Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Zusammenfassung

Zusammenfassung

Protokoll

Reverse-Transkriptase-Reaktion

Schalten Heizblock auf 70-80 ° C und 42 ° C. Wasserbäder können auch in diesem Schritt verwendet werden. Wenn Sie Heizblöcke, setzte Wasser, so dass die Wärme gleichmäßig ist.

1. Primingreaktion
   1. Take 3 pg RNA
   2. Stellen Sie die Lautstärke auf 13 ul mit RNase freiem Wasser
   3. Add 2,5 ul random Hexamer Primer (2mg/mL)
2. Gut mischen und inkubieren bei 70-80 ° C für 8 Minuten. Dann, auf Eis für 5 min.
3. Bereiten RT-Cocktail (14,5 ul / rxn):
   
   

   Komponente	Volumen
   5X First Strand Buffer	6 ul
   0,1 M DTT	3 ul
   25X aminoallyl-dNTP-Mix	1,2 ul
   SuperScript II RT (200U/μl)	2,3 ul
   Wasser	2,0 ul

   
   * Für n Reaktionen vorzubereiten Master Mix für n +0,5 Aliquots Cocktail, um sicherzustellen, dass Sie nicht ausgehen.
   
   
4. Add 14,5 ul gekühlt Reaktionen.
5. Mix (nicht vortexen) und inkubieren bei 42 ° C für 3-4 Stunden
6. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, wenn nötig.

Hydrolysieren RNA

1. Zu jeder Probe, addiere 3 ul 1 N NaOH und 0,6 ul 0,5 M EDTA. (Final conc.s = 100mm NaOH, 10 mM EDTA)
2. Mix und Inkubation bei 65 ° C für 10 Minuten.
3. Neutralisieren, indem 33,6 ul 1M HEPES, pH = 7,0 (Endkonzentration 500 mM HEPES .=)
4. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, falls erforderlich.

Reaction Reinigung: Entfernung von Personengesellschaften aa-dUTP und freie Amine

Hinweis: Diese Reinigung Protokoll wird von der Qiagen QIAquick PCRpurification Kit-Protokoll geändert. Die Phosphat-Wasch-und Elutionspuffer für die Qiagen mitgelieferten Puffern ersetzt, weil die Qiagen-Puffer freie Amine, die mit dem Cy-Farbstoff-Kupplungsreaktion konkurrieren enthalten. Die Spalten aus der Mini-Prep Kit kann auch verwendet werden.

1. Mix cDNA-Reaktion mit 300 pl (oder 5x Reaktionsvolumen = 336 ul) Puffer PB (Qiagen mitgeliefert) und Transfer zum QIAquick Säule.
2. Legen Sie die Säule in ein 2 ml Sammel-Tube (Qiagen mitgeliefert) und Zentrifuge bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute. Leere Sammelrohr.
3. Um Waschen 750 ul Phosphat Waschpuffer (nicht Qiagen) auf die Säule und zentrifugieren bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute.
4. Leeren Sie den Deckel ab und wiederholen Sie die 750 ul waschen und Zentrifugationsschritt.
5. Leeren Sie den Deckel ab und Zentrifuge der Spalte 1 weitere Minute bei maximaler Geschwindigkeit.
6. Transfer-Säule in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig 30 mu l Phosphat Elutionspuffer. (Siehe Lösung Vorbereitung Abschnitt)
7. Inkubation für 1 Minute bei Raumtemperatur.
8. Eluieren durch Zentrifugation bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute.
9. Eluieren ein zweites Mal (mit einem anderen 30 ul Phosphat Elutionspuffer) in das gleiche Rohr durch Wiederholen der Schritte 6-8. Die endgültige Elutionsvolumen sollte ~ 60 ul werden.
10. Die Höhe der cDNA kann in diesem Stadium quantifiziert werden:
    ng cDNA = (Verdünnungsfaktor) (OD260) (37) (Gesamtvolumen von eluiert)
11. Dry Probe in einem Speed ​​Vac bei 45 ° C.
12. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, wenn nötig.

