Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Zusammenfassung

Zebrafisch als leistungsfähige entstanden In vivo Plattform für Phänotyp-basierten Wirkstoff-Bildschirme und chemisch-genetischen Analyse. Hier zeigen wir eine einfache, praktische Methode zur groß angelegten Screening von kleinen Molekülen mit Zebrafisch-Embryos.

Zusammenfassung

Aufgrund ihrer kleinen Größe Embryo, schnelle Entwicklung, Transparenz, Fruchtbarkeit und zahlreichen molekularen, morphologischen und physiologischen Ähnlichkeiten zu den Säugetieren, hat Zebrafisch als leistungsfähige entstanden

Protokoll

1) Zebrafisch Egg Collection

1. Am Nachmittag vor dem Tag der chemischen Bildschirm einrichten 10 bis 20 Zebrafisch Zuchtbecken. Füllen Sie die einzelnen Behälter mit Wasser aus der Aquakultur System. Mit einem Fangnetz, Transfer ein erwachsenes Männchen und 1-2 erwachsenen Weibchen zu Innenbehälter in jedem Aufzuchtbecken. Separate der männlichen und weiblichen Fische voneinander mit einem Teiler. Beschriften Sie die Käfige und einen Deckel über sie.
2. Am Morgen des Bildschirms, entfernen Sie die Teiler von Zuchtbecken und ermöglichen Zebrafisch zu paaren. Im Laufe der nächsten 1 Stunde ermöglichen befruchteten Eizellen durch das Gitter an der Unterseite eines jeden inneren Behälter fallen.
3. Nach 1 Stunde zurück Erw. Zebrafisch zurück zur permanenten Speicher, entfernen Sie den inneren Behälter und sammeln die Eier durch Anstrengung das Wasser in jedes Aufzuchtbecken durch eine Kunststoff-Teesieb.
4. Kehren Sie die Sieb über einer Petrischale und spülen Sie das Sieb vorsichtig, um die Eier in die Petrischale bündig mit einer Waschflasche mit dem E3 Medium.
5. Alle unbefruchteten Eiern, die undurchsichtig erscheinen, sollten entfernt mit einem Einweg-Kunststoff-Pipette werden. Jede Paarung Kreuz sollte Ausbeute etwa 200 Embryonen.

2) Arraying Embryos in 96-well Platten

1. Transfer ca. 5 Embryonen in E3 Medium in jedes Well einer 96-Well-Platte mit einem Glas Pasteur Pipette.
2. Einmal Embryonen auf die 96-Well-Platte sind aufgereiht, entfernen Sie so viel von der E3 Medium wie möglich aus dem Brunnen mit einem 12-Kanal (30 bis 300 ul) Pipette, dabei nicht zu durchstechen des Embryos. Mit dem 12-Kanal-Pipette, liefern 250 ul E3-Medium mit Kanamycin 0.5μg/ml in jede Vertiefung so schnell wie möglich, um nicht zu erlauben Embryonen zu versiegen.
3. Setzen Sie die 96-Well-Platten in 28,5 ° C Inkubator bis sie die gewünschte Stufe, wenn die Verbindungen hinzugefügt werden zu erreichen.

3) Übertragung von Small Molecule-Bibliothek

Während Verbindung Transfer mit Roboter-Transfer-Methoden automatisiert werden können, beschreiben wir die manuelle Methode zur Übertragung.

