Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Zusammenfassung

SC1 Funktionen durch duale Hemmung des Ras-GAP und ERK1. Wir testeten die Funktion von SC1 in Unterstützung von Maus ES-Zell-Selbst-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF und zeigte, dass SC1 in der Lage, sich selbst zu erneuern von Maus-ES-Zellkulturen zu halten ist.

Zusammenfassung

Maus embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind konventionell mit Leukämie Inhibitory Factor (LIF), um sich selbst zu erneuern pflegen kultiviert.

Protokoll

1. Vorbereitung der MEF Feeder-Platten

1. Einen Tag vor Kultivierung ES-Zellen, Tauwetter ein Fläschchen von bestrahlten E14.5 CF-1 MEF Feeder-Zellen (siehe unsere Vorgehensweise zum ES-Zellen auftauen).
2. Platte der MEF Feeder-Zellen bei einer Dichte von 10.000 Zellen / Well in einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2. MEF Zellen Medien: DMEM mit 10% ES-PBS, 1X Glutamin und 1X nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt.

2. Wartung von Self-Erneuerung der Maus ES-Zellen

1. Lösen Sie die ES-Zellen unter Verwendung von Trypsin. Seed die Zellen bei einer Dichte von 50.000 Zellen / well auf die zuvor vorbereiteten MEF Feeder-Platten in Nährmedien (Knockout MEM mit 15% KSR, 4 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1X BME ergänzt) mit SC1 ergänzt in der gewünschten Konzentration (wir haben 100 nM, 300 nM und 1 pM). Außerdem haben wir eine positive Kontrolle gut, dass mit 1000 μ / ml LIF ergänzt wurde. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 3-4 Tage in jedem Durchgang. Refresh Medien alle 48 Stunden.
3. Passage-Zellen von 1.10 bis 01.15 Uhr mit Trypsin ein ähnlicher Dichte wie die erste Aussaatdichte aufrecht zu erhalten. Nach 5 Passagen, können die Zellen auf die Expression von typischen Pluripotenz Marker mit Immunzytochemie untersucht werden.

3. Immunzytochemische Untersuchung der Pluripotenz Markers

1. Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
2. Fix die Zellen mit 500 ul Fixativ für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
4. Block unspezifische Bindung mit 500 ul Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.
5. Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des spezifischen primären Antikörper (wir Nanog, Sox2, SSEA1 und Oct4 bei den folgenden Verdünnungen: 1:500, 1:2000, 1:500 und 1:500)
6. Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
7. Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des sekundären Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur, hielten sich fern von Licht (wir haben Esel anti-Maus konjugiert mit Alexa Fluor ® 555 bei 1:2000 und Esel-anti-Kaninchen konjugiert mit Alexa Fluor ® 488 bei 1 : 2000).
8. Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
9. Add DAPI (Endkonzentration 1 pg / ml) auf dem letzten Waschen und Inkubation 5 Minuten, um Kerne zu visualisieren.
10. Analysieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

4. Repräsentative Ergebnisse:

1. Morphologie Ergebnisse:

Maus ES-Zellen (ESC R1) wurden am MEF Feeder-Zellen in Anwesenheit von entweder LIF oder SC1 gewachsen zu Selbst-Erneuerung in einem undifferenzierten Zustand halten. Nach dem zweiten Durchgang konnte die Differenzierung in Zellen ohne LIF oder SC1 (negative Kontrolle) beobachtet werden und nach 5 Passagen im Wesentlichen keine undifferenzierte Kolonien beobachtet wurden. LIF (positive Kontrolle) behandelt Kolonien blieb in einem undifferenzierten Zustand in den 5 Zellpassagen. Zellen, die mit SC1 in Konzentrationen von 300 nM oder 100 nM behandelt blieb auch nach 5 Passagen undifferenziert, aber die Zellen mit 1 uM SC1 erfahrenen Zelltod nach dem vierten Durchgang behandelt. (Bild 2 von app beachten) Tabelle 1 fasst die morphologische Beobachtungen.

2. Expression der Pluripotenz Markers

Maus ES-Zellen für 5 Passagen beibehalten wurden fixiert und untersucht durch Immunzytochemie für SSEA1, Oct4, Nanog und Sox2. Marker-Expression wurde ähnlich wie Zellen in LIF erhalten. (Abb. 3 und 4 des app beachten)

Abbildung 1: Morphologie Vergleich von Zellen in LIF oder SC1 gepflegt. Kein Unterschied in der Morphologie beobachtet.

Abbildung 2 und Abbildung 3: Nanog, SSEA1, Sox2 und Oct4 Färbung von ES-Zellen mit SC1 oder LIF (Abb. 4 von ca. beachten) gepflegt. Cells in SC1 gepflegt zeigen ähnliche Pluripotenz-Marker zum Ausdruck Zellen in LIF erhalten.

Tabelle 1

	Negative Control	LIF Positive Control	SC1 1um	SC1 300 nM	SC1 100 nM
1. Besuch	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie
2. Passage	Einige differenzierte Morphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie
3. Passage	Mehrzahl der Zellen differenziert	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie
4. Passage	Kein ESC Kolonien	Normale ES Zellmorphologie	Der Zelltod beobachtet	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie
5th Passage	differenziert	Normale ES Zellmorphologie	Der Zelltod beobachtet	Normale ES Zellmorphologie	Normale ES Zellmorphologie

Diskussion

Das kleine Molekül SC1 kann zur Selbst-Erneuerung mit einem undifferenzierten Zustand in Maus-ES-Zellen zu erhalten. Vor dem Einsatz auf einer ungeprüften Zelllinie, jedoch sollte es titriert auf die optimale Konzentration zu bestimmen. Zum Beispiel, testeten wir drei Konzentrationen auf der Maus-ES-Zelllinie ESC R1. 100 nM und 300 nM Konzentrationen konnten Maus-ES-Zellen zu erhalten, war jedoch ein 1 pM Konzentration giftig.

SC1 kann auch unter Feeder-freien Bedingungen verwendet werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279