tecter et quantifier les interactions entre une prot&#xE9;ine fluorophore marqu&#xE9; (&#xAB;proie&#xBB;) et une prot&#xE9;ine de la membrane (&#xAB;app&#xE2;t&#xBB;) dans les cellules vivantes. Les cellules sont &#xE9;tal&#xE9;es sur des surfaces fonctionnalis&#xE9;es micro&#xE9;lectrodes avec des anticorps &#xE0; domaine app&#xE2;ts exoplasmique. Bait-proies interactions sont analys&#xE9;s par le biais de la redistribution de la proie fluorescente. Le proc&#xE9;d&#xE9; est caract&#xE9;ris&#xE9; par une sensibilit&#xE9; &#xE9;lev&#xE9;e jusqu&#x26;#39;&#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle de la mol&#xE9;cule, la capacit&#xE9; de d&#xE9;tecter les interactions faibles, et un d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9;, ce qui rend applicable comme outil de d&#xE9;pistage. La preuve de concept est d&#xE9;montr&#xE9;e pour l&#x26;#39;interaction entre les cellules CD4, un cor&#xE9;cepteur majeur dans la signalisation cellulaire T-, et LCK, une prot&#xE9;ine tyrosine kinase essentielle pour les premiers T-cellules de signalisation.

D&#xE9;tection des interactions prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine dans la membrane plasmique de cellules vivantes en quantifiant redistribution Prey Sur micromodelage Bait

Unser Verst&auml;ndnis von komplexen biologischen Systemen basiert auf qualitativ hochwertigen Proteomics Werkzeuge f&uuml;r die parallelisierte Detektion und Quantifizierung von Protein-Interaktionen. Aktuelle Screening-Plattformen beruhen jedoch auf Messung von Protein-Interaktionen in eher k&uuml;nstlichen Systemen, Rendern der Ergebnisse schwierig, &uuml;ber die in-vivo Situation zu &uuml;bertragen. Wir beschreiben hier ein ausf&uuml;hrliches Protokoll f&uuml;r den Entwurf und den Bau eines Systems zu erkennen und zu quantifizieren Interaktionen zwischen einem Fluorophore beschriftet-Protein (&quot;Beute&quot;) und einem Membranprotein (&quot;K&ouml;der&quot;) in lebenden Zellen. Zellen sind auf Micropatterned Oberfl&auml;chen, die Antik&ouml;rper gegen die K&ouml;der Exoplasmic Dom&auml;ne funktionalisierten beschichtet. K&ouml;der-Beute-Interaktionen sind &uuml;ber die Neuverteilung der fluoreszierenden Beute normalisiert. Die Methode zeichnet sich durch hohe Empfindlichkeit bis auf die Ebene einzelner Molek&uuml;le, die F&auml;higkeit zum Erkennen von schwachen Wechselwirkungen und hohen Durchsatz, so dass es als ein Screening-Tool anwendbar. Die Proof-of-Concept zeigt sich f&uuml;r die Interaktion zwischen CD4, eine gro&szlig;e Coreceptor in T-Zelle signalisieren, und Lck, eine Proteintyrosinkinase notwendig f&uuml;r fr&uuml;hen T-Zell-Signalisierung.

Nachweis von Protein-Protein Interaktionen in der live Zellenplasmamembrane von Beute Umverteilung auf K&ouml;der Micropatterning zu quantifizieren.

La nostra comprensione dei sistemi biologici complessi &egrave; basato su strumenti di proteomica di alta qualit&agrave; per il rilevamento parallelizzata e quantificazione delle interazioni della proteina. Attuali piattaforme di screening, tuttavia, si basano su misura le interazioni della proteina nei sistemi piuttosto artificiali, rendendo i risultati difficili da conferire sulla situazione in vivo. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per la progettazione e la costruzione di un sistema per rilevare e quantificare le interazioni tra una proteina fluoroforo (&quot;preda&quot;) e una proteina di membrana (&quot;esca&quot;) in cellule viventi. Le cellule sono placcate su superfici micropatterned funzionalizzate con anticorpi al dominio bait exoplasmic. Esca-preda interazioni sono analizzate tramite la ridistribuzione della preda fluorescente. Il metodo &egrave; caratterizzato da elevata sensibilit&agrave; fino a livello di singole molecole, la capacit&agrave; di rilevare le interazioni deboli e produttivit&agrave; elevata, rendendo applicabile come uno strumento di screening. Il proof-of-concept &egrave; dimostrata per l&#39;interazione tra CD4, un importante coreceptor nella segnalazione delle cellule T e Lck, una chinasi della tirosina della proteina essenziale per la segnalazione precoce T-cellulare.

Rilevamento delle interazioni della proteina-proteina nella membrana del plasma cellulare diretta da quantificando preda ridistribuzione su esca micropatterning.

&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x306E;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7406;&#x89E3;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x4E26;&#x5217;&#x5316;&#x691C;&#x51FA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9AD8;&#x54C1;&#x8CEA;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#xB7;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;in vivo&#x306E;&#x72B6;&#x6CC1;&#x3067;&#x306E;&#x5354;&#x8B70;&#x304C;&#x56F0;&#x96E3;&#x306A;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x30EC;&#x30F3;&#x30C0;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7684;&#x306A;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x9593;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x30C7;&#x30B6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x7372;&#x7269;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x990C;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x8A18;&#x8FF0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x990C;exoplasmic&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x3067;&#x5B98;&#x80FD;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306B;&#x30E1;&#x30C3;&#x30AD;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x990C; - &#x6355;&#x98DF;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x5206;&#x914D;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3001;&#x5F31;&#x3044;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3001;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x81F3;&#x308B;&#x307E;&#x3067;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x304C;&#x7279;&#x5FB4;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6982;&#x5FF5;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x306F;&#x3001;CD4 T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;Lck&#x304C;&#x3001;&#x521D;&#x671F;&#x306E;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306B;&#x5FC5;&#x9808;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D9;&#x30A4;&#x30C8;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x6642;&#x306B;&#x306F;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x518D;&#x914D;&#x5E03;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;

&#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC774;&#xD574; &#xBCD1;&#xB82C;&#xD654; &#xD0D0;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xD488;&#xC9C8; proteomics &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xD604;&#xC7AC; &#xC0C1;&#xC601; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xC0C1;&#xD669;&#xC5D0; &#xBD80;&#xC5EC; &#xD558;&#xAE30; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xB80C;&#xB354;&#xB9C1; &#xC624;&#xD788;&#xB824; &#xC778;&#xACF5; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xB514;&#xC790;&#xC778;&#xACFC; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558; &#xC5EC; fluorophore &#xB77C;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBA39;&#xC774;&quot;)&#xC640;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBBF8;&#xB07C;&quot;) &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xACC4;&#xB7C9; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xAC74;&#xC124;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C1;&#xC138;&#xD55C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC140; &#xBBF8;&#xB07C; exoplasmic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC640; functionalized micropatterned &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xAE08; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBBF8;&#xB07C; &#xBA39;&#xC774; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD615;&#xAD11; &#xBA39;&#xC774;&#xC758; &#xC7AC;&#xBD84;&#xBC30;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; &#xC57D;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBC0F; &#xD574;&#xB2F9; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB85C; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;&#xC744; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC774; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC218;&#xC900; &#xB192;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC758;&#xD574; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. CD4, T-&#xC138;&#xD3EC; &#xC2E0;&#xD638;&#xC5D0; &#xC8FC;&#xC694; coreceptor Lck, &#xCD08;&#xAE30; T &#xC138;&#xD3EC; &#xC2DC;&#xADF8;&#xB110;&#xB9C1;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC1C;&#xB150; &#xC99D;&#xBA85;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBBF8;&#xB07C; micropatterning &#xB530;&#xB77C; &#xBA39;&#xC774; &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC;&#xB97C; &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;.

Nuestra comprensi&#xF3;n de los complejos sistemas biol&#xF3;gicos se basa en herramientas de alta calidad prote&#xF3;mica para la detecci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n paralelizado de las interacciones prote&#xED;na. Plataformas actuales de detecci&#xF3;n, sin embargo, se basan en la medici&#xF3;n de las interacciones de prote&#xED;nas en los sistemas artificiales en lugar, haciendo que los resultados son dif&#xED;ciles de atribuir a la situaci&#xF3;n in vivo. Se describe aqu&#xED; un protocolo detallado para el dise&#xF1;o y la construcci&#xF3;n de un sistema para detectar y cuantificar las interacciones entre una prote&#xED;na marcada con fluor&#xF3;foro (&#x26;quot;presa&#x26;quot;) y una prote&#xED;na de membrana (&#x26;quot;carnada&#x26;quot;) en las c&#xE9;lulas vivas. Las c&#xE9;lulas se cultivaron sobre superficies micropatterned funcionalizados con anticuerpos contra el dominio cebo exoplasmic. Bait-presa se analizan las interacciones a trav&#xE9;s de la redistribuci&#xF3;n de la presa fluorescente. El m&#xE9;todo se caracteriza por una alta sensibilidad al nivel de mol&#xE9;culas individuales, la capacidad de detectar interacciones d&#xE9;biles, y un alto rendimiento, por lo que es aplicable como una herramienta de detecci&#xF3;n. La prueba de concepto se demuestra la interacci&#xF3;n entre los linfocitos CD4, un correceptores importante en la se&#xF1;alizaci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas T, y LCK, una prote&#xED;na tirosina quinasa esencial para primeros de c&#xE9;lulas T de se&#xF1;alizaci&#xF3;n.

La detecci&#xF3;n de interacciones prote&#xED;na-prote&#xED;na en la membrana de c&#xE9;lulas plasm&#xE1;ticas en vivo mediante la cuantificaci&#xF3;n de la redistribuci&#xF3;n presa en micropatterning Bait

&#x6211;&#x4EEC;&#x8C03;&#x67E5;&#x7684;&#x6D41;&#x52A8;&#x6027;&#x548C;&#x9636;&#x6BB5;&#x5212;&#x5206;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x6C27;&#x5316;&#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x6A21;&#x62DF; 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) &#x5728;&#x53D7;&#x652F;&#x6301;&#x7684;&#x8102;&#x53CC;&#x5C42;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4F20;&#x7EDF;&#x7684;&#x78F7;&#x8102; dihexadecanoylphosphoethanolamine (DHPE)-&#x80BE;&#x4E0A;&#x817A;&#x7D20;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x4E00;&#x76F4;&#x8F83;&#x9AD8;&#x7684;&#x6269;&#x6563;&#x5E38;&#x6570;&#x3002;&#x4E0D;&#x52A8;&#x969C;&#x788D;&#x88AB;&#x63D2;&#x5165;&#x5230;&#x53CC;&#x5C42;&#xFF0C;&#x672C;&#x8D28;&#x4E0A;&#x963B;&#x6B62; DHPE &#x80BE;&#x4E0A;&#x817A;&#x7D20;&#x7684;&#x6269;&#x6563;&#xFF0C;&#x4F46;&#x51E0;&#x4E4E;&#x4E0D;&#x53D7;&#x5F71;&#x54CD;&#x7684; PGPE Alexa647 &#x8FD0;&#x52A8;&#x65F6;&#xFF0C;&#x6210;&#x4E3A;&#x620F;&#x5267;&#x6027;&#x6548;&#x679C;&#x3002;&#x4E2D;&#x6240;&#x4F5C;&#x7684; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) &#x652F;&#x6301;&#x7684;&#x8102;&#x53CC;&#x5C42;&#xFF0C;&#x63A2;&#x9488;&#x6D41;&#x52A8;&#x6027;&#x4E0A;&#x7684;&#x5DEE;&#x5F02;&#x8D8B;&#x4E8E;&#x4E0E;&#x65E5;&#x76CA;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x542B;&#x91CF;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x7C97;&#x7C92;&#x5EA6;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x6A21;&#x62DF;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5F52;&#x4E8E;&#x6B64;&#x6548;&#x679C;&#x589E;&#x52A0;&#x6C27;&#x5316;&#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x548C;&#x819C;&#x77E9;&#x9635;&#xFF0C;&#x4F34;&#x5728;&#x6C27;&#x5316;&#x78F7;&#x8102;&#x7684;&#x5934;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x7684;&#x8F6C;&#x6362;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF1A; &#x96F6;&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x542B;&#x91CF;&#xFF0C;&#x5728;&#x5176;&#x5934;&#x8F6C;&#x79FB;&#x5230;&#x5916;&#x90E8;&#x7684; DOPC &#x5934;&#x533A;&#x57DF;&#xFF0C;&#x800C;&#x589E;&#x52A0;&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x6D53;&#x5EA6;&#x5C06;&#x5934;&#x62C9;&#x5165;&#x53CC;&#x5C42;&#x5E73;&#x9762;&#x3002;

&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x51CF;&#x6162;&#x7684;&#x6A2A;&#x5411;&#x6D41;&#x52A8;&#x6027;&#x652F;&#x6301;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x53CC;&#x5C42;&#x6C27;&#x5316;&#x78F7;&#x8102;&#x3002;

We investigated the mobility and phase-partitioning of the fluorescent oxidized phospholipid analogue 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) in supported lipid bilayers. Compared to the conventional phospholipid dihexadecanoylphosphoethanolamine (DHPE)-Bodipy we found consistently higher diffusion constants. The effect became dramatic when immobile obstacles were inserted into the bilayer, which essentially blocked the diffusion of DHPE-Bodipy but hardly influenced the movements of PGPE-Alexa647. In a supported lipid bilayer made of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), the differences in probe mobility leveled off with increasing cholesterol content. Using coarse-grained molecular dynamics simulations, we could ascribe this effect to increased interactions between the oxidized phospholipid and the membrane matrix, concomitant with a translation in the headgroup position of the oxidized phospholipid: at zero cholesterol content, its headgroup is shifted to the outside of the DOPC headgroup region, whereas increasing cholesterol concentrations pulls the headgroup into the bilayer plane.

Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.