1. Kleines Molekül-Bibliotheken werden in der Regel in einer 96-Well-Format geliefert, wobei jede Verbindung in DMSO als 10 mM Lager abgelegt. Etwa 60 Minuten vor der Embryonen das Stadium erreicht, wenn die Verbindungen hinzugefügt werden sollen, Tauwetter eine gewünschte Anzahl von 96-well-Platten mit Aliquots von kleinen Molekülen (Quelle Platte). Beachten Sie die Seriennummer oder sonstige Identifizierungsnummer der Quelle Platten. Zur Minimierung von Kondenswasser auf den Platten, kann Auftauen in einer Austrocknung Kammer mit Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH) auftreten.
2. Kurz-Spin-Down der Platten in einer Tischzentrifuge mit Multi-Well-Platte-Adapter ausgestattet.
3. Entfernen Sie die Aluminium-Versiegelung von Quelle Platte. Mit einem 12-Kanal-Pipette, verdünnte die Verbindungen in die Quelle Platte, um die Konzentration von 0,5 mM (zum Beispiel, wenn beginnend mit 250 nL Aliquots von 10mM Lager, fügen 4,75 l DMSO in jede Vertiefung).
4. Wenn die Embryonen in der 96-Well-Platte (Empfänger Platte) den gewünschten Zustand zu erreichen, verwenden Sie ein 12-Kanal (2-20 mL) Pipette 2.5μL von Verbindungen (0,5 mm) von der Quelle Platten Transfer in die Empfänger-Platten, die die Embryonen.
5. Notieren Sie sich die Kennnummer der Quelle Platten auf den Empfänger Embryo Platten. Decken Sie die Empfänger-Platten nun mit den Embryonen und Verbindungen mit Deckel, vorsichtig mischen die Platten durch vorsichtiges Schwenken, und legen Sie sie in einem 28,5 ° C Inkubator.
6. Cover jede Quelle Platte mit ungenutzten kleinen Molekülen (0,5 mM) mit einem Aluminium-Dichtband und in einem -80 ° C Gefrierschrank für langfristige Lagerung.

4) Vorsorgeuntersuchungen für Wirkung von kleinen Molekülen durch visuelle Inspektion der Phänotypen

1. Vor der Durchführung des Bildschirms, formulieren ein bestimmtes Kriterium für das, was wäre ein "Hit" darstellen.
2. Am gewünschten Zeiten in der Entwicklung, entfernen Sie die 96-well-Platten, die Verbindung behandelten Embryonen aus Inkubator und prüfen jede Vertiefung unter einem Stereomikroskop. Zur besseren Visualisierung von subtilen Veränderungen, wie zum Beispiel Änderungen in Kreislauf-Muster kann eine Phasen-Kontrast-inverse Mikroskop verwendet werden. Fluoreszenz-Mikroskopie kann verwendet werden, um Störung der Expression von GFP oder DsRed Proteine ​​unter einer Gewebe-spezifischen Promotor zu untersuchen.
3. Schnell die 96-Well-Platten für alle gut in die mindestens 3 von 5 Embryonen zeigen die vorgeschriebenen "Hit"-Phänotyp. Notieren Sie sich die Identität der Platte und die auch Standort eines jeden potentiellen Hit.
4. Bestätigen Sie ein potentieller Hit von erneute Testen der Auswirkungen der Verbindung bei mehreren Dosen (1 uM, 5 uM, 10 uM und 50 uM). Für jede Dosis wurden 10 Embryonen in 0,5 ml E3-Medien in einer 48-Well-Platte-Format getestet. Der Zeitpunkt der Verbindung hinaus für eine erneute sollte identisch mit dem des ursprünglichen Screening. Ein Hit ist bestätigt, wenn die ausgelöste Phänotyp auf einen erneuten Test der compoun wiedergegebend
5. Identifizieren Sie die Hit-Verbindung aus der Datenbank von kleinen Molekülen in der chemischen Bibliothek.

Diskussion

Bei der Planung eines Zebrafisch-basierte chemische Bildschirm, muss besonderes Augenmerk auf die Robustheit der Phänotyp unter Berücksichtigung der Hintergrund von solchen Phänotyp bezahlt werden. Dies ist besonders wichtig für Bildschirme für chemische Suppressoren einer induzierten Phänotyp. Zum Beispiel für einen Phänotyp durch Hitze-Schock-Induktion einer Transgen hervorgerufen, die Bedingung, dass der Phänotyp induziert reproduzierbar muss genau abgebildet werden aus vor Beginn der Bildschirm zu unvertret...

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