Coupling aa-cDNA zu Dye Ester Cy

1. Resuspendieren aminoallyl-markierten cDNA mit 10 ul 50 mM Na-Bicarbonat, pH = 9,0, wenn nötig. (Dieser Puffer sollte frisches alle zwei Wochen durchgeführt werden)
2. Arbeiten an einem dunklen Ort, fügen Sie die Sonde an einem Schlauch der entsprechenden Cy-Farbstoff. Pipet nach oben und unten mehrmals zu resuspendieren des Farbstoffs.
3. Inkubieren Sie die Reaktion für 1 Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur. (Incubation kann bis zu 2 Stunden)

Reaction Purification II: Entfernung von ungekoppelten Farbstoff

1. Um die Reaktion hinzu 35 ul 100 mM NaOAc pH 5,2. Gründlich mischen.
2. Add 250 ul (oder 5x Reaktionsvolumen = 225 ul) Buffer PB (Qiagen im Lieferumfang enthalten) zu jeder Probe und mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren.
3. Legen Sie eine QIAquick Spin-Säule in ein 2 ml Sammel-Tube (Qiagen mitgeliefert), die Probe auf die Säule und zentrifugieren bei ~ 13.000 für 1 Minute. Leere Sammelrohr.
4. Zum Waschen 0,75 ml Puffer PE (Qiagen mitgeliefert) an die Säule und zentrifugieren bei ~ 13.000 für 1 Minute.
5. Wiederholen Sie Schritt 4.
6. Leere Sammelröhrchen und Zentrifugationssäule für 1 weitere Minute bei maximaler Geschwindigkeit.
7. Legen Spalte in ein sauberes 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig 30 ul Puffer EB (Qiagen mitgeliefert) an die Mitte der Säule Membran.
8. Inkubation für 1 Minute bei Raumtemperatur.
9. Eluieren durch Zentrifugation bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute.
10. Eluieren ein zweites Mal in das gleiche Rohr durch WiederholungSchritte 7-9. Der letzte eluierte Volumen sollte ~ 60 ul werden.

Die Analyse der Labeling Reaction

Die Höhe der cDNA und Label kann in diesem Stadium quantifiziert werden:

• Messen OD 260, 550 und 650 (Blank ist Wasser.) Verwenden Sie NanoDrop Microarray-Programm.
• Berechnen Sie die pmol von Farbstoffen Einarbeitung und pmol DNA und nuc / Farbstoff-Verhältnis bei gegebener Gleichungen unter:
  
  pmol Nukleotiden = [OD260 * Volumen (ul) * 37 ng / ul * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol

Anmerkung: 1 OD260 = 37 ng / ul für cDNA; 324,5 pg / pmol Molekulargewicht eines dNTP)
pmol Cy3 = OD 550 * Volumen (ul) / 0,15
pmol Cy5 = OD650 * Volumen (ul) / 0,25
Nukleotide / Farbstoff-Verhältnis = pmol cDNA / pmol Cy Farbstoff

Wenn Sie NanoDrop sind, es gibt bereits pmol / ul für jeden Farbstoff. Sie müssen nur diese Zahl nach Volumen zu multiplizieren, um insgesamt pmol Farbstoff Einarbeitung erhalten.

Hinweis:> 150-200 pmol des Farbstoffs Einbau pro Probe und einem Verhältnis von weniger als 20 Nukleotiden / Farbstoffmoleküle ist optimal für die Hybridisierungen.

• Die Proben können bei -20 ° C bei Dunkelheit gelagert werden.
  • Kombinieren Sonden zusammen hybridisiert werden und trocken in Speedvac bei 42 ° C.
  • Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, bis bereit hyb.