Nous avons &#xE9;tudi&#xE9; la mobilit&#xE9; et la phase de partitionnement de l&#x26;#39;analogique phospholipide oxyd&#xE9; fluorescente 1-palmitoyl-2-glutaroyle-sn-glyc&#xE9;ro-3-phospho-N-Alexa647-&#xE9;thanolamine (PGPE-Alexa647) dans les bicouches lipidiques support&#xE9;es. Par rapport &#xE0; la dihexadecanoylphosphoethanolamine phospholipide classique (DHPE)-Bodipy nous avons trouv&#xE9; constantes de diffusion toujours plus &#xE9;lev&#xE9;s. L&#x26;#39;effet est devenu dramatique quand les obstacles immobiles ont &#xE9;t&#xE9; ins&#xE9;r&#xE9;s dans la bicouche, qui, essentiellement, ont bloqu&#xE9; la diffusion de DHPE-Bodipy mais &#xE0; peine influenc&#xE9; les mouvements de PGPE-Alexa647. Dans une bicouche lipidique support&#xE9;e en 1,2-diol&#xE9;oyl-sn-glyc&#xE9;ro-3-phosphocholine (DOPC), les diff&#xE9;rences en mati&#xE8;re de mobilit&#xE9; sonde stabilis&#xE9;e avec la teneur en cholest&#xE9;rol augmente. Utilisation grossiers simulations de dynamique mol&#xE9;culaire, nous avons pu attribuer cet effet &#xE0; des interactions accrues entre le phospholipide oxyd&#xE9; et la matrice de la membrane, concomitante avec une traduction dans la position groupe de t&#xEA;te du phospholipide oxyd&#xE9;: &#xE0; z&#xE9;ro le taux de cholest&#xE9;rol, de son groupe de t&#xEA;te se d&#xE9;place vers l&#x26;#39;ext&#xE9;rieur de la r&#xE9;gion DOPC groupe de t&#xEA;te, alors que l&#x26;#39;augmentation des concentrations de cholest&#xE9;rol tire le groupe de t&#xEA;te dans le plan bicouche.

Cholest&#xE9;rol ralentit la mobilit&#xE9; lat&#xE9;rale d&#x26;#39;un phospholipide oxyd&#xE9; dans une bicouche lipidique pris en charge

Wir untersuchten die Mobilit&auml;t und die Phase-Partitionierung der fluoreszierenden oxidierte Phospholipide analogen 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) in unterst&uuml;tzten Lipid-Doppelschichten. Im Vergleich zu den konventionellen Phospholipid-Dihexadecanoylphosphoethanolamine (DHPE)-Bodipy fanden wir durchweg h&ouml;here Verbreitung-Konstanten. Der Effekt wurde dramatisch, als unbewegliche Hemmnisse in der Bilayer eingef&uuml;gt wurden, die im Wesentlichen die Verbreitung der DHPE-Bodipy blockiert, aber kaum beeinflusst die Bewegungen der PGPE-Alexa647. In einem unterst&uuml;tzten Lipid-Bilayer hergestellt aus 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) die Unterschiede in der Sonde Mobilit&auml;t Sonnenhelligkeit mit zunehmenden Cholesteringehalt. Mit grobk&ouml;rnigen Molekulardynamik-Simulationen, konnten wir diesen Effekt f&uuml;hren, auf die erh&ouml;hte Interaktionen zwischen die oxidierte Phospholipide und die Membran-Matrix, damit einhergehende mit einer &Uuml;bersetzung in die Headgroup Position oxidierte Phospholipide: bei Null Cholesteringehalt, seine Headgroup an der Au&szlig;enseite der DOPC Headgroup Region, verschoben ist, w&auml;hrend erh&ouml;hen Cholesterin-Konzentrationen der Headgroup in die Bilayer-Ebene zieht.

Cholesterin verlangsamt die seitlichen Mobilit&auml;t eine oxidierte Phospholipide in einer unterst&uuml;tzten Lipid Bilayer.

Abbiamo studiato la mobilit&agrave; e la fase di partizionamento del fluorescente fosfolipidi ossidati analogo 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) in lipidici supportati. Rispetto alla dihexadecanoylphosphoethanolamine fosfolipide convenzionale (DHPE)-Bodipy abbiamo trovato costanti di diffusione sempre maggiore. L&#39;effetto &egrave; diventato drammatico quando ostacoli immobili sono stati inseriti nel doppio strato, che sostanzialmente bloccato la diffusione del DHPE-Bodipy ma difficilmente influenzato i movimenti di PGPE-Alexa647. In un doppio strato lipidico supportati di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), le differenze di mobilit&agrave; sonda livellata con maggiore contenuto di colesterolo. Utilizzando simulazioni dinamiche molecolari grossolana, potremmo attribuire questo effetto aumentato interazioni tra i fosfolipidi ossidati e la matrice della membrana, concomitante con una traduzione nella posizione dei fosfolipidi ossidati capigruppo: a zero contenuto di colesterolo, suoi capigruppo &egrave; spostato all&#39;esterno della regione DOPC capigruppo, mentre aumentando le concentrazioni di colesterolo tira i capigruppo nel piano doppio strato.

Colesterolo rallenta la mobilit&agrave; laterale di un fosfolipide ossidato in un doppio strato lipidico supportati.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x91CD;&#x5C64;&#x306E;&#x6D41;&#x52D5;&#x6027;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x30A2;&#x30CA;&#x30ED;&#x30B0;1-&#x30D1;&#x30EB;&#x30DF;&#x30C8;&#x30A4;&#x30EB;-2  - &#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30EB;-sn-&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30ED;-3  - &#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;-N-Alexa647-&#x30A8;&#x30BF;&#x30CE;&#x30FC;&#x30EB;&#x30A2;&#x30DF;&#x30F3;&#x306E;&#x76F8;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30B7;&#x30E7;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#xFF08;PGPE-Alexa647&#xFF09;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;dihexadecanoylphosphoethanolamine&#xFF08;DHPE&#xFF09;BODIPY&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4E00;&#x8CAB;&#x3057;&#x3066;&#x9AD8;&#x3044;&#x62E1;&#x6563;&#x5B9A;&#x6570;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x52D5;&#x304B;&#x306A;&#x3044;&#x969C;&#x5BB3;&#x7269;&#x304C;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306B;DHPE-BODIPY&#x306E;&#x62E1;&#x6563;&#x3092;&#x963B;&#x6B62;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;PGPE-Alexa647&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x306A;&#x3044;&#x4E8C;&#x91CD;&#x5C64;&#x306B;&#x633F;&#x5165;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x5287;&#x7684;&#x3068;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 1,2  - &#x30B8;&#x30AA;&#x30EC;&#x30AA;&#x30A4;&#x30EB;-sn-&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30ED;-3  - &#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30B3;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF08;DOPC&#xFF09;&#x3067;&#x4F5C;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x91CD;&#x5C64;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x79FB;&#x52D5;&#x306E;&#x9055;&#x3044;&#x306F;&#x3001;&#x5897;&#x52A0;&#x3001;&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x542B;&#x6709;&#x91CF;&#x3067;&#x6A2A;&#x3070;&#x3044;&#x3002;&#x7C97;&#x8996;&#x5316;&#x5206;&#x5B50;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x6975;&#x6027;&#x57FA;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306E;&#x7FFB;&#x8A33;&#x3068;&#x306E;&#x4F75;&#x7528;&#x3001;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x3068;&#x819C;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x5E30;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3082;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BC;&#x30ED;&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x542B;&#x91CF;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x6975;&#x6027;&#x57FA;&#x304C;&#x5916;&#x5074;&#x306B;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;DOPC&#x6975;&#x6027;&#x57FA;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;&#x3001;&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x4E00;&#x65B9;&#x3001;&#x4E8C;&#x91CD;&#x5C64;&#x5E73;&#x9762;&#x306B;&#x6975;&#x6027;&#x57FA;&#x3092;&#x53D6;&#x5F97;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306F;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x5206;&#x5B50;&#x819C;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x9178;&#x5316;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x6A2A;&#x65B9;&#x5411;&#x306E;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x9045;&#x304F;&#x3059;&#x308B;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xB3D9;&#xC131; &#xBC0F; &#xD615;&#xAD11; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; &#xC544;&#xB0A0;&#xB85C;&#xADF8; 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647)&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xB418;&#xB294; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayers&#xC758; &#xC704;&#xC0C1; &#xBD84;&#xD560; &#xC870;&#xC0AC;. &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; dihexadecanoylphosphoethanolamine (DHPE)&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574;-Bodipy &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC77C;&#xAD00; &#xB418; &#xAC8C; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xD655;&#xC0B0; &#xC0C1;&#xC218;&#xB97C; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC774;&#xAE30; &#xD798; &#xB4DC;&#xB294; &#xC7A5;&#xC560;&#xBB3C; bilayer &#xBCF8;&#xC9C8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; DHPE Bodipy&#xC758; &#xBCF4;&#xAE09;&#xC744; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xAC70;&#xC758; PGPE alexa647&#xC758; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC784;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xD558;&#xB294;&#xC5D0; &#xC0BD;&#xC785; &#xB41C; &#xB54C; &#xD6A8;&#xACFC; &#xADF9;&#xC801;&#xC778; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)&#xC758; &#xC81C;&#xC791; &#xC9C0;&#xC6D0;&#xB41C; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayer, &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xC774;&#xB3D9;&#xC131;&#xC758; &#xCC28;&#xC774; &#xC99D;&#xAC00; &#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864; &#xCF58;&#xD150;&#xCE20;&#xB85C; &#xD3C9;&#xC900;&#xD654;. &#xC131;&#xAE34; &#xBD84;&#xC790; &#xC5ED;&#xD559; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8;&#xACFC; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; headgroup &#xC704;&#xCE58;&#xC5D0; &#xBC88;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xC218; &#xBC18;&#xD558;&#xB294; &#xB9C9; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xC0AC;&#xC774; &#xC99D;&#xAC00; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744;&#xC774; &#xD6A8;&#xACFC; &#xB3CC;&#xB9AC;&#xB2E4; &#xC218;: &#xC81C;&#xB85C; &#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864; &#xB0B4;&#xC6A9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; headgroup &#xC774;&#xB3D9; &#xD558; &#xAC8C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; DOPC headgroup &#xC601;&#xC5ED;&#xC758; &#xC678;&#xBD80; bilayer &#xD3C9;&#xBA74;&#xC5D0;&#xB294; headgroup&#xB97C; &#xB04C;&#xC5B4; &#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864; &#xB18D;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74;.

&#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864; &#xC9C0;&#xC6D0;&#xB41C; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayer&#xC5D0; &#xC0B0;&#xD654; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8;&#xC758; &#xCE21;&#xBA74; &#xC774;&#xB3D9; &#xC18D;&#xB3C4;&#xAC00; &#xB290;&#xB824;&#xC9D1;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Hemos investigado la movilidad y la fase-particionamiento del an&#xE1;logo de fosfol&#xED;pido fluorescente oxidado 1-palmitoil-2-glutaroyl-sn-glicero-3-fosfato-N-Alexa647-etanolamina (PGPE-Alexa647) en bicapas lip&#xED;dicas soportadas. En comparaci&#xF3;n con el fosfol&#xED;pido dihexadecanoylphosphoethanolamine convencional (DHPE)-Bodipy hemos encontrado consistentemente m&#xE1;s altos constantes de difusi&#xF3;n. El efecto fue dram&#xE1;tico cuando los obst&#xE1;culos inm&#xF3;viles fueron insertadas en la bicapa, que esencialmente bloqueado la difusi&#xF3;n de DHPE-Bodipy pero apenas influy&#xF3; en los movimientos de PGPE-Alexa647. En una bicapa lip&#xED;dica apoyado hecha de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), las diferencias en la movilidad de la sonda se nivel&#xF3; con contenido de colesterol en aumento. Uso de grano grueso simulaciones de din&#xE1;mica molecular, se podr&#xED;a atribuir este efecto a las interacciones entre el aumento de la fosfol&#xED;pido oxidado y la matriz de la membrana, concomitante con una traducci&#xF3;n en la posici&#xF3;n de grupo de cabeza del fosfol&#xED;pido oxidado: contenido de colesterol en cero, su grupo de cabeza se desplaza hacia el exterior de la regi&#xF3;n DOPC grupo de cabeza, mientras que aumentando las concentraciones de colesterol tira del grupo de cabeza en el plano bicapa.

El colesterol ralentiza la movilidad lateral de un fosfol&#xED;pidos oxidados en una bicapa lip&#xED;dica compatibles

&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x865A;&#x62DF;&#x542B;&#x6709;&#x7EB3;&#x7C73;&#x8102;&#x8D28;&#x5E73;&#x53F0;&#xFF0C;&#x90FD;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x4E86;&quot;&#x8102;&#x7B4F;&quot;&#x6216;&quot;&#x819C;&#x6392;&quot;&#x3002;&#x57FA;&#x4E8E;&#x751F;&#x7269;&#x5316;&#x5B66;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x9C7C;&#x6392;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x5728;&#x8BB8;&#x591A;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4F20;&#x8F93;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x7740;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x76EE;&#x524D;&#x4E0D;&#x591A;&#x7684;&#x5927;&#x5C0F;&#x3001; &#x5F62;&#x72B6;&#x3001; &#x7A33;&#x5B9A;&#x6027;&#x3001; &#x8868;&#x9762;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x3001; &#x7EC4;&#x6210;&#x548C;&#x975E;&#x5747;&#x8D28;&#x6027;&#x7684;&#x4FE1;&#x606F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x5EA7;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5B83;&#x5141;&#x8BB8;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x76F4;&#x63A5;&#x6210;&#x50CF;&#x4E2D;&#x7EB3;&#x7C73;&#x7684;&#x957F;&#x5BFF;&#x5E73;&#x53F0;&#x4E0E;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x5F25;&#x6563;&#x7684;&#x7B4F;&#x677F;&#x6837;&#x5C5E;&#x6027;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x611F;&#x77E5;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5E73;&#x53F0;&#x7531;&#x5176;&#x5C5E;&#x6027;&#x6765;&#x805A;&#x96C6;&#x5728;&#x79D2;&#x65F6;&#x95F4;&#x523B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6216;&#x8102;&#x7C7B;&#x7684;&#x7279;&#x6027;&#x96C6;&#x3002;&#x4E00;&#x79CD;&#x7279;&#x6B8A;&#x7684;&#x5149;&#x6F02;&#x767D;&#x534F;&#x8BAE;&#x88AB;&#x7528;&#x6765;&#x6807;&#x8BB0;&#x79FB;&#x52A8;&#x5E73;&#x53F0;&#x4E0B;&#x5BF9;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E95;&#x5B64;&#x7ACB;&#x7684;&#x884D;&#x5C04;&#x6781;&#x9650;&#x70B9;&#x7684;&#x8868;&#x9762;&#x7684;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x964D;&#x4F4E;&#x800C;&#x4E0D;&#x6539;&#x53D8;&#x5355;&#x70B9;&#x4EAE;&#x5EA6;&#x3002;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x5E73;&#x53F0;&#x7684;&#x63A2;&#x9488;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x7EDF;&#x8BA1;&#x5206;&#x5E03;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x4EAE;&#x5EA6;&#x5206;&#x6790;&#x786E;&#x5B9A;&#x3002;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x6F14;&#x793A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x5171;&#x8BC6;&#x7B4F;&#x6807;&#x8BB0;&#x808C;&#x9187;&#x5355;&#x4F53;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x8367;&#x5149;&#x8102;&#x8D28;&#x6A21;&#x62DF; BODIPY-G(M1)&#xFF0C;&#x4F18;&#x5148;&#x7EB3;&#x5165;&#x5206;&#x533A;&#x6DB2;&#x4F53;&#x5E8F;&#x9636;&#x6BB5;&#x3002;&#x4E3A;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6807;&#x8BB0;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x7684;&#x751F;&#x6D3B;&#x4E2D;&#x627E;&#x5230;&#x4E86;&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x4F9D;&#x8D56;&#x76F4;&#x7ACB;&#x4EBA;&#x534F;&#x4F1A; CHO &#x548C; Jurkat T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F11;&#x7720;&#x72B6;&#x6001;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x8868;&#x660E;&#x5C0F;&#x3001; &#x79FB;&#x52A8;&#x3001; &#x957F;&#x5BFF;&#x5E73;&#x53F0;&#x5305;&#x542B;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x6280;&#x672F;&#x5E94;&#x7528;&#x4E8E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x66F4;&#x6539;&#x5730;&#x5740;&#x5728;&#x53D1;&#x70ED;&#x578B;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x671F;&#x95F4;&#xFF1A; &#x5728;&#x6E29;&#x5EA6;&#x5347;&#x9AD8;&#xFF0C;&#x808C;&#x9187;&#x5355;&#x4F53; GFP &#x76F4;&#x7ACB;&#x4EBA;-&#x534F;&#x4F1A;&#x6D88;&#x5931;&#xFF0C;&#x4F34;&#x968F;&#x7740;&#x5C0F;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x86CB;&#x767D;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x86CB;&#x767D; 27 &#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;

