Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

Zusammenfassung

Neuronen sind zunächst geprägt elektrophysiologisch. Dann das Zytoplasma aus den aufgezeichneten Neuronen wird abgesaugt und einer Transkription-PCR-Analyse umzukehren, um die Expression von mRNAs für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Ionenkanäle und Rezeptoren zu erkennen.

Zusammenfassung

In zentralen Nervensystem von Säugetieren, sind verschiedene Typen von Neuronen mit verschiedenen molekularen und funktionellen Eigenschaften miteinander, nur schwer zu trennen und auch nicht einfach durch ihre Morphologie identifiziert vermischt. So ist es oft schwierig, die Genexpression in einem bestimmten Neuron Art zu analysieren. Hier dokumentieren wir ein Verfahren, whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmetechnik kombiniert mit Single-Cell-Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (SCRT-PCR) zum Profil mRNA-Expression in verschiedenen Typen von Neuronen in den wesentlichen nigra. Elektrophysiologische Techniken werden zuerst auf die neurophysiologischen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Nervenzellen aufnehmen. Dann wird das Cytoplasma einzelner elektrophysiologisch charakterisiert nigral Neuronen abgesaugt und einer SCRT-PCR-Analyse zur mRNA-Expression-Profile für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Rezeptoren und Ionenkanäle erhalten. Die hohe Selektivität und Sensitivität machen diese Methode besonders nützlich, wenn Immunhistochemie nicht aufgrund eines Mangels an geeigneten Antikörper oder niedrige Expression des Proteins verwendet werden. Diese Methode ist auch anwendbar auf Neuronen in anderen Hirnregionen.

Protokoll

1. Hirnschnitt Vorbereitung

1. Junge (15-40 Tage alt) männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten verwendet. (Wir verwenden auch diese gleiche Protokoll bei Mäusen.) Unter tiefen Urethannarkose, sind Tiere geköpft und das Gehirn ist schnell herauspräpariert. Dann werden 300 Mikrometer dicke koronalen Hirnschnitten mit den midrostral Teil der Substantia nigra sind auf einer Leica Vibratom (VT-1200S) geschnitten. 220 Saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D-: Die Scheibe schneiden Vorgehensweise ist in einem eiskalten, sauerstoffreiches hohen Saccharose Schneiden Lösung (in mM) durchgeführt Glukose. Es ist mit einer Mischung aus 95% O ₂ / 5% CO ₂ zu halten Sauerstoff und zu pflegen pH bei 7,4 sprudelte. Halten Sie das Schneiden Lösung eiskalten während des gesamten Verfahrens.
2. 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2,5 CaCl _2, 1,3 MgCl _2, 10: Die Hirnschnitten in einer Inkubationskammer mit einer oxygenierten künstlichen Liquor (aCSF) enthält (in mm) gefüllt inkubiert D-Glucose. Es ist mit einer Mischung aus 95% O ₂ / 5% CO ₂ zu halten Sauerstoff und zu pflegen pH bei 7,4 sprudelte. Die Inkubationszeit beträgt 34 ​​° C für 45 min und anschließend bei Raumtemperatur bis zum Hirnschnitt, um die Aufnahme Kammer übertragen wird.

2. Elektrophysiologische Fingerabdrücke nigral Neuronen

1. Ein Hirnschnitt ist es, ein Patch-Clamp-Aufzeichnung Kammer kontinuierlich mit dem Sauerstoff aCSF bei 32 ° C perfundiert übertragen
2. Patch-Pipetten sind aus Borosilikatglas autoklaviert (KG-33) Glaskapillare Schlauch (1,10 mm ID, 1,65 mm od, King Precision Glass, Claremont, CA) mit Hilfe eines PC-10-Abzieher (Narishige, Tokyo, Japan) gezogen und mit intrazellulären Lösung vorbereitet mit DNase-RNase-freies Wasser (Fisher Scientific) (mit 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl _2, pH-Wert auf 7,3). Die Patch-Pipetten haben Widerstände von 2-3 MOhm in der Badewanne.
3. Die Substantia nigra ist nach seiner ausgeprägten anatomischen Lage (Abb. 1A1-2) identifiziert. Unter visuelle Führung eines Video-Mikroskops (Olympus BX51W1) mit Nomarski Optik und 60X Wasser Immersionslinse, große Zellen in der Substantia nigra pars compacta (SNC) und die Substantia nigra pars reticulata ausgestattet (SNR) (möglichst DA Neuronen und GABA Neuronen) sind ausgewählt für die Aufnahme. Konventionelle Giga-Ohm-Abdichtung whole-cell-Konfiguration erreicht ist (Abb. 1B1). Stromzange und Voltage-Clamp-Analysen durchgeführt werden können. Zur Minimierung der mRNA-Abbau, sollten elektrophysiologische Ableitung kurz sein (≤ 5 min). Eine Möglichkeit ist, nur die Membran und spiking Eigenschaften Datensatz elektrophysiologischen Fingerabdrücken zum Zwecke der Neuronen Interessen (Abb. B2-3) liefern. Diese kurze Aufzeichnung dauert nur ca. 1 min.

