Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Zusammenfassung

Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Zusammenfassung

Multiplex PCR / Reverse Line-Blot-Hybridisierung Assay erlaubt den Nachweis von bis zu 43 molekularen Ziele in 43 Proben mit einer Multiplex-PCR-Reaktion durch Sondenhybridisierung auf eine Nylon-Membran, die wieder verwendbar ist, gefolgt. Die Sonden sind 5 'Amin modifiziert, um die Fixierung der Membran zu ermöglichen. Primer sind 5 'Biotin modifiziert denen der Nachweis der hybridisierten PCR-Produkte unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase und einem Chemilumineszenz-Substrat über lichtempfindliche Folie ermöglicht. Mit niedrigen Aufbau und die Kosten für Verbrauchsmaterialien, ist diese Technik kostengünstig (ca. US $ 2 pro Probe), einen hohen Durchsatz (mehrere Membranen können gleichzeitig verarbeitet werden) und hat eine kurze Turnaround-Zeit (ca. 10 Stunden).

Die Technik kann in eine Reihe von Möglichkeiten genutzt werden. Mehrere Sonden können zur Folge Variation innerhalb einer einzigen amplifizierten Produkts erkannt werden, oder mehrere Produkte gleichzeitig verstärkt werden, mit einem (oder mehreren) Sonden für die anschließende Detektion verwendet. Eine Kombination der beiden Ansätze können auch innerhalb eines einzigen Assay verwendet werden. Die Fähigkeit, mehrere Sonden für ein einzelnes Ziel-Sequenz enthalten ist der Test sehr spezifisch.

Veröffentlichte Anwendungen von MPCR / RLB umfassen die Detektion von Antibiotika-Resistenzgene ^1,2, Typisierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus ^3-5 und Salmonella sp ^6, molekulare Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae ^7,8, Streptococcus agalactiae ⁹ und Enteroviren ^10,11, Identifikation von Mycobacterium sp ^12, Erkennung von genitalen ^13-15 und Atemwege ¹⁶ und ¹⁷ anderen Krankheitserregern und Detektion und Identifizierung von Mollicutes ^18. Das bedeutet jedoch, die Vielseitigkeit der Technik der Anwendungen sind nahezu unbegrenzt und nicht auf molekulare Analyse von Mikro-Organismen beschränkt.

Die fünf Schritte in MPCR / RLB sind a) Primer und Probe-Design, b) DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation c) Herstellung der Membran, d) Hybridisierung und Detektion, und e) Regeneration der Membran.

Protokoll

Die sorgfältige Abwägung muss Primer und Sonde Design gegeben werden. Alle verfügbaren Sequenzen der Ziele von Interesse aus Datenbanken wie GenBank sollten genutzt werden, um konservierte Bereiche, die geeignete Ziele sind zu identifizieren. Wo eine große Anzahl von Zielen zu werden in einem einzigen Assay MPCR verstärkt, sollte jedes amplifizierte Sequenz, die ähnlich lang sein und sollte nicht mehr als 300 Basenpaare, um Wettbewerbsverzerrungen zu vermeiden. Eine alternative Anwendung der Methode ist es, eine längere Ziel mit Primern gegen konservierte Regionen zu verstärken und auf mehrere Sonden zu verwenden, um Sequenzvariation innerhalb des Amplikons zu identifizieren. In diesem Fall kann die amplifizierte PCR-Produkt länger sein. Primer Glühtemperaturen sollten alle ähnlich sein, mit PCR-Bedingungen angepasst. Primer, die starke sekundäre Struktur oder Primer-Dimer-Form sollte vermieden werden. Die Sigma Aldrich DNA-Rechner ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) können verwendet werden, um zuverlässig vorhersagen diese Funktionen sein.

DNA-Sonden sollten so gestaltet sein müssen Glühtemperaturen nahe 60 ° C werden Zur Maximierung der Spezifität, können zwei Sonden für jedes Ziel von Interesse in der Assay, einer Hybridisierung an den vorderen DNA-Strang neben dem Reverse-Primer-Bindungsstelle, und die andere auf der Rückseite Strang neben dem Forward-Primer-Bindungsstelle enthalten sein. In diesem Fall müssen sowohl vorwärts und Rückwärts-Primer werden Biotin-modifizierte. Wenn nur eine Sonde pro amplifizierte Target verwendet wird, dann nur ein Primer benötigt werden Biotin modifiziert.