&#x79FB;&#x52A8;&#x957F;&#x5BFF; nanoplatforms &#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x5F71;&#x50CF;&#x3002;

The plasma membrane has been hypothesized to contain nanoscopic lipid platforms, which are discussed in the context of "lipid rafts" or "membrane rafts." Based on biochemical and cell biological studies, rafts are believed to play a crucial role in many signaling processes. However, there is currently not much information on their size, shape, stability, surface density, composition, and heterogeneity. We present here a method that allows for the first time the direct imaging of nanoscopic long-lived platforms with raft-like properties diffusing in the live cell plasma membrane. Our method senses these platforms by their property to assemble a characteristic set of fluorescent marker proteins or lipids on a time scale of seconds. A special photobleaching protocol was used to reduce the surface density of labeled mobile platforms down to the level of well isolated diffraction-limited spots without altering the single spot brightness. The statistical distribution of probe molecules per platform was determined by single molecule brightness analysis. For demonstration, we used the consensus raft marker glycosylphosphatidylinositol-anchored monomeric GFP and the fluorescent lipid analog BODIPY-G(M1), which preferentially partitions into liquid-ordered phases. For both markers, we found cholesterol-dependent homo-association in the plasma membrane of living CHO and Jurkat T cells in the resting state, thereby demonstrating the existence of small, mobile, long-lived platforms containing these probes. We further applied the technology to address structural changes in the plasma membrane during fever-type heat shock: at elevated temperatures, the glycosylphosphatidylinositol-anchored monomeric GFP homo-association disappeared, accompanied by an increase in the expression of the small heat shock protein Hsp27.

Imaging of mobile long-lived nanoplatforms in the live cell plasma membrane.

La membrane plasmique a &#xE9;t&#xE9; &#xE9;mis l&#x26;#39;hypoth&#xE8;se que contiennent les plates-formes lipidiques nanoscopiques, qui sont examin&#xE9;es dans le contexte de &#xAB;radeaux lipidiques&#xBB; ou &#xAB;radeaux membranaires.&#x26;quot; Bas&#xE9; sur des &#xE9;tudes biochimiques et cellulaires biologiques, radeaux sont cens&#xE9;es jouer un r&#xF4;le crucial dans de nombreux processus de signalisation. Cependant, il n&#x26;#39;existe actuellement pas beaucoup d&#x26;#39;informations sur leur taille, la forme, la stabilit&#xE9;, la densit&#xE9; de surface, la composition, et de l&#x26;#39;h&#xE9;t&#xE9;rog&#xE9;n&#xE9;it&#xE9;. Nous pr&#xE9;sentons ici une m&#xE9;thode qui permet pour la premi&#xE8;re fois l&#x26;#39;imagerie directe de nanoscopiques longue dur&#xE9;e de vie plates-formes avec radeau-comme propri&#xE9;t&#xE9;s de diffusion dans la membrane plasmique des cellules vivantes. Nos sens m&#xE9;thode ces plates-formes par leur propri&#xE9;t&#xE9; pour assembler un ensemble caract&#xE9;ristique de prot&#xE9;ines marqueurs fluorescents ou des lipides sur une &#xE9;chelle de temps de quelques secondes. Un protocole photoblanchiment sp&#xE9;ciale a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9; pour r&#xE9;duire la densit&#xE9; de surface de plates-formes mobiles marqu&#xE9;s jusqu&#x26;#39;au niveau de puits isol&#xE9; limit&#xE9; par diffraction des taches sans modifier la luminosit&#xE9; tache unique. La distribution statistique des mol&#xE9;cules sondes par plate-forme a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;termin&#xE9;e par analyse mol&#xE9;cule luminosit&#xE9; unique. Pour la d&#xE9;monstration, nous avons utilis&#xE9; le radeau marqueur consensus glycosylphosphatidylinositol ancr&#xE9;e GFP monom&#xE8;re et l&#x26;#39;analogue lipidique fluorescente BODIPY-G (M1), qui pr&#xE9;f&#xE9;rentiellement partitions en liquide phases ordonn&#xE9;es. Pour les deux marqueurs, nous avons trouv&#xE9; le taux de cholest&#xE9;rol-d&#xE9;pendante l&#x26;#39;homo-association dans la membrane plasmique de la vie CHO et Jurkat cellules T dans l&#x26;#39;&#xE9;tat de repos, ce qui d&#xE9;montre l&#x26;#39;existence de petits, mobiles, &#xE0; long terme les plates-formes contenant ces sondes. Nous avons en outre appliqu&#xE9; la technologie pour r&#xE9;pondre aux changements structurels dans la membrane plasmique au cours du choc de la chaleur la fi&#xE8;vre de type: &#xE0; des temp&#xE9;ratures &#xE9;lev&#xE9;es, la GFP glycosylphosphatidylinositol ancr&#xE9;e monom&#xE8;re homo-association a disparu, accompagn&#xE9;e d&#x26;#39;une augmentation de l&#x26;#39;expression des Hsp27 chaleur petites prot&#xE9;ines de choc.

Imagerie des mobiles de longue dur&#xE9;e Nanoplatforms dans la membrane plasmique de cellules vivantes

Die Plasmamembran hat theoretisiert worden, um nanoskopische Lipid-Plattformen enthalten, die im Rahmen der &quot;Lipid Rafts&quot; oder &quot;Membran Fl&ouml;&szlig;en.&quot; erl&auml;utert werden Basierend auf biochemische und biologische Zelle Studien, Fl&ouml;&szlig;e werden geglaubt, um in vielen Signalling Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. Allerdings gibt es derzeit nicht viele Informationen &uuml;ber ihre Gr&ouml;&szlig;e, Form, Stabilit&auml;t, Oberfl&auml;chendichte, Zusammensetzung und Heterogenit&auml;t. Wir stellen Ihnen hier eine Methode, die es zum ersten Mal direkte nanoskopische langlebige Plattformen mit Flo&szlig;-&auml;hnliche Eigenschaften in der live Zellenplasmamembrane Verbreitung erlaubt. Unsere Methode sp&uuml;rt diese Plattformen durch ihre Eigenschaft, um eine charakteristische Reihe von fluoreszierenden Markierung Proteine oder Lipide auf einer Zeitskala von Sekunden zu montieren. Eine spezielle Photobleaching-Protokoll wurde verwendet, um die Oberfl&auml;chendichte beschriftete mobilen Plattformen bis auf die Ebene der gut isolierte Beugung begrenzte Flecken zu reduzieren, ohne die einzelne vor Ort Helligkeit zu ver&auml;ndern. Die statistische Verteilung der Sonde Molek&uuml;le pro Plattform wurde durch Einzelmolek&uuml;l-Helligkeit-Analyse bestimmt. Demonstration verwendeten wir den Konsens-Raft-Marker Glykosylphosphatidyl verankerte Monomer GFP und der fluoreszierenden Lipid analoge BODIPY-G(M1), die bevorzugt in Partitionen Fl&uuml;ssigkeit geordnete Phasen. F&uuml;r beide Markierungen, fanden wir Cholesterin-abh&auml;ngige Homo-Vereinigung in der Plasmamembran Leben CHO und Jurkat T-Zellen in den Ruhezustand, damit demonstrieren die Existenz von kleinen, mobilen, langlebige Plattformen, enth&auml;lt diese Pr&uuml;fpunkte. Wir weiter die Technologie zu Adresse Strukturver&auml;nderungen in der Plasmamembran w&auml;hrend Fieber-Typ Hitzeschock angewendet: bei erh&ouml;hten Temperaturen, Glykosylphosphatidyl verankerte Monomer GFP Homo-Vereins verschwand, begleitet von einer Zunahme der Ausdruck das kleine Hitze-Schock-Protein Hsp27.

Bildgebung der mobilen langlebigen Nanoplatforms in der live Zellenplasmamembrane.

La membrana del plasma &egrave; stata ipotizzata per contenere nanoscopica piattaforme di lipidi, che sono discussi nel contesto delle &quot;zattere lipidiche&quot; o &quot;membrana zattere.&quot; Basata sulla biochimica e si ritiene che gli studi biologici cellulari, zattere giocano un ruolo cruciale in molti processi di segnalazione. Tuttavia, non c&#39;&egrave; attualmente molte informazioni sulla loro dimensione, forma, stabilit&agrave;, densit&agrave; della superficie, composizione ed eterogeneit&agrave;. Vi presentiamo qui un metodo che permette per la prima volta l&#39;acquisizione diretta di nanoscopica longevi piattaforme con zattera-come propriet&agrave; diffonde nella membrana di plasma delle cellule dal vivo. Il nostro metodo rileva queste piattaforme di loro propriet&agrave; per assemblare un insieme caratteristico di proteine marker fluorescente o lipidi su una scala di tempo di secondi. Un protocollo speciale photobleaching &egrave; stato utilizzato per ridurre la densit&agrave; superficiale di piattaforme mobili con etichette fino al livello delle macchie di diffrazione limitata ben isolati senza alterare la luminosit&agrave; posto singola. La distribuzione statistica delle molecole sonda per ogni piattaforma &egrave; stata determinata mediante analisi di luminosit&agrave; di singola molecola. Per la dimostrazione, abbiamo usato il marcatore di consenso zattera ancorata glicosilfosfatidilinositolo monomerico GFP e i lipidi fluorescenti BODIPY-G(M1) analogico, che preferenzialmente le partizioni in liquido-ordinato fasi. Per entrambi gli indicatori, abbiamo trovato homo-associazione colesterolo-dipendenti nella membrana del plasma di vivere cellule CHO e Jurkat T in stato di riposo, dimostrando quindi l&#39;esistenza di piattaforme piccole, mobili, longevi, contenente queste sonde. Ulteriormente abbiamo applicato la tecnologia ai cambiamenti strutturali indirizzo nella membrana del plasma durante la scossa di calore febbre-tipo: a temperature elevate, ancorata glicosilfosfatidilinositolo monomerico GFP homo-associazione scomparve, accompagnato da un aumento nell&#39;espressione della proteina shock termico piccolo Hsp27.

Imaging del mobile nanoplatforms longevo nella membrana di plasma delle cellule dal vivo.