Pre-hyb Dias

1. Legen Sie schieben dem Gesicht nach unten über RT 100 ml Wasser in einem sauberen roten Diahalter für 3-5 Minuten
2. Snap trocken die Folie, indem Sie offen auf einem 100 ° C Heizblock für ein paar Sekunden - Uhr für die Kondensation zu verschwinden
3. UV Vernetzung der Folie bei 250 mJoules (Enter 2500 bis die UV-Vernetzer)
4. Hydrate gleitet durch Eintauchen in vorgewärmten 42 ° C Wasser. Spin 5 min bei 700 RPM bei RT.
5. Inkubieren in 50ml Coplin Gefäß mit vorgewärmten pre-hyb (5XSSC, 1% BSA, 0,1% SDS) für mindestens 45 Minuten bei 42 ° C, und die Inkubation kann länger gehen, wenn nötig.
   
   50 ml pre-hyb Puffer: 12,5 ml 20x SSC, 10 ml 5% BSA, 0,5 ml 10% SDS, 27 ml Wasser
   
   
6. Dip Slides in vorgewärmte Wasser (42 ° C) und rühren ein paar Minuten vor hyb Puffer zu entfernen.
7. Spülen in Isopropanol und Spin 5 min bei 700 rpm, Raumtemperatur, um zu trocknen.

Vorbereitung der Proben für die Hybridisierung

1. Resuspendieren Sonde in Wasser (Bände sind unten angegeben)
   
   

   Für insgesamt vol. = 30μl	Für insgesamt vol. = 35μl	Für insgesamt vol .= 40 ul
   19,8 ul Wasser	23,55 ul Wasser	27,2 ul Wasser
   1,5 ul	1,5 ul	1,5 ul	10 mg / ml Lachssperma-DNA (Invitrogen)
   1,2 ul	1,2 ul	1,2 ul	12,5 mg / ml tRNA
   4,5 ul	5,25 ul	6 ul	20XSSC (3X endg.)
   3 ul	3,5 ul	4 ul	1% SDS

   
   Hinweis: Die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien sind wichtig. Bereiten Sie nicht Mastermix.
   
   
2. 5 Minuten lang kochen, dann Spin 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Cool für 2 min bei Raumtemp.

Hybridisierung

1. Add 10-12 ul von 3X SSC in die Vertiefungen der Hybridisierung Kammer an jeder Kante und in der Mitte.
2. Fügen Sie einen sauberen Heber Schlupf an den entsprechenden Bereich der Folie und sanft in Hybridisierungslösung Last (30 -40 ul). Es sollten zusätzliche Probe auf beiden Rand des Deckglases werden.
3. Legen Sie die Folie in der Kammer. Ziehen Sie die Schrauben und in einem 65 ° C Wasserbad über Nacht. Stellen Sie die Kammer direkt auf den Boden des Wasserbades. Legen Sie einen Block auf der Oberseite des obersten Kammer, alles in Position zu halten. Halten Sie den Deckel auf dem Wasserbad auf die lichtempfindliche Proben schützen.

Hyb Wäscht

1. Bereiten Sie die folgenden Puffer:
   • 1X SSC, 0,05% SDS
   • 0,06 x SSC
2. Nach der Inkubation entsiegeln Hybridisierung Kammer. Entfernen Sie die Folie aus der Kammer, dabei nicht zu dem Deckglas zu stören.
3. Um Deckgläser zu entfernen, tauchen Folien in einer Schale mit warmem 1X SSC, 0,05% SDS Waschpuffer Deckglas mit Blick auf den Boden der Schale. Das Deckglas fallen ab, indem Sie die Folie hin und her.
4. Nach dem Deckglas entfernt wird, legen Sie die Folie in einem Rack ein frisches Bad mit warmem 1XSSCm 0,05% SDS. Agitieren für ein paar Minuten
5. Objektträger und Rack, um ein Bad von 0,06 X SSC.
6. Objektträger zu einem anderen bath von 0,06 X SSC mit einem frischen Rack, Blotting die Folie auf ein Papiertuch, um so viel SDS-haltigem Puffer wie möglich, bevor Sie in den frischen Bad zu entfernen.
7. Agitieren Dias für ein paar Minuten.
8. Spin sofort bei Raumtemperatur für 5 min bei 700 rpm, gleitet dann sind bereit zum Scannen. Lagerung im Dunkeln, bis gescannt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.