Bei der Gestaltung von Primer und Sonden für die MPCR / RLB-Assay ist es dringend empfohlen, in silico-Methoden verwenden, um PCR-Produkte und Sondenhybridisierung vorherzusagen, mit der in-vitro-Ergebnisse korrelieren. Idealerweise geschieht dies durch Isolate, für die das gesamte Genom-Sequenz ist verfügbar. Software wie FastPCR (abrufbar unter http://primerdigital.com/fastpcr.html) kann für diesen Zweck verwendet werden. Schwache oder fehlende Sondensignal vorhersagen, wo in silico-Analyse zeigt Basenpaar Mismatches was zu niedrigen Sonde Glühtemperaturen werden.

DNA-Extraktion Techniken werden je nach den Proben getestet, und PCR-Bedingungen wird davon abhängen, Primer-Design. Leser werden auf Veröffentlichungen zu einzelnen Assays für weitere Informationen über DNA-Extraktion und PCR Reagenzien und Bedingungen ^1-19 bezeichnet.

Jeder Test wird mit geeigneten Kontrollen ausführen, um mindestens eine positive und eine negative Probe-Signal für jede Sonde auf der Membran, sowie eine DNA-freien Kontrolle. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, eine Sonde an der Spitze der Membran, die voraussichtlich für alle Proben (zB: eine Art oder Gattung spezifische Sonde im Falle eines Mikro-Organismus) positiv ist, enthalten. Dies dient als positive Kontrolle Sonde, sondern erlaubt auch eine leichte Orientierung der Ergebnisse.

1. Vorbereitung der Membrane

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
   • 100ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8,4)
   • 100 ml 0,5 M NaHCO ₃
   • 20 ml 16% EDAC
   • 250 ml 0,1 M NaOH
   • 250 ml 2xSSPE
   • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - im Wasserbad bei 60 ° C
   • 250 ml 20 mM EDTA.
2. Pre-Ofen auf 60 ° C.
3. Reinigen Sie die Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol.
4. Verdünnen Sie die Oligonukleotid-Sonden in 0,5 M NaHCO _3, um eine endgültige Konzentration von 2 pmol / ul und einem Volumen von 200 ul.
5. Schneiden Sie ein BiodyneC Nylonmembran zu 15x15 cm. Mit einem Bleistift und Lineal, Regel aus einer 0,5 cm Platz zwischen oberen Membran und schreiben Details hier.
6. Seal Membran in Plastikbeutel mit 20 ml frisch zubereitete 16% EDAC Lösung und Rock bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
7. Wash-Membran in VE-Wasser für 30 Sekunden.
8. Legen Membran in miniblotter mit Kanälen laufen durch die Membran (parallel zur Bleistift-Linie). Put Stützkissen in ein und schließen Sie Löschblatt. Aspirieren Flüssigkeit aus den Kanälen.
9. Füllen Sie den Spuren 1 und 45 mit 150 ul 0,5 M NaHCO _3. Verwenden Sie 150 ul jeder Sonde Lösung Bahnen 2-44 in Folge zu füllen, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden. Wenn eine Luftblase in den Kanal angezeigt wird, halten Sie die Pipette in Ort, rasch absaugen die Lösung, damit die Luftblase an die Spitze der Pipette float, dann wiederholen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
10. Absaugen Sonde Lösungen, entfernen Membran und waschen in 250 ml 0,1 M NaOH bei Raumtemperatur für 9 Minuten.
11. Wash-Membran in 250 ml 2xSSPE für 30 Sekunden.
12. Wash-Membran in 250 ml vorgewärmten 2xSSPE/0.1% SDS im Ofen bei 60 ° C für 5 Minuten.
13. Wenn nicht für die Hybridisierung verwendet werden sofort waschen Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 20 Minuten (Reservierung restlichen 10ml), dann Dichtungsmembran in Plastiktüte mit den restlichen 10 ml 20 mM EDTA und Lagerunge im Kühlschrank bei 4 ° C.
14. Wash miniblotter mit Pyroneg Spülmittel und Bürste. Spülen und trocknen lassen.