&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306F; &#x26;quot;&#x8102;&#x8CEA;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x26;quot;&#x3084;&#x306E;&#x6587;&#x8108;&#x3067;&#x8B70;&#x8AD6;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30CA;&#x30CE;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;&#x4EEE;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B; &#x26;quot;&#x819C;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x3092;&#x3002;&#x26;quot;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7D30;&#x80DE;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x306F;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x904E;&#x7A0B;&#x306B;&#x304A;&#x3044;&#x3066;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3059;&#x3068;&#x8003;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x3001;&#x5F62;&#x72B6;&#x3001;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x3001;&#x8868;&#x9762;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x3001;&#x7D44;&#x6210;&#x3001;&#x5747;&#x8CEA;&#x6027;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x60C5;&#x5831;&#x306F;&#x73FE;&#x5728;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x521D;&#x3081;&#x3066;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x306B;&#x62E1;&#x6563;&#x3044;&#x304B;&#x3060;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x30CA;&#x30CE;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x5BFF;&#x547D;&#x306E;&#x9577;&#x3044;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x611F;&#x77E5;&#x79D2;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30EB;&#x3067;&#x86CD;&#x5149;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3084;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;&#x3067;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3002;&#x7279;&#x6B8A;&#x306A;&#x5149;&#x9000;&#x8272;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30B9;&#x30DD;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x660E;&#x308B;&#x3055;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x3088;&#x304F;&#x9694;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x56DE;&#x6298;&#x9650;&#x754C;&#x306E;&#x30B9;&#x30DD;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306B;&#x6A19;&#x8B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30E2;&#x30D0;&#x30A4;&#x30EB;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x9762;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x3092;&#x4F4E;&#x6E1B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3054;&#x3068;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x7D71;&#x8A08;&#x7684;&#x5206;&#x5E03;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x660E;&#x308B;&#x3055;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C7;&#x30E2;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x6DB2;&#x4F53;&#x79E9;&#x5E8F;&#x76F8;&#x306B;BODIPY-G&#xFF08;M1&#xFF09;&#x3001;&#x512A;&#x200B;&#x200B;&#x5148;&#x7684;&#x306B;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30B9;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x306E;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x30B0;&#x30EA;&#x200B;&#x200B;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB;&#x30A2;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;&#x578B;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;GFP&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x8102;&#x8CEA;&#x30A2;&#x30CA;&#x30ED;&#x30B0;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3001;&#x5C0F;&#x578B;&#x30E2;&#x30D0;&#x30A4;&#x30EB;&#x3001;&#x5BFF;&#x547D;&#x306E;&#x9577;&#x3044;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3001;&#x9759;&#x6B62;&#x72B6;&#x614B;&#x3067;&#x751F;&#x304D;&#x3066;&#x3044;&#x308B;CHO&#x304A;&#x3088;&#x3073;Jurkat T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306B;&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x306E;&#x30DB;&#x30E2;&#x95A2;&#x9023;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x767A;&#x71B1;&#x578B;&#x71B1;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x6642;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x5909;&#x5316;&#x306B;&#x5BFE;&#x51E6;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6280;&#x8853;&#x3092;&#x5FDC;&#x7528;&#xFF1A;&#x9AD8;&#x6E29;&#x3067;&#x3001;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB;&#x30A2;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;&#x578B;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;&#x306E;GFP&#x30DB;&#x30E2;&#x5354;&#x4F1A;&#x306F;&#x3001;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x71B1;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;HSP27&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x4F34;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6D88;&#x5931;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x306E;&#x30E2;&#x30D0;&#x30A4;&#x30EB;&#x9577;&#x671F;&#x6027;Nanoplatforms&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;

&#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xD3EC;&#xD568; &quot;&#xC9C0;&#xC9C8; &#xB5CF;&#xBAA9;&quot; &#xB610;&#xB294; &quot;&#xB9C9; &#xB5CF;&#xBAA9;&quot;&#xC758; &#xB9E5;&#xB77D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC124;&#xBA85; &#xD558;&#xB294; &#xC804;&#xCCB4; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC5D0; &#xAC00;&#xC124; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0DD;&#xD654;&#xD559; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559; &#xC5F0;&#xAD6C;, &#xB5CF;&#xBAA9; &#xB9CE;&#xC740; &#xC2E0;&#xD638; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD560; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xCD94;&#xC815; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xAC70;&#xAE30;&#xB294; &#xD604;&#xC7AC; &#xC5C6;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xD06C;&#xAE30;, &#xBAA8;&#xC591;, &#xC548;&#xC815;&#xC131;, &#xD45C;&#xBA74; &#xBC00;&#xB3C4;, &#xC870;&#xC131;, &#xBC0F;&#xC774; &#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB9CE;&#xC740; &#xC815;&#xBCF4;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC120;&#xBB3C;&#xC774; &#xC5EC;&#xAE30; &#xBC29;&#xBC95; &#xCC98;&#xC74C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC804;&#xCCB4; &#xC9C1;&#xC811; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xC218;&#xBA85;&#xC774; &#xAE34; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD655;&#xC0B0; &#xB5CF;&#xBAA9; &#xAC19;&#xC740; &#xC18D;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xCD08;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04; &#xAC04;&#xACA9;&#xC5D0; &#xD615;&#xAD11; &#xB9C8;&#xCEE4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC774;&#xB098; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC131; &#xC9D1;&#xD569;&#xC744; &#xAD6C;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC7AC;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC744; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xBCC4; &#xD55C; photobleaching &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC790;&#xB9AC; &#xBC1D;&#xAE30;&#xB97C; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xC798; &#xACA9;&#xB9AC; &#xB41C; &#xD68C;&#xC808; &#xC81C;&#xD55C; &#xB41C; &#xAD00;&#xAD11; &#xBA85;&#xC18C;&#xC758; &#xC218;&#xC900;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xC9C0;&#xC815; &#xB41C; &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC758; &#xD45C;&#xBA74; &#xBC00;&#xB3C4; &#xC904;&#xC774;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC; &#xB2F9; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xD1B5;&#xACC4; &#xBD84;&#xD3EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xBC1D;&#xAE30; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xACB0;&#xC815; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD569;&#xC758; &#xB5CF;&#xBAA9; &#xB9C8;&#xCEE4; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB370;&#xBAA8; monomeric GFP glycosylphosphatidylinositol &#xACE0;&#xC815; &#xBC0F; &#xD615;&#xAD11; &#xC9C0;&#xC9C8;&#xC73C;&#xB85C; &#xBD84;&#xD560; &#xC6B0;&#xC120;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC544;&#xB0A0;&#xB85C;&#xADF8; BODIPY-G(M1) &#xC561;&#xCCB4;-&#xC8FC;&#xBB38; &#xB2E8;&#xACC4;. &#xB450; &#xD45C;&#xC2DD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC0DD;&#xD65C;&#xC758; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864; &#xC885;&#xC18D; &#xD638;&#xBAA8; &#xD611;&#xD68C;&#xB97C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368;&#xC774; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC791;&#xC740;, &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C;, &#xC218;&#xBA85;&#xC774; &#xAE34; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xB97C; &#xC785;&#xC99D; &#xD558;&#xB294; &#xD734;&#xC2DD; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC870;&#xACFC; Jurkat T &#xC138;&#xD3EC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB354; &#xC5F4;&#xC774; &#xD615; &#xC5F4; &#xCDA9;&#xACA9; &#xC911; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC758; &#xC8FC;&#xC18C; &#xAD6C;&#xC870; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xC801;&#xC6A9;: &#xB192;&#xC740; &#xC628;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; glycosylphosphatidylinositol &#xACE0;&#xC815; monomeric GFP &#xD638;&#xBAA8;-&#xD611;&#xD68C; &#xC0AC;&#xB77C;&#xC84C;&#xB2E4;, &#xC791;&#xC740; &#xC5F4; &#xCDA9;&#xACA9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; Hsp27 &#xC2DD;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; &#xD568;&#xAED8;.

&#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C; &#xC218;&#xBA85;&#xC774; &#xAE34; nanoplatforms&#xC758; &#xC601;&#xC0C1;.

La membrana plasm&#xE1;tica ha planteado la hip&#xF3;tesis de contener las plataformas nanosc&#xF3;picas de l&#xED;pidos, que se discuten en el contexto de &#x26;quot;balsas lip&#xED;dicas&#x26;quot; o &#x26;quot;balsas de membrana&#x26;quot;. Con base en estudios bioqu&#xED;micos y de biolog&#xED;a celular, las balsas se cree que desempe&#xF1;an un papel crucial en muchos procesos de se&#xF1;alizaci&#xF3;n. Sin embargo, actualmente no hay mucha informaci&#xF3;n sobre su tama&#xF1;o, forma, la estabilidad, la densidad de superficie, la composici&#xF3;n, y la heterogeneidad. En este trabajo presentamos un m&#xE9;todo que permite por primera vez la proyecci&#xF3;n de imagen directa de nanosc&#xF3;picas de larga duraci&#xF3;n, con plataformas como la balsa propiedades de difusi&#xF3;n en la membrana de c&#xE9;lulas plasm&#xE1;ticas en vivo. Nuestros sentidos m&#xE9;todo de estas plataformas por parte de sus bienes para reunir un conjunto caracter&#xED;stico de prote&#xED;nas marcadoras fluorescentes o l&#xED;pidos en una escala de tiempo de segundos. Un protocolo fotoblanqueo especial se utiliza para reducir la densidad superficial de la etiqueta plataformas m&#xF3;viles hasta el nivel de bien aisladas limitadas por difracci&#xF3;n manchas sin alterar el brillo sola mancha. La distribuci&#xF3;n estad&#xED;stica de mol&#xE9;culas de la sonda por la plataforma se determin&#xF3; mediante an&#xE1;lisis sola mol&#xE9;cula brillo. Para la demostraci&#xF3;n, se utiliz&#xF3; la balsa consenso marcador glicosilfosfatidilinositol anclada a las buenas pr&#xE1;cticas agrarias y el an&#xE1;logo monom&#xE9;rico l&#xED;pidos fluorescentes BODIPY-G (M1), que preferentemente las particiones en el l&#xED;quido ordenadas por fases. Para los dos marcadores, encontramos colesterol dependen de la homo-asociaci&#xF3;n en la membrana plasm&#xE1;tica de la vida CHO y c&#xE9;lulas Jurkat T en el estado de reposo, lo que demuestra la existencia de peque&#xF1;as y m&#xF3;viles, plataformas de larga duraci&#xF3;n que contienen estas sondas. Se aplica adem&#xE1;s la tecnolog&#xED;a para hacer frente a cambios estructurales en la membrana plasm&#xE1;tica durante el choque t&#xE9;rmico fiebre de tipo: a temperaturas elevadas, la GFP monom&#xE9;rico glicosilfosfatidilinositol anclada a la homo-asociaci&#xF3;n desapareci&#xF3;, acompa&#xF1;ado por un aumento en la expresi&#xF3;n de las Hsp27 de calor peque&#xF1;as prote&#xED;nas de choque.

Obtenci&#xF3;n de im&#xE1;genes de m&#xF3;viles de larga duraci&#xF3;n Nanoplatforms en la membrana de c&#xE9;lulas plasm&#xE1;ticas en vivo

&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x6297;&#x83CC;&#x80BD; (&#x8425;&#x5730;) &#x6709;&#x9009;&#x62E9;&#x5730;&#x901A;&#x8FC7;&#x9759;&#x7535;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x8D1F;&#x7535;&#x8377;&#x8840;&#x8102;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0E;&#x76EE;&#x6807;&#x7EC6;&#x83CC;&#x819C;&#x3002;&#x539F;&#x6765;&#xFF0C;&#x6291;&#x5236;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x751F;&#x957F;&#x9AD8;&#x8425;&#x819C;&#x6D53;&#x5EA6;&#x662F;&#x5FC5;&#x9700;&#x7684;&#x5C06;&#x5185;&#x80BD;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x56E2;&#x4F53;&#x90FD;&#x80FD;&#x5B9E;&#x73B0;&#x7684;&#x3002;&#x589E;&#x52A0;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86;&#x5BF9;&#x771F;&#x6838;&#x4E3B;&#x673A;&#x819C;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x9020;&#x6210;&#x6709;&#x5BB3;&#x526F;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x98CE;&#x9669;&#x5BF9;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7684;&#x8425;&#x5730;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x5982;&#x4F55;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x4E24;&#x4EB2;&#x6027;&#x80BD;-&#x5728;&#x7279;&#x5B9A;&#x8425;&#x4E0E;&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;-&#x4EAE;&#x6C28;&#x9178;-&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x91CD;&#x590D; &#xFF08;&#x79F0;&#x4E3A;&#x7684; KLK&#xFF09;-&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x548C;&#x771F;&#x6838;&#x819C;&#x4E2D;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x7532;&#x7531;&#x9759;&#x7535;&#x4EA4;&#x4E92;&#x8D1F;&#x7535;&#x8377;&#x7684;&#x553E;&#x6DB2;&#x9178;&#x5076;&#x6709;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x5730;&#x6291;&#x5236;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x8102;&#x7C7B;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5206;&#x7EC4;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x8D85;&#x5FAE;&#x7ED3;&#x6784;&#x8868;&#x5F81;&#x900F;&#x9732;&#x819C; invaginations &#x4EE3;&#x8868;&#x88C2;&#x53D8;&#x6216;&#x805A;&#x53D8;&#x7684;&#x4E2D;&#x95F4;&#x4F53;&#xFF0C;sialylated &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x8102;&#x7C7B;&#x88AB;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E0D;&#x540C;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x4E24;&#x4EB2;&#x6027;&#x80BD; &#xFF08;KLK&#xFF0C;6-MO-LF11-322 &#x548C; NK14-2&#xFF09; &#x8868;&#x793A;&#x6709;&#x9009;&#x62E9;&#x5730;&#x902E;&#x6355; sialylated &#x819C;&#x6210;&#x5206;&#x7684;&#x9759;&#x7535;&#x548C;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x90E8;&#x961F;&#x5408;&#x4F5C;&#x3002;

&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x4E24;&#x4EB2;&#x6027;&#x591A;&#x80BD;&#x79EF;&#x7D2F;&#x7684; sialylated &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x8102;&#x7C7B;&#x5728;&#x771F;&#x6838;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x3002;

Cationic antimicrobial peptides (CAMPs) selectively target bacterial membranes by electrostatic interactions with negatively charged lipids. It turned out that for inhibition of microbial growth a high CAMP membrane concentration is required, which can be realized by the incorporation of hydrophobic groups within the peptide. Increasing hydrophobicity, however, reduces the CAMP selectivity for bacterial over eukaryotic host membranes, thereby causing the risk of detrimental side-effects. In this study we addressed how cationic amphipathic peptides-in particular a CAMP with Lysine-Leucine-Lysine repeats (termed KLK)-affect the localization and dynamics of molecules in eukaryotic membranes. We found KLK to selectively inhibit the endocytosis of a subgroup of membrane proteins and lipids by electrostatically interacting with negatively charged sialic acid moieties. Ultrastructural characterization revealed the formation of membrane invaginations representing fission or fusion intermediates, in which the sialylated proteins and lipids were immobilized. Experiments on structurally different cationic amphipathic peptides (KLK, 6-MO-LF11-322 and NK14-2) indicated a cooperation of electrostatic and hydrophobic forces that selectively arrest sialylated membrane constituents.

Cationic amphipathic peptides accumulate sialylated proteins and lipids in the plasma membrane of eukaryotic host cells.

