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Method Article
Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll für die Fluoreszenzmarkierung der verschiedenen Elemente des Herzens Rohre von Larven und erwachsenen Drosophila melanogaster. Diese Proben sind für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie geeignet. Diese Technik ermöglicht detaillierte Strukturanalyse der Funktionen des Herzens von einem leistungsstarken Modell-Organismus.
Die
Bevor Sie beginnen
Fluoreszenzfärbung
Halterung für Adult Herzen
Montage für Larven Herzen
Repräsentative Ergebnisse
Wenn richtig ausgeführt, sollten alle Komponenten und der dazugehörigen Gewebe des dorsalen Gefäß intakt bleiben und leicht sichtbar gemacht werden. Die Hintergrund-Fluoreszenz sollte minimal sein. Für Erwachsene, die ventralen Längs-Muskelschicht Flecken sehr gut und erzeugt eine erhebliche Signal (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die zugrunde liegenden kreisförmigen Kardiomyozyten jedoch eher nicht so intensiv ein Signal, dass der darüberliegenden ventralen Schicht zu erzeugen. Die Myozyten des vorderen "konischen Kammer" des erwachsenen Herzens enthalten eine beträchtliche Menge von kontraktilen Materials und damit erscheint diese Region als die robustesten gegenüber dem Rest des Herzschlauches. Die Larven Herz zeigt eine Spirale myofibrillären Anordnung ähnlich der des Erwachsenen kontraktilen Kardiomyozyten (Abbildung 3).
Abbildung 1: Top. Ein fluoreszierendes Aufnahme zeigt das gesamte Herz-Rohr eines erwachsenen Drosophila melanogaster, dass Myosin-GFP zum Ausdruck bringt. Das Bild wurde mit einem Zeiss-Imager Z1 Fluoreszenzmikroskop mit einer Apotome Schiebe-Modul ausgestattet übernommen. Myosin-GFP in grün angezeigt wird, Aktin ist mit AlexaFluor ® 594 Phalloidin (rot) und α-Actinin gefärbt mit anti-α-Antikörper actinin (blau) markiert. Beachten Sie die präparativen Verfahren ermöglicht Wiederherstellung von Herz-Proben mit gut erhaltenen Strukturen. CC = konische Kammer; AM = Alary Muskel; V = internes Ventil; VLL = ventralen Längs-Muskelschicht. Bottom. Eine Region der erwachsenen Herzschlauchs von der CC durch das 3. Abdominalsegment des Herzens nur unter der ventralen Längs-Schicht zeigt die Spirale Myofibrille Anordnung der kontraktilen Kardiomyozyten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 1a und hier für eine größere Version der Abbildung 1b
Abbildung 2: Repräsentative konfokalen Stapel von einer vorderen Teil des erwachsenen Herzens mit AlexaFluor ® 594 Phalloidin (rot) und ein Anti-Pericardin (Kollagen Typ IV) (grün)-Antikörper gefärbt. Pericardin ist mit dem Herzen an der ventralen Fläche verbunden sind, wahrscheinlich aus dem längsorientierten Myofibrillen der ventralen Muskelschicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 3: Ein fluoreszierendes Aufnahme Segment A7 des Herzens ordnungsgemäße einer dritten Stufe Drosophila Larve. Das Bild wurde mit einem Zeiss-Imager Z1 Fluoreszenzmikroskop mit einer Apotome Schiebe-Modul ausgestattet übernommen. Aktin ist mit AlexaFluor ® 594 Phalloidin (grün) und α-Actinin beschriftet ist mit Anti-α-Antikörper actinin (rot) gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 3 dargestellt.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, die zur Herstellung und Färbung der Drosophila melanogaster dorsalen Gefäß und der dazugehörigen Gewebe für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie. Wir bieten eine übersichtliche Darstellung der Schritte verfeinert und am häufigsten in unserem Labor für eine effektive Färbung, die gut aufgelösten erlaubt in situ Darstellung von Larven und erwachsenen Drosophila Herzen Rohre eingesetzt. Andere haben ähnliche Methoden in ab...
Die Autoren danken SI Bernstein (San Diego State University) für die kritische Durchsicht und Anregungen in Bezug auf die Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt SI Bernstein, SDSU, und R. Bodmer, BIMR unterstützt, und durch ein Postdoc-Stipendium von der Western States Partner der American Heart Association zu G. Vogler und A. Cammarato.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12381 | |
Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1200 | |
Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
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