2. Hybridisierung und Detektion

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
   • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C.
   • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C
   • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Ofen bei 42 ° C
   • 500 ml 2xSSPE - halten bei Raumtemperatur
   • 500 ml 1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C zunächst (für Schritt 3)
   • 250 ml 20 mM EDTA - bei Raumtemperatur lagern (für Schritt 3).
2. Biegen Sie an einem Ofen bei 60 ° C und einem Ofen auf 42 ° C. Bringen Sie Wasser in einem großen Becherglas auf einer Heizplatte kochen.
3. Saubere Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol.
4. Aliquot von 10 ml 2xSSPE/0.1% SDS in einen kleinen Behälter. Fügen Sie 20 ul jedes PCR-Produkt zu 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS in nummerierten Röhrchen.
5. Boil PCR-Produkte für 10 min bei 100 ° C mit Styropor Inhaber. Legen Sie auf dem Eis sofort für mindestens 5 Minuten.
6. Wash-Membran in den restlichen 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS in 60 ° C im Ofen für 5 Minuten.
7. Legen Membran in miniblotter mit Polster. Orientieren so Kanälen verlaufen vertikal (senkrecht zur Bleistift-Linie).
8. Saug überschüssige Flüssigkeit aus miniblotter Kanäle.
9. Die restlichen 150 pl 2xSSPE/0.1% SDS, um erste und letzte Kanäle. Add gekocht PCR-Produkte, um die verbleibenden Kanäle (2-44) in der Reihenfolge, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden.
10. Legen Sie miniblotter flach in 60 ° C im Ofen für 1 Stunde, damit Hybridisierung stattfinden.
11. Absaugen von Flüssigkeit aus jedem Kanal entfernen Membran aus miniblotter.
12. Zweimal waschen in vorgewärmte 250 ml 2xSSPE/0.5% SDS in 60 ° C im Ofen für 10 Minuten.
13. Befeuchten Nylon Trennung Mesh mit 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und es verwenden, um Roll-up-Membran.
14. Legen aufgerollt Membran in Tuchwelle und entfalten, um sicherzustellen, Membran liegt an der inneren Oberfläche. Add 3 ul Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche Applied Science) zu 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und Tuchwelle hinzuzufügen. Schraubverschluss fest zu und inkubieren in Rollen Ofen bei 42 ° C für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, Richtung rollen ist so, dass Membran nicht anziehen. Überprüfen Sie regelmäßig auf Dichtheit prüfen.
15. Wash miniblotter in Pyroneg Reinigungsmittel und Wasser, spülen und trocknen lassen.
16. Entfernen Membran aus Tuchwelle. Zweimal waschen in übrigen 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C für 10 Minuten.
17. Zweimal waschen in 2xSSPE bei Raumtemperatur für 5 min.
18. Schalten Sie Backofen bis zu 80 ° C und Ort 500ml 1% SDS in Ofen zur Vorwärmung.
19. Make up 15 ml Amersham ECL Detection-Lösung (7,5 ml Lösung A und 7,5 ml Lösung B). Discard 2xSSPE und fügen Detection-Lösung. Rock-sanft mit der Hand für 2 Minuten gewährleistet eine vollständige Abdeckung der Membran mit Lösung. Entsorgen chemilumineszente Lösung.
20. Schneiden Sie zwei Blätter aus Kunststoff Transparenz, um die Exposition Patrone passt. Legen Membran zwischen den beiden Platten aufnehmen und in Exposition Patrone.
21. Gehen Sie zur Dunkelkammer. Unter rotem Licht, fügen ECL Detektion Film Patrone und setzen für 5 Minuten. Dog-ear unteren rechten Ecke des Films nach der Entfernung um die richtige Ausrichtung zu ermöglichen, wenn Anzeige.
22. Develop-Film mit automatisierten Entwickler oder chemischen Bädern nach Anweisungen des Herstellers.
23. Wiederholen Sie die Belichtung mit längeren oder kürzeren Belichtungszeiten, falls erforderlich.