Peptides antimicrobiens cationiques (PAC) cibler s&#xE9;lectivement les membranes bact&#xE9;riennes par des interactions &#xE9;lectrostatiques avec les lipides charg&#xE9;s n&#xE9;gativement. Il s&#x26;#39;est av&#xE9;r&#xE9; que pour l&#x26;#39;inhibition de la croissance microbienne un camp de concentration &#xE9;lev&#xE9;e membrane est n&#xE9;cessaire, qui peut &#xEA;tre r&#xE9;alis&#xE9; par l&#x26;#39;incorporation de groupements hydrophobes dans le peptide. L&#x26;#39;augmentation de l&#x26;#39;hydrophobie, cependant, r&#xE9;duit la s&#xE9;lectivit&#xE9; CAMP pour bact&#xE9;rienne sur des membranes h&#xF4;tes eucaryotes, ce qui provoque le risque de n&#xE9;fastes effets secondaires. Dans cette &#xE9;tude, nous avons abord&#xE9; la fa&#xE7;on dont cationiques peptides-in amphipathiques notamment un camp avec la lysine-leucine-lysine r&#xE9;p&#xE9;titions (appel&#xE9;es KLK)-une incidence sur la localisation et la dynamique des mol&#xE9;cules dans les membranes eucaryotes. Nous avons trouv&#xE9; KLK pour inhiber s&#xE9;lectivement l&#x26;#39;endocytose d&#x26;#39;un sous-groupe de prot&#xE9;ines et les lipides membranaires par &#xE9;lectrostatique interagir avec charg&#xE9;es n&#xE9;gativement fragments d&#x26;#39;acide sialique. Caract&#xE9;risation ultrastructurale r&#xE9;v&#xE8;le la formation d&#x26;#39;invaginations de la membrane repr&#xE9;sentant interm&#xE9;diaires de fission ou de fusion, dans laquelle les prot&#xE9;ines et les lipides ont &#xE9;t&#xE9; sialyl&#xE9;s immobilis&#xE9;s. Les exp&#xE9;riences sur les diff&#xE9;rents structurellement cationiques peptides amphipathiques (KLK, 6-MO-LF11-322 et NK14-2) a indiqu&#xE9; une coop&#xE9;ration des forces &#xE9;lectrostatiques et hydrophobes qui s&#xE9;lectivement arr&#xEA;ter constituants de la membrane sialyl&#xE9;s.

Cationiques peptides amphipathiques accumuler des prot&#xE9;ines et des lipides dans sialyl&#xE9;s la membrane plasmique des cellules h&#xF4;tes eucaryotes

Kationische antimikrobielle Peptide (CAMPs) Ziel selektiv bakterielle Membranen durch elektrostatische Wechselwirkungen mit negativ geladenen Lipiden. Es stellte sich heraus, die f&uuml;r die Hemmung der mikrobiellen Wachstum eine hohe Lager-Membran-Konzentration erforderlich ist, kann durch eine hydrophobe Gruppen innerhalb der Peptid realisiert werden. Erh&ouml;hung der Hydrophobie, reduziert jedoch die CAMP Selektivit&auml;t f&uuml;r bakteriell &uuml;ber eukaryotischen Host Membranen, wodurch das Risiko von sch&auml;dlichen Nebenwirkungen. In dieser Studie, die wir angesprochen wie kationische AMPHIPHILE Peptide-in bestimmten CAMP mit Lysin-Leucin-Lysin wird wiederholt (genannt KLK)-beeinflussen die Lokalisierung und die Dynamik von Molek&uuml;len in eukaryotischen Membranen. Wir fanden die KLK selektiv hemmen der Endozytose eine Untergruppe der Membranproteine und Lipide durch die elektrostatisch Interaktion mit negativ geladenen Sialins&auml;ure Polymerharze. Ultrastrukturelle Charakterisierung ergab die Bildung von Membran-einst&uuml;lpungen, die Kernspaltung oder Fusion Zwischenprodukte, in denen die Sialylated Proteinen und Lipiden immobilisiert wurden darstellt. Experimente auf strukturell unterschiedliche kationische AMPHIPHILE Peptide (KLK, 6-MO-LF11-322 und NK14-2) angegeben, eine Kooperation von elektrostatischen und hydrophobe Kr&auml;fte, die Sialylated Membrane Bestandteile selektiv zu verhaften.

Kationische AMPHIPHILE Peptide ansammeln Sialylated Proteinen und Lipiden in der Plasmamembran der eukaryotischen Wirtszellen.

Peptidi antimicrobici cationici (accampamenti) bersaglio in modo selettivo membrane batteriche da interazioni elettrostatiche con i lipidi caricati negativamente. Si &egrave; scoperto che per l&#39;inibizione della crescita microbica una concentrazione elevata membrana CAMP &egrave; richiesto, che pu&ograve; essere realizzato per l&#39;incorporazione di gruppi idrofobi all&#39;interno del peptide. Aumentando idrofobicit&agrave;, tuttavia, si riduce la selettivit&agrave; CAMP per batterico sopra membrane eucariote ospite, causando cos&igrave; il rischio di effetti collaterali dannosi. In questo studio abbiamo affrontato come cationico amphipathic peptidi-in particolare un CAMP con lisina-leucina-lisina ripete (chiamato KLK)-possono influenzare la localizzazione e la dinamica delle molecole nelle membrane eucariote. Abbiamo trovato KLK di inibire selettivamente l&#39;endocitosi di un sottogruppo di proteine di membrana e lipidi interagendo elettrostaticamente con acido sialico caricato negativamente moiety. Caratterizzazione ultrastrutturale ha rivelato la formazione dei invaginations membrana che rappresentano intermedi di fissione o fusione, in cui il sialilato proteine e lipidi sono stati immobilizzati. Esperimenti su amphipathic cationico strutturalmente diversi peptidi (KLK, 6-MO-LF11-322 e NK14-2) ha indicato una cooperazione delle forze elettrostatiche e idrofobiche che arrestare selettivamente costituenti di membrana sialilato.

Peptidi cationici amphipathic accumulano sialilato proteine e lipidi nella membrana del plasma delle cellule eucariotiche.

&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x6297;&#x83CC;&#x6027;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#xFF08;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x30D7;&#xFF09;&#x3092;&#x9078;&#x629E;&#x8CA0;&#x306B;&#x5E2F;&#x96FB;&#x3057;&#x305F;&#x8102;&#x8CEA;&#x3068;&#x306E;&#x9759;&#x96FB;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x819C;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x5185;&#x306B;&#x758E;&#x6C34;&#x57FA;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x3080;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B9F;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3001;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x5897;&#x6B96;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9AD8;CAMP&#x819C;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5224;&#x660E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6709;&#x5BB3;&#x306A;&#x526F;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5371;&#x967A;&#x6027;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x4E0A;&#x306E;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3092;&#x6E1B;&#x3089;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x4E21;&#x89AA;&#x5A92;&#x6027;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;-&#x5185;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;CAMP  - &#x30ED;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3; - &#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x53CD;&#x5FA9;&#xFF08;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;KLK&#xFF09;&#x3068;&#x306F;&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x819C;&#x5185;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x5C40;&#x5728;&#x3068;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3059;&#x308B;&#x304B;&#x3092;&#x53D6;&#x308A;&#x4E0A;&#x3052;&#x305F;&#x3002;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306F;KLK&#x304C;&#x9078;&#x629E;&#x7684;&#x306B;&#x9759;&#x96FB;&#x7684;&#x306B;&#x8CA0;&#x306B;&#x8377;&#x96FB;&#x3057;&#x305F;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EB;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3084;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x8D85;&#x5FAE;&#x7D30;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30E9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EB;&#x9178;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3084;&#x8102;&#x8CEA;&#x304C;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6838;&#x5206;&#x88C2;&#x3084;&#x6838;&#x878D;&#x5408;&#x4E2D;&#x9593;&#x4F53;&#x3092;&#x8868;&#x3059;&#x819C;&#x9665;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x306B;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x4E21;&#x89AA;&#x5A92;&#x6027;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#xFF08;KLK&#x3001;6-MO-LF11-322&#x3068;NK14-2&#xFF09;&#x306F;&#x9078;&#x629E;&#x7684;&#x306B;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EB;&#x9178;&#x819C;&#x6210;&#x5206;&#x3092;&#x902E;&#x6355;&#x96FB;&#x3068;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x529B;&#x306E;&#x5354;&#x529B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x4E21;&#x89AA;&#x5A92;&#x6027;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306B;&#x30B7;&#x30A2;&#x30EB;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x8102;&#x8CEA;&#x3092;&#x84C4;&#x7A4D;&#x3059;&#x308B;

&#xBD80;&#xC815; &#xCCAD;&#xAD6C; &#xC9C0;&#xC9C8;&#xACFC; &#xC815;&#xC804;&#xAE30; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB300;&#xC0C1; &#xC138;&#xADE0; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xD56D;&#xADE0; &#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; (&#xCEA0;&#xD504;). &#xC54C;&#xACE0; &#xBCF4; &#xB2C8; &#xB192;&#xC740; &#xCEA0;&#xD504; &#xB9C9; &#xB18D;&#xB3C4; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xC131;&#xC7A5;&#xC758; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC694;, &#xADF8;&#xB294; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xB0B4;&#xC758; &#xC18C;&#xC218; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC758; &#xC124;&#xB9BD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2E4;&#xD604; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; hydrophobicity&#xB97C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368; &#xD574;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBD80;&#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC704;&#xD5D8;&#xC744; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xC9C4; &#xD575; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC138;&#xADE0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCEA0;&#xD504; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xAC10;&#xC18C;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;-&#xC5D0; &#xD2B9;&#xC815; &#xB9AC; &#xC2E0; Lysine&#xACFC; &#xCEA0;&#xD504; &#xBC18;&#xBCF5; (&#xBD88;&#xB9B0;&#xB41C; KLK) &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; &#xC591;&#xC774;&#xC628; amphipathic&#xB97C; &#xD574;&#xACB0;-&#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xC640; &#xC9C4; &#xD575; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC5ED;&#xD559;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; electrostatically &#xBD80;&#xC815; &#xCCAD;&#xAD6C; sialic &#xC0B0; moieties &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xC9C0; &#xC9C8;&#xC758; &#xD558;&#xC704; &#xADF8;&#xB8F9; endocytosis&#xB97C; &#xC5B5;&#xC81C; &#xD558;&#xB294; KLK&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Ultrastructural &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xBD84;&#xC5F4; &#xB610;&#xB294; &#xC735;&#xD569; &#xC911;&#xAC04;&#xCCB4;, sialylated &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC77C; &#xD588;&#xB2E4; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xB9C9; invaginations&#xC758; &#xD615;&#xC131;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xAD6C;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xC591;&#xC774;&#xC628; amphipathic &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; (KLK, 6-&#xBAA8;-LF11-322, NK14-2)&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD45C;&#xC2DC; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; sialylated &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC131;&#xBD84; &#xCCB4;&#xD3EC; &#xC815;&#xC804;&#xAE30; &#xBC0F; &#xC18C;&#xC218; &#xC138;&#xB825;&#xC758; &#xD611;&#xB825;.

&#xC591;&#xC774;&#xC628; amphipathic &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; sialylated &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC9C4; &#xD575; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xCD95;&#xC801;.

P&#xE9;ptidos cati&#xF3;nicos antimicrobianos (campamentos) atacar selectivamente las membranas bacterianas por interacciones electrost&#xE1;ticas con los l&#xED;pidos cargados negativamente. Result&#xF3; que para la inhibici&#xF3;n del crecimiento microbiano una concentraci&#xF3;n CAMP membrana se requiere una alta, que puede ser realizado por la incorporaci&#xF3;n de grupos hidr&#xF3;fobos en el p&#xE9;ptido. El aumento de la hidrofobicidad, sin embargo, reduce la selectividad CAMP para bacteriana sobre membranas hu&#xE9;sped eucari&#xF3;ticas, causando con ello el riesgo de efectos secundarios perjudiciales. En este estudio se abord&#xF3; la forma de p&#xE9;ptidos cati&#xF3;nicos anfip&#xE1;ticos en particular, un campamento con lisina-leucina-lisina se repite (denominado KLK)-afecta a la localizaci&#xF3;n y la din&#xE1;mica de las mol&#xE9;culas en las membranas eucariotas. Hemos encontrado KLK para inhibir selectivamente la endocitosis de un subgrupo de prote&#xED;nas y l&#xED;pidos de membrana por electrost&#xE1;ticamente interactuar con carga negativa restos de &#xE1;cido si&#xE1;lico. Caracterizaci&#xF3;n ultraestructural revel&#xF3; la formaci&#xF3;n de invaginaciones de membrana que representan compuestos intermedios de fisi&#xF3;n o fusi&#xF3;n, en los que las prote&#xED;nas y los l&#xED;pidos sialiladas fueron inmovilizados. Los experimentos sobre estructuralmente diferentes p&#xE9;ptidos anfip&#xE1;ticos cati&#xF3;nicos (KLK, 6-MO-LF11-322 y NK14-2) se indica una cooperaci&#xF3;n de las fuerzas electrost&#xE1;ticas e hidrof&#xF3;bicas que selectivamente detener a los componentes de membrana sialylated.

P&#xE9;ptidos cati&#xF3;nicos anfip&#xE1;ticos se acumulan las prote&#xED;nas Sialylated y l&#xED;pidos en la membrana plasm&#xE1;tica de las c&#xE9;lulas eucariotas de acogida

&#x8001;&#x5316;&#x548C;&#x75C5;&#x7406;&#x751F;&#x7406;&#x6761;&#x4EF6;&#x94FE;&#x63A5;&#x5230;&#x819C;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x8C03;&#x8282;&#x63A7;&#x5236;&#x819C;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x5F00;&#x5173;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x6C34;&#x5E73;&#x53CA;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x86CB;&#x767D; (HSP) &#x8868;&#x8FBE;&#x3002;HSP co-inducer hydroxylamines &#x5982; BGP 15 &#x63D0;&#x4F9B;&#x5148;&#x8FDB;&#x6CBB;&#x7597;&#x5F88;&#x591A;&#x75BE;&#x75C5;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x4F18;&#x5148;&#x5F71;&#x54CD;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x5F3A;&#x8C03;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x6709;&#x5927;&#x7684;&#x526F;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x5206;&#x5B50;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x6A21;&#x62DF;&#x5728;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x8102;&#x8D28;&#x819C;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x8D85;&#x7075;&#x654F;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8868;&#x660E; BGP 15 &#x6539;&#x53D8;&#x5BCC;&#x542B;&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x7684;&#x819C;&#x57DF;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x3002;&#x957F;&#x5BFF;&#x5E73;&#x53F0;&#x4F7F;&#x7528;&#x7B4F;&#x6807;&#x8BB0;&#x808C;&#x9187;&#x5355;&#x4F53;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x76F4;&#x64AD;&#x4E2D;&#x56FD;&#x4ED3;&#x9F20;&#x5375;&#x5DE2; (CHO) &#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x5F25;&#x6563;&#x6210;&#x50CF;&#x7684;&#x7EB3;&#x7C73;&#x8868;&#x660E; BGP 15 &#x9632;&#x6B62;&#x77AC;&#x6001;&#x7ED3;&#x6784;&#x89E3;&#x4F53;&#x7684;&#x6392;&#x70ED;&#x578B;&#x70ED;&#x5E94;&#x6FC0;&#x6240;&#x81F4;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;BGP 15 &#x5F97;&#x4EE5;&#x91CD;&#x5851;&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x5E73;&#x53F0;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x60F3;&#x8D77;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x524D;&#x9762;&#x540E;&#x975E;&#x81F4;&#x547D;&#x6027;&#x70ED;&#x542F;&#x52A8;&#x6216;&#x819C;&#x5E94;&#x529B;&#xFF0C;&#x5E76;&#x8BC1;&#x660E;&#x662F;&#x9884;&#x7559;&#x7684;&#x4EA7;&#x751F;&#x548C;&#x5E94;&#x529B;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7684;&#x4F20;&#x8F93;&#x3002;B16 F10 &#x9F20;&#x6807;&#x9ED1;&#x8272;&#x7D20;&#x7624;&#x7EC6;&#x80DE;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x86CB;&#x767D;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684; BGP 15 &#x6FC0;&#x6D3B;&#x6D89;&#x53CA;&#x6839;&#x636E;&#x80C6;&#x56FA;&#x9187;&#x5F71;&#x54CD;&#x9762;&#x5411;&#x819C; Rac1 &#x7684;&#x4EE5;&#x524D;&#x89C2;&#x5BDF; Rac1 &#x4FE1;&#x53F7;&#x7EA7;&#x8054;&#x653E;&#x5927;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E; BGP 15 &#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x6291;&#x5236;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80BE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7CFB;&#x4E2D;&#x5FEB;&#x901F;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x56E0;&#x5B50; 1 (HSF1) &#x4E59;&#x9170;&#x5316;&#x76D1;&#x6D4B;&#x70ED;&#x5E94;&#x6FC0;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4FC3;&#x8FDB; HSF1 &#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x70ED;&#x4F11;&#x514B;&#x5143;&#x7D20;&#x5EF6;&#x957F;&#x7684;&#x5DE5;&#x671F;&#x7684;&#x65E9;&#x671F;&#x9636;&#x6BB5;&#x3002;&#x4E24;&#x8005;&#x5408;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; BGP 15 &#x5DF2;&#x6210;&#x4E3A;&#x4E00;&#x7C7B;&#x65B0;&#x7684; &#39;&#x819C;&#x8102;&#x7597;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5728;&#x4F7F;&#x7528;&#x836F;&#x54C1;&#x7684;&#x6F5C;&#x529B;&#x4E0E;&#x8001;&#x5316;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x8BB8;&#x591A;&#x5404;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6298;&#x53E0;&#x5F02;&#x5E38;&#x75BE;&#x75C5;&#x4F5C;&#x6597;&#x4E89;&#x3002;

&#x5728;&#x64CD;&#x4F5C;&#x4E2D;&#x7684;&#x819C;&#x8C03;&#x8102;&#x6CBB;&#x7597;&#xFF1A; HSP co-inducer BGP 15 &#x901A;&#x8FC7;&#x91CD;&#x5851;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x819C;&#x6392;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x5E94;&#x6FC0;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x901A;&#x8DEF;&#x3002;

Aging and pathophysiological conditions are linked to membrane changes which modulate membrane-controlled molecular switches, causing dysregulated heat shock protein (HSP) expression. HSP co-inducer hydroxylamines such as BGP-15 provide advanced therapeutic candidates for many diseases since they preferentially affect stressed cells and are unlikely have major side effects. In the present study in vitro molecular dynamic simulation, experiments with lipid monolayers and in vivo ultrasensitive fluorescence microscopy showed that BGP-15 alters the organization of cholesterol-rich membrane domains. Imaging of nanoscopic long-lived platforms using the raft marker glycosylphosphatidylinositol-anchored monomeric green fluorescent protein diffusing in the live Chinese hamster ovary (CHO) cell plasma membrane demonstrated that BGP-15 prevents the transient structural disintegration of rafts induced by fever-type heat stress. Moreover, BGP-15 was able to remodel cholesterol-enriched lipid platforms reminiscent of those observed earlier following non-lethal heat priming or membrane stress, and were shown to be obligate for the generation and transmission of stress signals. BGP-15 activation of HSP expression in B16-F10 mouse melanoma cells involves the Rac1 signaling cascade in accordance with the previous observation that cholesterol affects the targeting of Rac1 to membranes. Finally, in a human embryonic kidney cell line we demonstrate that BGP-15 is able to inhibit the rapid heat shock factor 1 (HSF1) acetylation monitored during the early phase of heat stress, thereby promoting a prolonged duration of HSF1 binding to heat shock elements. Taken together, our results indicate that BGP-15 has the potential to become a new class of pharmaceuticals for use in 'membrane-lipid therapy' to combat many various protein-misfolding diseases associated with aging.

Membrane-lipid therapy in operation: the HSP co-inducer BGP-15 activates stress signal transduction pathways by remodeling plasma membrane rafts.

Des conditions de vieillissement et physiopathologiques sont li&#xE9;s aux changements membranaires qui modulent la membrane contr&#xF4;l&#xE9;es interrupteurs mol&#xE9;culaires, ce qui provoque une dysr&#xE9;gulation prot&#xE9;ine de choc thermique (HSP) d&#x26;#39;expression. HSP co-inducteur hydroxylamines comme BGP-15 de fournir avanc&#xE9;s candidats th&#xE9;rapeutiques pour de nombreuses maladies, car ils affectent pr&#xE9;f&#xE9;rentiellement les cellules stress&#xE9;es et ont peu de chances d&#x26;#39;avoir des effets secondaires majeurs. Dans la pr&#xE9;sente &#xE9;tude in vitro de simulation dynamique mol&#xE9;culaire, des exp&#xE9;riences avec des monocouches de lipides et de microscopie in vivo par fluorescence ultrasensible a montr&#xE9; que BGP-15 modifie l&#x26;#39;organisation de domaines membranaires riches en cholest&#xE9;rol. L&#x26;#39;imagerie de nanoscopiques longue dur&#xE9;e de vie plates-formes utilisant le marqueur radeau ancr&#xE9; glycosylphosphatidylinositol-monom&#xE8;re prot&#xE9;ine fluorescente verte diffuser dans le ovaire de hamster chinois en direct (CHO) membrane plasmique des cellules d&#xE9;montr&#xE9; que BGP-15 emp&#xEA;che la d&#xE9;sint&#xE9;gration structurelle transitoire de radeaux induite par le stress de chaleur de type fi&#xE8;vre . En outre, BGP-15 a r&#xE9;ussi &#xE0; remodeler les plates-formes de cholest&#xE9;rol-lipides enrichis rappelant ceux observ&#xE9;s plus t&#xF4;t d&#x26;#39;amor&#xE7;age suivant la chaleur non-l&#xE9;tale ou la contrainte de membrane, et se sont av&#xE9;r&#xE9;s &#xEA;tre obligatoire pour la g&#xE9;n&#xE9;ration et la transmission des signaux de stress. BGP-15 activation de l&#x26;#39;expression dans PSH B16-F10 cellules de m&#xE9;lanome de souris comprend la cascade Rac1 de signalisation conform&#xE9;ment &#xE0; la pr&#xE9;c&#xE9;dente observation que le cholest&#xE9;rol affecte le ciblage des Rac1 aux membranes. Enfin, dans une lign&#xE9;e humaine de cellules de rein embryonnaire, nous d&#xE9;montrons que BGP-15 est capable d&#x26;#39;inhiber le choc rapide de la chaleur facteur 1 (HSF1) ac&#xE9;tylation suivi pendant la phase pr&#xE9;coce de stress thermique, favorisant ainsi une augmentation de la dur&#xE9;e de HSF1 contraignant pour chauffer des &#xE9;l&#xE9;ments de choc . Pris dans leur ensemble, nos r&#xE9;sultats indiquent que BGP-15 a le potentiel pour devenir une nouvelle classe de produits pharmaceutiques pour utilisation dans des &#xAB;membrane lipidique-th&#xE9;rapie&#xBB; pour lutter contre de nombreuses prot&#xE9;ines diff&#xE9;rentes-repliement maladies associ&#xE9;es au vieillissement.

Membrane-lipidique de th&#xE9;rapie &#xE0; l&#x26;#39;op&#xE9;ration: le HSP Co-inductrices BGP-15 active les voies de transduction du signal de stress par des radeaux R&#xE9;novation membrane plasmique

Alterungs- und pathophysiologische Bedingungen sind verbunden mit Membran-&Auml;nderungen die Membran-gesteuerten molekulare Schalter, verursachen defekten Hitze-Schock-Protein (HSP)-Ausdruck zu modulieren. HSP Co-inducer sich haben wie BGP-15 bieten erweiterte therapeutische Kandidaten f&uuml;r viele Krankheiten, da sie bevorzugt beeinflussen Zellen hervorgehoben und sind unwahrscheinlich gro&szlig;e Nebenwirkungen. In der vorliegenden Studie in Vitro Diagnostic dynamische Simulation zeigten Experimente mit Lipid Monolayers und in-vivo ULTRASENSIBLE Fluoreszenzmikroskopie, dass BGP-15 die Organisation der Cholesterin-reiche Membran Domains &auml;ndert. Langlebige Plattformen mit das Flo&szlig; Markierung Glykosylphosphatidyl verankerte Monomer gr&uuml;n fluoreszierendes Protein in der Plasmamembran von Leben chinesischer Hamster Eierstock (CHO) Zelle zu einer Diffusion nachweislich Imaging des nanoskopische BGP-15 Transienten strukturellen Zerfall der Fl&ouml;&szlig;e induziert durch Fieber-Typ Hitzebelastung verhindert. Dar&uuml;ber hinaus konnte BGP-15 Lipid Cholesterin angereicherten umgestalten Plattformen erinnert an die fr&uuml;her folgende nicht-t&ouml;dliche Hitzebelastung Grundierung oder Membran beobachtet und wurden gezeigt, um zur Erzeugung und &Uuml;bertragung von Signalen Spannung obligat sein. BGP-15 Aktivierung von HSP Ausdruck in B16-F10 Mausmelanomzellen umfasst die Rac1 signalisierende Kaskade gem&auml;&szlig; der vorherigen Beobachtung, dass Cholesterin wirkt sich die Ausrichtung der Rac1 zu Membranen. Schlie&szlig;lich in eine menschliche embryonale Nieren-Zelllinie, die demonstrieren, dass BGP-15 zu hemmen vermag die schnelle Hitzeschock Faktor 1 (HSF1)-Acetylierung &uuml;berwacht w&auml;hrend der fr&uuml;hen Phase der Hitzebelastung, so eine l&auml;ngere Dauer der HSF1 Bindung Hitze-Schock-Elementen zu f&ouml;rdern. Zusammengenommen, unsere Ergebnisse zeigen, dass BGP-15 das Potenzial hat, eine neue Klasse von Medikamenten f&uuml;r den Einsatz in &quot;Membran-Lipid-Therapie&quot; werden zur Bek&auml;mpfung von vielen verschiedenen Protein misfolding Krankheiten, verbunden mit dem Altern.

Membran-Lipid-Therapie in Betrieb: die HSP Co-inducer BGP-15 Spannung Signaltransduction Bahnen durch Umbau der Plasmamembran Fl&ouml;&szlig;e aktiviert.

Invecchiamento e fisiopatologici condizioni sono legate ai cambiamenti di membrana che modulano interruttori molecolari controllata di membrana, causando espressione di heat shock protein (HSP). Hydroxylamines co-inducer HSP come BGP-15 fornire avanzati candidati terapeutici per molte malattie poich&eacute; colpiscono preferenzialmente ha sottolineato le cellule ed &egrave; improbabile che hanno effetti collaterali importanti. Nel presente studio in vitro simulazione di dinamica molecolare, esperimenti con monostrati lipidici e microscopia di fluorescenza ultrasensibile in vivo hanno mostrato che BGP-15 altera l&#39;organizzazione dei domini di membrana ricchi di colesterolo. Imaging di nanoscopica longevi piattaforme utilizzando la zattera marcatore ancorata glicosilfosfatidilinositolo monomerica proteina fluorescente verde diffonde nella membrana del plasma live criceto cinese (CHO) dell&#39;ovaio cella ha dimostrato che il BGP-15 impedisce la disintegrazione strutturale transiente di zattere indotta da stress da calore febbre-tipo. Inoltre, BGP-15 &egrave; stato in grado di rimodellare lipidico colesterolo-arricchito piattaforme che ricordano quelli osservano precedentemente dopo lo stress di adescamento o membrana di calore non letali e hanno dimostrati di essere obbligati per la generazione e trasmissione di segnali di stress. BGP-15 attivazione dell&#39;espressione di HSP in cellule di melanoma B16-F10 mouse coinvolge la cascata di segnalazione Rac1 secondo l&#39;osservazione precedente che colesterolo colpisce il targeting di Rac1 alle membrane. Infine, in una linea cellulare umana Rene embrionale dimostriamo che BGP-15 &egrave; in grado di inibire la scossa di calore rapido fattore 1 acetilazione (HSF1) monitorati durante la prima fase di stress da calore, promuovendo cos&igrave; una durata prolungata di HSF1 associazione agli elementi di scossa di calore. Presi insieme, i nostri risultati indicano che il BGP-15 ha il potenziale per diventare una nuova classe di farmaci per uso in &#39;terapia membrana lipidica&#39; per combattere molte malattie varie misfolding di proteine, associate con l&#39;invecchiamento.

Terapia lipidica di membrana in funzione: il co-inducer HSP BGP-15 attiva vie di trasduzione del segnale di stress da rimodellamento zattere di membrana del plasma.