3. Regeneration der Membran

1. Wash-Membran in 250 ml 1% SDS bei 80 ° C für 30 Minuten zweimal.
2. Wash-Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
3. Seal Membran in Plastikbeutel mit 10 ml 20 mM EDTA und in den Kühlschrank bei 4 ° C für zukünftige Wiederverwendung.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind am besten, indem man die Folie über eine aufgedruckte Raster, sonst Scannen des Bildes und den Import in Software wie BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgien) angesehen. Jede Sonde Ergebnis sollte mit Verweis auf positive und negative Kontrolle Sonden interpretiert werden. Die Ergebnisse sind am besten als negativ, schwach positiv oder benotet. Positive Ergebnisse sind, wo das Signal so stark wie oder stärker als die positive Kontrolle Sonde. Negative Ergebnisse sind, wo das Signal fehlt oder gleich der negativen Kontrolle (im Falle der Hintergrund-Signal). Schwache Ergebnisse sind, wo das Signal schwächer als die positive Kontrolle Sonde, aber stärker als die negative Kontrolle ist. Schwache Ergebnisse können die Folge von Punktmutationen, die zu schwach Sondenbindung oder durch nicht-spezifische Signale von Primer-Dimer-Bildung werden. Die Verwendung von zwei Sonden pro Target von Interesse können zur Verbesserung der Spezifität, wo ein einzelnes schwaches Ergebnis sicher als nicht-spezifisches Signal interpretiert werden kann. Falls Zweifel bestehen, kann eine einzige komplexe PCR-Reaktion mit Gel-basierte Erkennung und Sequenzierung von jedem Verstärker durchgeführt werdenlified Produkt zu ermitteln, ob das Ergebnis ist wirklich positiv. Ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 1. Die MPCR / RLB Prinzipien (P1) Step 1.9. Amine modifizierten Sonden sind kovalent an eine Nylonmembran gebunden. (P2) Step 2,10. Biotin modifizierten PCR-Produkte werden an die Sonden hybridisiert. (P3) Schritt 2.14. Streptavidin, mit Peroxidase markiert, ist mit der Membran inkubiert und bindet an Biotin. (P4) Steps 2,19-2,21. Peroxidase katalysiert eine Reaktion in der ECL Nachweisreagenzien, die Licht auf die lichtempfindlichen Film ausgesetzt ist. Die Membran wird dann für die Wiederverwendung gewaschen.

Abbildung 2. Representative MPCR / RLB führen. Proben 1 bis 6 stehen für positive Kontrollen - zwischen ihnen gibt es wenigstens eine positive Probe-Signal für jeden der 43 Sonden. Jeder Zielsequenz (A bis U) ist mit zwei verschiedenen Sonden, um die Spezifität zu maximieren erkannt. Sonden A1 und A2 vertreten artspezifischen Sonden, die voraussichtlich für jede Probe positiv und helfen bei der Orientierung des Films sind. Probe A1 ist an der Unterseite der Membran wiederholt. Die Proben 7 und 8 sind negative Kontrollen. Beachten Sie, dass Probes Q1, Q2, T1 und T2-Signal in den negativen Kontrollen haben, was darauf hinweist wahrscheinlich unspezifische Bindung von Primer oder Primer-Dimer-Produkt. Re-Design der Sonden oder Primer erforderlich wäre. Probes C1, D1 und F1 zeigen Streifenbildung durch die Membran wahrscheinlich auf einige nicht-spezifische Aufnahme der Streptavidin-Peroxidase-Konjugat oder Chemilumineszenzsubstrat, dies ist jedoch leicht von echten positive Probe-Signale aus. Probes D1 und D2 haben relativ schwaches Signal im Vergleich zu anderen Sonden, kann dies zu größeren Amplifikate führt zu weniger effiziente Amplifikation. Probe J2 ist negativ mehrere Proben (1, 3, 4, 6, 39), wo Sonde J1 ist positiv. Das wahrscheinlichste ist eine Mutation in der J2-Bindungsstelle für diese Beispiele.

Diskussion

Die MPCR / RLB-Methode ermöglicht die gleichzeitige Erfassung einer großen Anzahl von PCR-Produkte. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Chemilumineszenz-Sonde-basierte Erkennung kann ein einzelner Multiplex-PCR-Reaktion mit einer großen Anzahl von Primerpaare verwendet, um die DNA-Template zu verstärken.

Wenn keine Sonde Signale mit einer oder mehreren Proben, die Durchführung Gelelektrophorese mit den verbliebenen PCR-Produkt erhalten werden können unterscheiden, ob das Problem mit PCR-Amplifikation oder Sondenhybridisierung ist. Wo alle Sonde Signale auf der Membran schwach oder nicht vorhanden sind, aber Gelelektrophorese zeigt die erfolgreiche PCR-Amplifikation unter anderem die Möglichkeiten Probleme mit Kennzeichnung der Membran, fehlerhafte Regeneration der Membran nach vorheriger Verwendung, fehlerhafte Temperaturen während der Hybridisierung oder Streptavidin Inkubation oder defekte Streptavidin- Peroxidase-Konjugat oder Nachweisreagenz.