&#x8001;&#x5316;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x75C5;&#x614B;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x306F;&#x3001;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x4E0D;&#x5168;&#x306E;&#x71B1;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;HSP&#xFF09;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x3001;&#x819C;&#x5236;&#x5FA1;&#x5206;&#x5B50;&#x30B9;&#x30A4;&#x30C3;&#x30C1;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F7C;&#x3089;&#x304C;&#x512A;&#x5148;&#x7684;&#x306B;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30B9;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305D;&#x3046;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x526F;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x306E;&#x3067;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;BGP-15&#x3068;HSP&#x306E;&#x5171;&#x8A98;&#x5C0E;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x30A2;&#x30DF;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x75BE;&#x60A3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306A;&#x6CBB;&#x7642;&#x85AC;&#x5019;&#x88DC;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8A66;&#x9A13;&#x7BA1;&#x5185;&#x5206;&#x5B50;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x306F;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x5358;&#x5206;&#x5B50;&#x819C;&#x3068;&#x751F;&#x4F53;&#x3068;&#x8D85;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3067;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x3001;BGP-15&#x3092;&#x5909;&#x5316;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306B;&#x5BCC;&#x3080;&#x819C;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB;&#x30A2;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;&#x578B;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x751F;&#x30C1;&#x30E3;&#x30A4;&#x30CB;&#x30FC;&#x30BA;&#x30CF;&#x30E0;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC;&#x5375;&#x5DE3;&#xFF08;CHO&#xFF09;&#x306E;&#x62E1;&#x6563;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x306E;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x30CA;&#x30CE;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x5BFF;&#x547D;&#x306E;&#x9577;&#x3044;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x200B;&#x200B;&#x3001;BGP-15&#x306F;&#x3001;&#x767A;&#x71B1;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306E;&#x71B1;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x306E;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x5D29;&#x58CA;&#x3092;&#x9632;&#x6B62;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;BGP-15&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x89B3;&#x200B;&#x200B;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x4EE5;&#x524D;&#x3001;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;&#x975E;&#x81F4;&#x6B7B;&#x7684;&#x71B1;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DF;&#x30F3;&#x30B0;&#x3084;&#x819C;&#x5FDC;&#x529B;&#x3092;&#x5F77;&#x5F7F;&#x3068;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x6539;&#x9020;&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306B;&#x5BCC;&#x3080;&#x8102;&#x8CEA;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30B9;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;&#x751F;&#x6210;&#x3068;&#x9001;&#x4FE1;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x771F;&#x6B63;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002; B16-F10&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x30E1;&#x30E9;&#x30CE;&#x30FC;&#x30DE;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;HSP&#x767A;&#x73FE;&#x306E;BGP-15&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306F;&#x30B3;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306F;&#x819C;&#x306B;Rac1&#x306E;&#x6A19;&#x7684;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x89B3;&#x5BDF;&#x306B;&#x5F93;&#x3063;&#x3066;&#x3001;Rac1&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x30AB;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30C9;&#x3092;&#x4F34;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x80DA;&#x814E;&#x81D3;&#x7D30;&#x80DE;&#x682A;&#x3067;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x611F;&#x96FB;&#x306E;&#x8981;&#x7D20;&#x3092;&#x52A0;&#x71B1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;HSF1&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x9577;&#x671F;&#x6301;&#x7D9A;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3057;&#x3001;BGP-15&#x306F;&#x3001;&#x71B1;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30B9;&#x306E;&#x521D;&#x671F;&#x6BB5;&#x968E;&#x3067;&#x76E3;&#x8996;&#x6025;&#x901F;&#x71B1;&#x30B7;&#x30E7;&#x30C3;&#x30AF;&#x56E0;&#x5B50;1&#xFF08;HSF1&#xFF09;&#x30A2;&#x30BB;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;BGP-15&#x306F;&#x3001;&#x52A0;&#x9F62;&#x306B;&#x4F34;&#x3046;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6298;&#x308A;&#x7573;&#x307F;&#x306E;&#x75C5;&#x6C17;&#x3068;&#x95D8;&#x3046;&#x305F;&#x3081;&#x306E; &#x26;quot;&#x819C;&#x8102;&#x8CEA;&#x7642;&#x6CD5;&#x26;quot;&#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x533B;&#x85AC;&#x54C1;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3002;

&#x52D5;&#x4F5C;&#x6642;&#x306E;&#x819C;&#x8102;&#x8CEA;&#x7642;&#x6CD5;&#xFF1A;&#x6539;&#x9020;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30DE;&#x819C;&#x30E9;&#x30D5;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;HSP&#x5171;&#x8A98;&#x5C0E;BGP-15&#x3092;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30B9;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;

&#xC5D0;&#xC774;&#xC9D5; &#xBC0F; pathophysiological &#xC870;&#xAC74; &#xB9C9; &#xC81C;&#xC5B4; &#xBD84;&#xC790; &#xC2A4;&#xC704;&#xCE58;, dysregulated &#xC5F4; &#xCDA9;&#xACA9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (HSP) &#xC2DD; &#xC77C;&#xC73C;&#xD0A4;&#xB294; &#xBCC0;&#xC870; &#xB9C9; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. HSP co-inducer hydroxylamines BGP 15 &#xC6B0;&#xC120;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0;, &#xB9CE;&#xC740; &#xC9C8;&#xBCD1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACE0;&#xAE09; &#xCE58;&#xB8CC; &#xD6C4;&#xBCF4; &#xC138;&#xD3EC; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xC640; &#xAC19;&#xC740; &#xC8FC;&#xC694; &#xBD80;&#xC791;&#xC6A9;&#xC774; &#xC788;&#xB2E4;. &#xCCB4; &#xC678; &#xBD84;&#xC790; &#xB3D9;&#xC801; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD604;&#xC7AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C0;&#xC9C8; monolayers&#xC640; in vivo &#x78C1; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xC2E4;&#xD5D8; BGP 15 &#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864;&#xC774; &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; &#xB9C9; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xC870;&#xC9C1; &#xBCC0;&#xACBD; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. &#xC804;&#xCCB4;&#xC758; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xB5CF;&#xBAA9; &#xB9C8;&#xCEE4; glycosylphosphatidylinositol &#xACE0;&#xC815; monomeric &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC911;&#xAD6D; &#xD584;&#xC2A4;&#xD130; &#xB09C;&#xC18C; (&#xC870;) &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD655;&#xC0B0;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC218;&#xBA85;&#xC774; &#xAE34; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC; &#xC2DC;&#xC5F0; BGP 15 &#xC5F4;&#xC774; &#xD615; &#xC5F4; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC720;&#xB3C4; &#xB41C; &#xB5CF;&#xBAA9;&#xC758; &#xC77C;&#xC2DC;&#xC801; &#xAD6C;&#xC870; &#xD574;&#xCCB4; &#xBC29;&#xC9C0;. &#xB610;&#xD55C;, BGP 15 &#xB9AC; &#xBAA8;&#xB378;&#xB9C1; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864; &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC; &#xC5F0;&#xC0C1; &#xADF8;&#xC758; &#xC774;&#xC804; &#xBE44; &#xCE58;&#xBA85;&#xC801;&#xC778; &#xC5F4; &#xC560; &#xBC8C; &#xCE60; &#xB610;&#xB294; &#xB9C9; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD558; &#xACE0; &#xC0DD;&#xC131; &#xBC0F; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xC2A4; &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xC1A1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC758;&#xBB34; &#xC218; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD588;&#xB2E4; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4;. B16 F10 &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xD751;&#xC0C9; &#xC885; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; HSP &#xD45C;&#xD604;&#xC758; BGP 15 &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xCF5C;&#xB808;&#xC2A4;&#xD14C;&#xB864; &#xB9C9; Rac1 &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xC774;&#xC804; &#xAD00;&#xCE21;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; Rac1 &#xC2E0;&#xD638; &#xBAA8;&#xB450;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, BGP 15 &#xC5B5;&#xC81C; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xC778;&#xAC04; &#xBC30;&#xC544; &#xC2E0;&#xC7A5; &#xC138;&#xD3EC; &#xB77C;&#xC778;&#xC5D0; &#xAE09;&#xC18D; &#xD55C; &#xC5F4; &#xCDA9;&#xACA9; &#xC694;&#xC18C; 1 (HSF1) acetylation &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368; &#xC5F4; &#xC1FC;&#xD06C; &#xC694;&#xC18C;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; hsf1&#xC758; &#xBA38;&#xB9AC;&#xB9D0; &#xBD99;&#xC778;&#xB41C; &#xAE30;&#xAC04; &#xD64D;&#xBCF4; &#xC5F4; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xC2A4;&#xC758; &#xCD08;&#xAE30; &#xB2E8;&#xACC4;. &#xD568;&#xAED8; &#xCC0D;&#xC740; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4; BGP 15&#xB294; &#39;&#xB9C9; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xCE58;&#xB8CC;&#39;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC758;&#xC57D;&#xD488;&#xC758; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD074;&#xB798;&#xC2A4; &#xB420; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xB9CE;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; misfolding &#xC99D; &#xB178;&#xD654;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C;.

&#xC791;&#xC5C5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9C9; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xCE58;&#xB8CC;: &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xB5CF;&#xBAA9;&#xC744; &#xB9AC; &#xBAA8;&#xB378;&#xB9C1; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xC2A4; &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xB2EC; &#xACBD;&#xB85C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558;&#xB294; HSP co-inducer BGP-15.

Las condiciones de envejecimiento y fisiopatol&#xF3;gicos est&#xE1;n vinculados a los cambios de la membrana que modulan controlados membrana interruptores moleculares, prote&#xED;na causante de desregulaci&#xF3;n de choque t&#xE9;rmico (HSP) de expresi&#xF3;n. HSP inductor co-hidroxilaminas como BGP-15 proporciona avanzadas candidatos terap&#xE9;uticos para muchas enfermedades, ya que afecta preferentemente a las c&#xE9;lulas estresadas y es poco probable tener efectos secundarios importantes. En el presente estudio in vitro de simulaci&#xF3;n din&#xE1;mica molecular, los experimentos con monocapas de l&#xED;pidos y en la microscop&#xED;a de fluorescencia in vivo mostraron que ultrasensible BGP-15 altera la organizaci&#xF3;n de los dominios de membrana ricos en colesterol. Obtenci&#xF3;n de im&#xE1;genes de tama&#xF1;o nanosc&#xF3;pico de larga vida utilizando las plataformas de la marca glicosilfosfatidilinositol balsa anclada monom&#xE9;rico prote&#xED;na verde fluorescente membrana de la c&#xE9;lula de difusi&#xF3;n en el ovario de h&#xE1;mster vivo chino (CHO) en plasma demostrado que la BGP-15 evita la desintegraci&#xF3;n estructural de las balsas transitoria inducida por el estr&#xE9;s por calor la fiebre de tipo . Por otra parte, BGP-15 fue capaz de remodelar las plataformas de colesterol de l&#xED;pidos enriquecidas con reminiscencias de los observados a principios de los siguientes no letal de cebado estr&#xE9;s por calor o de la membrana, y se demostr&#xF3; que es obligado para la generaci&#xF3;n y transmisi&#xF3;n de se&#xF1;ales de estr&#xE9;s. BGP-15 activaci&#xF3;n de la expresi&#xF3;n HSP en B16-F10 c&#xE9;lulas de melanoma de rat&#xF3;n implica la cascada Rac1 de se&#xF1;alizaci&#xF3;n de acuerdo con la observaci&#xF3;n anterior de que el colesterol afecta a la orientaci&#xF3;n de Rac1 a las membranas. Por &#xFA;ltimo, en un ser humano l&#xED;nea celular embrionaria de ri&#xF1;&#xF3;n se demuestra que BGP-15 es capaz de inhibir la descarga r&#xE1;pida de calor el factor 1 (HSF1) acetilaci&#xF3;n de seguimiento durante la fase temprana del estr&#xE9;s por calor, con lo que la promoci&#xF3;n de una duraci&#xF3;n prolongada de la HSF1 vinculante para calentar elementos de choque . En conjunto, nuestros resultados indican que el BGP-15 tiene el potencial para convertirse en una nueva clase de f&#xE1;rmacos para su uso en &#x26;#39;la membrana de l&#xED;pidos terapia &#x26;quot;para combatir el mal plegamiento de prote&#xED;nas muchas diversas enfermedades asociadas con el envejecimiento.

Membrana de l&#xED;pidos terapia en la Operaci&#xF3;n: el HSP inductor Co-BGP-15 Activa estr&#xE9;s v&#xED;as de transducci&#xF3;n de Balsas Remodelaci&#xF3;n membrana plasm&#xE1;tica

&#x5728;&#x5B83;&#x4EEC;&#x7684;&#x968F;&#x673A;&#x8FD0;&#x52A8;&#xFF0C;&#x671F;&#x95F4;&#x751F;&#x7269;&#x5206;&#x5B50;&#x7ECF;&#x9A8C;&#x6D41;&#x5F62;&#x7684;&#x6682;&#x6001;&#x5EB7;&#x6377;&#x5176;&#x8DEF;&#x5F84;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5B83;&#x662F;&#x975E;&#x5E38;&#x96BE;&#x4EE5;&#x8861;&#x91CF;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x76F4;&#x63A5;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#xFF1A; &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x77ED;&#x6682;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x53EA;&#x6709;&#x5C11;&#x6570;&#x5206;&#x6570;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#xFF0C;&#x6216;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x4E0D;&#x53EF;&#x80FD;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5B8F;&#x89C2;&#x89C2;&#x6D4B;&#x6548;&#x679C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x6B64;&#x5904;&#x63CF;&#x8FF0;&#x5141;&#x8BB8;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x91CF;&#x5316;&#x7684;&#x79FB;&#x52A8;&#x5206;&#x5B50;&#x534F;&#x4F1A;&#x7684;&#x65B0;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6210;&#x50CF;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x7531;&quot;&#x540C;&#x65F6;&#x4FDD;&#x62A4;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x51FA;&#x96C6;&#x7FA4;&#x7A00;&#x758F;&quot;&#xFF08;TOCCSL&#xFF09;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53EF;&#x4EE5;&#x51E0;&#x4E4E;&#x7A00;&#x91CA;&#x63A2;&#x5934;&#x76F4;&#x63A5;&#x5728;&#x8BE5;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x5355;&#x4E2A;&#x7FA4;&#x96C6;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x3002;&#x4ECE;&#x6839;&#x672C;&#x4E0A;&#x8BB2;&#xFF0C;&#x5206;&#x6790;&#x533A;&#x57DF;&#x521B;&#x5EFA;&#x5728;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x5185;&#x7684;&#x6F02;&#x767D; &#xFF1B;&#x8FD9;&#x4E00;&#x5730;&#x533A;&#x6CA1;&#x6709;&#x79EF;&#x6781;&#x7684;&#x63A2;&#x7D22;&#x3002;&#x5E03;&#x6717;&#x6269;&#x6563;&#x6216;&#x5176;&#x4ED6;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x5206;&#x6790;&#x533A;&#x57DF;&#x5BFC;&#x81F4;&#x6298;&#x8FD4;&#x7684;&#x79EF;&#x6781;&#x63A2;&#x7D22;&#x3002;&#x5728;&#x6062;&#x590D;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x5F00;&#x59CB;&#xFF0C;&#x5355;&#x70B9;&#x53EF;&#x4EE5;&#x89E3;&#x51B3;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6697;&#x5904;&#x3001; &#x884D;&#x5C04;&#x6781;&#x9650;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3002;&#x6807;&#x51C6;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x7136;&#x540E;&#x5141;&#x8BB8;&#x8868;&#x5F81;&#x5176;&#x7EC4;&#x6210;&#x548C;&#x6D41;&#x52A8;&#x6027;&#x7684;&#x666F;&#x70B9;&#x3002;

&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5206;&#x5B50;&#x534F;&#x4F1A;&#x751F;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x955C;&#x3002;

During their random motion, biomolecules experience a manifold of interactions that transiently conjoin their paths. It is extremely difficult to measure such binding events directly in the context of a living cell: interactions may be short lived, they may affect only a minority fraction of molecules, or they may not lead to a macroscopically observable effect. We describe here a new single-molecule imaging method that allows for detecting and quantifying associations of mobile molecules. By "thinning out clusters while conserving the stoichiometry of labeling" (TOCCSL), we can virtually dilute the probe directly in the cell, without affecting the fluorescence labeling of single clusters. Essentially, an analysis region is created within the cell by photobleaching; this region is devoid of active probe. Brownian diffusion or other transport processes lead to reentry of active probe into the analysis region. At the onset of the recovery process, single spots can be resolved as well-separated, diffraction-limited signals. Standard single-molecule microscopy then allows for characterizing the spots in terms of their composition and mobility.