Wenn Kontrollproben zeigen, dass die einzelnen Sonden können zu falsch negativen Signale, Einzel-PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung durchgeführt werden können, um die Amplifikation von PCR-Produkt zu überprüfen und für Sequenzvariation an der Sonde Bindungsstelle zu suchen. Schwache oder fehlende Sondensignal kann auf große Amplikon size: wenn möglich alle Amplikons sollten, die ähnlich lang und weniger als 300 bp sein. Secondary DNS-Strukturen von Amplikons können auch zu schlechten Sondenbindung und kann Re-Design der Primer erfordern. Individuelle Primer oder Sonden-Konzentrationen kann auch variiert werden, um die Signalstärke zu optimieren.

Falsch positive Signale aufgrund Sonde Bindung von nonamplified Primer oder Primer-Dimer-Produkt kann durch Ausführen einzelner PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung untersucht werden. Wenn dies geschieht, der Sonden Redesign kann erforderlich sein können. Punktmutationen in Sonde Bindungsstellen kann schwach oder nicht vorhanden Signalen führen. Zulassen von zwei Sonden für jedes amplifizierte Produkt macht dies leicht zu erkennen. Diese Eigenschaft kann bei sorgfältiger Primer und Sonde Design zu kleinen Sequenzvariationen in Ziel-DNA zu erkennen genutzt werden.

Kurzum, während es viele Methoden der Produkt-Erkennung folgenden Multiplex-PCR-Reaktionen zur Verfügung stehen, hat MPCR / RLB den Vorteil, dass High-Throughput-und kostengünstig mit geringem Setup-Kosten. Die Flexibilität der Methode erlaubt den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
5 'Amin C6 modifiziertes Oligonukleotid-Sonden	Sigma-Aldrich
NaHCO 3	Sigma-Aldrich	S-8875	0,5 M Lösung aus bis zu pH 8,4
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881	0,1 M Lösung
20xSSPE Puffer	Amresco	0810-4L
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L-4390	Make up 10% Stammlösung, nicht Autoklaven, sollten für 1 Woche maximal vor Gebrauch aufbewahrt werden
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884	Make up 0,5 M Lösung auf pH 8,0 eingestellt und Autoklaven
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N '-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDAC)	Sigma-Aldrich	E7750	Make up von 20 ml 16% ige Lösung unmittelbar vor Gebrauch mit 3,2 g EDAC und 18 ml Millipore-Wasser
BiodyneC 0,45 um Nylonmembran 20x20 cm	Pall Life Sciences	74480C
Deionisiertes, gereinigtes Wasser
Flüssige Waschmittel Pyroneg	Johnson Diversey	HH12291
Streptavidin-Peroxidase-Konjugat	Roche	11 089 153 001
Amersham ECL Nachweisreagenzien	GE Healthcare	RPN2105
Amersham ECL Nachweisreagenzien	GE Healthcare	RPN2105
OHP Transparency Film	Corporate Express	EXP 504 OHP
Amersham ECL Hyperfilm Hochleistungs-Chemilumineszenz Film 18x24 cm	GE Healthcare	28906837
Eis

Ausstattung	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Hybaid Shake'n'Stack Backöfen (2) rollen Flasche und Nylon Mesh Trennung	Thermo Scientific	HBSNSRS220	Methode kann mit einem einzigen Ofen, solange gibt es Möglichkeit für die Aufrechterhaltung der Lösungen bei 42 ° C und 60 ° C vor dem Einsatz
Die Bauchtänzerin Wippschüttler	Stovall Life Science	Euro BDbo
Miniblotter	Immunetics	Mn100-45
Wasserbad
Sog
Herdplatte
Exposure Patrone	Sigma-Aldrich	Z36 ,009-0
Röntgenfilm-Entwickler			Außerdem können Entwickler, Fixierer und Wasser in Schalen in einem abgedunkelten Raum statt automatisierterEntwickler. Lumino-Imager können auch anstelle von Xray Film verwendet werden