Detection and Quantification of Biomolecular Association in Living Cells using Single-Molecule Microscopy.

Au cours de leur mouvement al&#xE9;atoire, biomol&#xE9;cules l&#x26;#39;exp&#xE9;rience d&#x26;#39;une vari&#xE9;t&#xE9; d&#x26;#39;interactions qui transitoirement conjoindre leurs chemins. Il est extr&#xEA;mement difficile de mesurer ces &#xE9;v&#xE9;nements de liaison directement dans le contexte d&#x26;#39;une cellule vivante: les interactions peuvent &#xEA;tre de courte dur&#xE9;e, ils peuvent affecter seulement une fraction minoritaire de mol&#xE9;cules, ou ils ne peuvent pas conduire &#xE0; un effet macroscopique observable. Nous d&#xE9;crivons ici une nouvelle m&#xE9;thode d&#x26;#39;imagerie unique mol&#xE9;cule qui permet de d&#xE9;tecter et de quantifier les associations de mol&#xE9;cules mobiles. Par &#x26;quot;&#xE9;claircissage des grappes tout en conservant la stoechiom&#xE9;trie de l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage&#x26;quot; (TOCCSL), nous pouvons pratiquement diluer la sonde directement dans la cellule, sans affecter le marquage en fluorescence des grappes simples. Essentiellement, une r&#xE9;gion d&#x26;#39;analyse est cr&#xE9;&#xE9; au sein de la cellule par photoblanchiment; cette r&#xE9;gion est d&#xE9;pourvue de sonde active. Diffusion brownienne ou autres processus de transport conduire &#xE0; la rentr&#xE9;e de la sonde active dans la r&#xE9;gion d&#x26;#39;analyse. Au d&#xE9;but du processus de r&#xE9;cup&#xE9;ration, des taches simples peuvent &#xEA;tre r&#xE9;solus que bien s&#xE9;par&#xE9;es, limit&#xE9;e par la diffraction des signaux. Norme mol&#xE9;cule unique microscopie permet alors de caract&#xE9;riser les taches en termes de leur composition et de la mobilit&#xE9;.

D&#xE9;tection et la quantification de l&#x26;#39;Association biomol&#xE9;culaire dans les cellules vivantes &#xE0; l&#x26;#39;aide mol&#xE9;cule unique microscopie

W&auml;hrend ihre zuf&auml;llige Bewegung erleben Biomolek&uuml;len eine Mannigfaltigkeit der Interaktionen, die vor&uuml;bergehend ihre Pfade verbinden. Es ist &auml;u&szlig;erst schwierig, solche Bindung-Veranstaltungen direkt im Kontext einer lebenden Zelle zu messen: Interaktionen k&ouml;nnen sehr kurzlebig sein, sie nur einen Minderheit Bruchteil der Molek&uuml;le zu beeintr&auml;chtigen oder sie k&ouml;nnen nicht zu einer makroskopisch beobachtbare Wirkung f&uuml;hren. Wir beschreiben hier eine neue Einzelmolek&uuml;l-bildgebende Verfahren, die zur Erkennung und Quantifizierung von Verb&auml;nden der mobilen Molek&uuml;le erm&ouml;glicht. Von &quot;Ausd&uuml;nnung Cluster w&auml;hrend schonen die St&ouml;chiometrie der Bezeichnung&quot; (TOCCSL), k&ouml;nnen wir praktisch verd&uuml;nnen die Sonde direkt in die Zelle, ohne Beeintr&auml;chtigung der Fluoreszenz-Kennzeichnung der einzelnen Cluster. Im Wesentlichen ist eine Analyse-Region innerhalb der Zelle durch Photobleichung erstellt; Diese Region ist ohne aktiver Tastkopf. Brownschen Verbreitung oder andere Transportprozesse f&uuml;hren zu Reentranz aktive Sonde in die Analyse-Region. Zu Beginn des Wiederherstellungsprozesses k&ouml;nnen einzelne Flecken als sendeten, Beugung begrenzte Signale gel&ouml;st werden. Norm Einzelmolek&uuml;l-Mikroskopie kann dann zur Charakterisierung der Spots in ihrer Zusammensetzung und Beweglichkeit.

Erkennung und Quantifizierung der biomolekularen Association in lebenden Zellen mit Einzelmolek&uuml;l-Mikroskopie.

Durante il loro movimento casuale, biomolecole sperimentare una variet&agrave; di interazioni che transitoriamente congiungere i loro percorsi. &Egrave; estremamente difficile da misurare tali eventi associazione direttamente nel contesto di una cellula vivente: interazioni possono essere breve, essi possono influenzare solo una frazione minoritaria di molecole o non possono portare ad un effetto macroscopicamente osservabile. Descriviamo qui un nuovo metodo di imaging della singola molecola che permette di rilevare e quantificare le associazioni delle molecole cellulari. Da &quot;diradamento grappoli conservando la stechiometria di etichettatura&quot; (TOCCSL), possiamo virtualmente diluire la sonda direttamente nella cella, senza intaccare il contrassegno di fluorescenza del cluster singolo. Essenzialmente, una regione di analisi viene creata all&#39;interno della cella di photobleaching; questa regione &egrave; privo di sonda attiva. Diffusione browniana o altri processi di trasporto portano al rientro della sonda attiva nella regione di analisi. All&#39;inizio del processo di recupero, spot singolo pu&ograve; essere risolta come segnali well-separated, diffraction-limited. Standard singola molecola microscopia permette poi per caratterizzare le macchie in termini di composizione e mobilit&agrave;.

Individuazione e quantificazione dell&#39;associazione biomolecolare nelle cellule viventi mediante microscopia a singola molecola.

&#x5F7C;&#x3089;&#x306E;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x306A;&#x52D5;&#x304D;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x3001;&#x751F;&#x4F53;&#x5206;&#x5B50;&#x306F;&#x4E00;&#x904E;&#x6027;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30D1;&#x30B9;&#x3092;&#x7B49;&#x4F4D;&#x7D50;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x30DE;&#x30CB;&#x30DB;&#x30FC;&#x30EB;&#x30C9;&#x3092;&#x3054;&#x4F53;&#x9A13;&#x304F;&#x3060;&#x3055;&#x3044;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;&#x751F;&#x304D;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AD;&#x30B9;&#x30C8;&#x5185;&#x3067;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x7D50;&#x5408;&#x4E8B;&#x8C61;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x6975;&#x3081;&#x3066;&#x56F0;&#x96E3;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#xFF1A;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x304C;&#x4F4F;&#x3093;&#x3067;&#x3044;&#x305F;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x5C11;&#x6570;&#x5206;&#x753B;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x304C;&#x8089;&#x773C;&#x7684;&#x306B;&#x89B3;&#x5BDF;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x52B9;&#x679C;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x77ED;&#x3044;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x643A;&#x5E2F;&#x96FB;&#x8A71;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5B9A;&#x91CF;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x6CD5;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; &#xFF08;TOCCSL&#xFF09; &#x26;quot;&#x306E;&#x6A19;&#x8B58;&#x306E;&#x4FDD;&#x5168;&#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x3092;&#x9593;&#x5F15;&#x304D;&#x26;quot;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4E8B;&#x5B9F;&#x4E0A;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30BB;&#x30EB;&#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x5E0C;&#x91C8;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x89E3;&#x6790;&#x9818;&#x57DF;&#x304C;&#x9000;&#x8272;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306B;&#x4F5C;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x9818;&#x57DF;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#xB7;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x6B20;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x30D6;&#x30E9;&#x30A6;&#x30F3;&#x62E1;&#x6563;&#x3084;&#x4ED6;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306F;&#x3001;&#x89E3;&#x6790;&#x9818;&#x57DF;&#x306B;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#xB7;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x7A81;&#x5165;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3002;&#x30EA;&#x30AB;&#x30D0;&#x30EA;&#xB7;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x958B;&#x59CB;&#x6642;&#x306B;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30B9;&#x30DD;&#x30C3;&#x30C8;&#x304C;&#x3088;&#x304F;&#x3067;&#x533A;&#x5207;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x56DE;&#x6298;&#x9650;&#x754C;&#x306E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x89E3;&#x6C7A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6A19;&#x6E96;&#x7684;&#x306A;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D44;&#x6210;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30E2;&#x30D3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3;&#x306E;&#x9762;&#x3067;&#x306E;&#x30B9;&#x30DD;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3068;&#x751F;&#x4F53;&#x5354;&#x4F1A;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;

&#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC784;&#xC758; &#xBAA8;&#xC158; &#xB3D9;&#xC548; biomolecules &#xB9E4;&#xB2C8;&#xD3F4;&#xB4DC; transiently &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xACBD;&#xB85C; &#xACB0;&#xD569; &#xD558;&#xB294; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xACBD;&#xD5D8;. &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xCEE8;&#xD14D;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8; &#xB4F1;&#xC744; &#xCE21;&#xC815;: &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC9E7;&#xC740; &#xC0B4; &#xC558; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC18C;&#xC218; &#xC77C;&#xBD80;&#xB9CC; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC904; &#xC218; &#xB610;&#xB294; &#xAC70;&#xC2DC;&#xC801; &#xAD00;&#xCC30;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xD6A8;&#xACFC;&#xB97C; &#xB9AC;&#xB4DC; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xAC10;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xCE21;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &quot;&#xB77C;&#xBCA8;&#xC758; stoichiometry&#xB97C; &#xBCF4;&#xC874; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; &#xBC16;&#xC73C;&#xB85C; &#xC231; &#xC774;&quot;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; (TOCCSL) &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC0AC;&#xC2E4;&#xC0C1; &#xD76C;&#xC11D; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC140;&#xC5D0; &#xC9C1;&#xC811; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130;&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0;. Photobleaching; &#xD558; &#xC5EC; &#xC140; &#xB0B4;&#xC5D0; &#xBD84;&#xC11D; &#xC601;&#xC5ED;&#xC774; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5B4;&#xC9C4; &#xAE30;&#xBCF8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC740; &#xC561;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xC5C6;&#xB294; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. Brownian &#xBCF4;&#xAE09; &#xB610;&#xB294; &#xB2E4;&#xB978; &#xC804;&#xC1A1; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4; &#xBD84;&#xC11D; &#xC601;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xC561;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xC7AC;&#xC785;&#xAD6D;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xC5B4;&#xC9C8;. &#xBCF5;&#xAD6C; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xBC1C;&#xBCD1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAD00;&#xAD11; &#xBA85;&#xC18C; well-separated, &#xD68C;&#xC808; &#xC81C;&#xD55C; &#xC2E0;&#xD638;&#xB85C; &#xD574;&#xACB0;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD45C;&#xC900; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131;&#xACFC; &#xC774;&#xB3D9;&#xC131; &#xCE21;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xAD11; &#xBA85;&#xC18C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB2E4;&#xC74C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD0D0;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xD611;&#xD68C; &#xC0DD;&#xD65C; &#xC140; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;.

Durante su movimiento al azar, las biomol&#xE9;culas experimentar una variedad de interacciones que se conjugan de forma transitoria en su camino. Es extremadamente dif&#xED;cil de medir tales acontecimientos vinculantes directamente en el contexto de una c&#xE9;lula viva: las interacciones pueden ser de corta duraci&#xF3;n, que puede afectar s&#xF3;lo a una fracci&#xF3;n minoritaria de las mol&#xE9;culas, o no puede dar lugar a un efecto macrosc&#xF3;pico observable. Se describe aqu&#xED; un nuevo m&#xE9;todo de una sola mol&#xE9;cula de im&#xE1;genes que permite la detecci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n de las asociaciones de mol&#xE9;culas m&#xF3;viles. Por &#x26;quot;adelgazamiento agrupaciones conservando la estequiometr&#xED;a de etiquetado&#x26;quot; (TOCCSL), que virtualmente puede diluir la sonda directamente en la celda, sin afectar al etiquetado de fluorescencia de conglomerados individuales. Esencialmente, una regi&#xF3;n de an&#xE1;lisis se crea dentro de la c&#xE9;lula por photobleaching; esta regi&#xF3;n est&#xE1; desprovista de sonda activa. Difusi&#xF3;n browniana u otros procesos de transporte llevan a la reentrada de la sonda activa en la regi&#xF3;n de an&#xE1;lisis. En el inicio del proceso de recuperaci&#xF3;n, manchas individuales se pueden resolver como bien separadas y limitadas por difracci&#xF3;n se&#xF1;ales. Est&#xE1;ndar de una sola mol&#xE9;cula de microscop&#xED;a permite entonces que para la caracterizaci&#xF3;n de las manchas en t&#xE9;rminos de su composici&#xF3;n y la movilidad.

Detecci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n de biomol&#xE9;culas en la Asociaci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas vivas utilizando una sola mol&#xE9;cula de Microscop&#xED;a

Mario Brameshuber

Institute of Biophysics

Johannes Kepler Universitat Linz

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Mario Brameshuber

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Johannes Kepler Universitat Linz

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Institute of Biophysics