3. Zytoplasma Aspiration

1. Nach elektrophysiologischen Fingerprinting und Charakterisierung von SNr GABA und DA Neuronen, ist sanft Mund Absaugen angewendet, um das Zytoplasma absaugen. Der Zellkern kann auch abgesaugt werden, was in der genomischen DNA-Kontaminationen. Die Abdichtung sollte nicht gebrochen werden, sonst extrazelluläre Ablagerungen einschließlich mRNA kann in der Patch-Pipette angesaugt werden und verunreinigen den Inhalt der Zelle. Die Integrität der Abdichtung ist gut, solange der Anstieg in den Haltestrom bei -70 mV nicht mehr als 100 pA.
2. Dann wird die angesaugte Zellinhalt wird in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen durch das Brechen der Pipettenspitze und einem kleinen Überdruck vertrieben. Eine Zelle der Inhalt wird in ein PCR-Röhrchen gesammelt. Nach der Übernahme des Zellinhalts, das Sammeln PCR-Röhrchen auf Eis vorgekühlt, wird sofort in einem -20 ° C Gefrierschrank gelegt.
3. Um eine Kontamination der extrazellulären Ablagerungen, die mRNAs enthalten kann, ist der Patch-Pipette in das Gewebe, ohne tatsächlich Absaugen Zytoplasma abgesenkt und dann die Pipette Inhalt wird auf RT-PCR unterzogen.

4. Reverse Transkription (RT)

1. Nach dem Sammeln Zellinhalt von einer angemessenen Anzahl von Neuronen, in der Regel 10-20, sollten RT sofort damit beginnen, den Abbau von mRNAs zu minimieren.
2. Da die Menge der Zellinhalt aus einem einzigen Neuron zu klein ist, ist die RNA-Isolierung Verfahren nicht durchgeführt. So entfernen Sie das Potenzial kontaminierende genomische DNA wird die angesaugte Zellinhalt zuerst von DNase I (5 ul DNase I und 1,6 ul DNase I Puffer, 5 min bei 25 ° C) verdaut. Dann DNase I wird durch Zugabe von 1,2 ul 25 mM EDTA und Inkubation bei 75 ° C für 5 min inaktiviert.
3. cDNA synthetisiert wird mit dem SuperScript III-Reverse-Transkriptase-basierte Cells-Direct cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Tabelle 1). Erststrang cDNA ist bei 50 ° C synthetisiert werden 50 Minuten lang, dann wird die Reaktion durch Inkubation bei 85 ° C inaktiviert 5 min und 1 ul RNase H ist hinzuzufügened zu verdauen mRNA (37 ° C für 20 min). Die einsträngige cDNA wird bei -20 ° C für die spätere PCR-Amplifikation gespeichert.
4. Die vollständige Entfernung der genomischen DNA wird durch RT-minus-Steuerung, in der die Reverse Transkriptase weggelassen, während alle anderen Reaktionskomponenten waren genau die gleichen überprüft wird.

5. Zweistufige PCR-Amplifikation

1. Die Primer wurden gemäß der Sequenzen in GenBank konzipiert. Wann immer möglich, wurden Intron-überspannenden Primerpaare verwendet, mit deren Hilfe genomischer DNA-Kontaminationen zu erkennen. Primerpaar Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Wirksamkeit der Primerpaare sollte durch ganze Gehirn mRNAs, die positive Produkte ergeben überprüft werden. Alle Primer werden von Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA) synthetisiert.
2. In der ersten Stufe liegt bei 5 ul der 30 ul cDNAs für 35 Zyklen in Gegenwart von Primerpaar (Tabelle 2) verstärkt. Der Temperaturwechsel Protokoll der Thermocycler (Mastercycler, Eppendorf, Tabelle 1) ist 2 min bei 94 ° C für die initiale Denaturierung, dann 35 Zyklen von 15 s bei 94 ° C zur Denaturierung, 30 s bei 55 ° C zu glühen, und 45 s bei 72 ° C zu erweitern, gefolgt von 7 min für eine letzte Verlängerung. Taq DNA Polymerase, Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) und alle anderen notwendigen Komponenten für die PCR-Amplifikation durch eine PCR Super-Mix (Invitrogen, Tabelle 1) zur Verfügung gestellt
3. In der zweiten Stufe der PCR wird das Produkt von 1 ul aus der ^1. Stufe PCR-Amplifikation als Vorlage verwendet und die gleichen Primerpaar in der ersten Stufe verwendet wird (Tabelle 2). 40 Zyklen werden mit der Erweiterung verkürzt und endet am 30. s. Das gleiche PCR Super-Mix verwendet.
4. PCR-Produkte aus der ^2. Stufe Verstärkung um 2,5% Agarosegelelektrophorese getrennt sind, visualisiert durch Ethidiumbromid (0,05 mg/100 ml Gel) oder gelgreen unter UV-Licht und fotografiert (Abb. B4). Die positive Bands werden dann ausgeschnitten, extrahiert mit Hilfe eines Qiagen Extraktions-Kits (Tabelle 1) und sequenziert und verglichen mit den veröffentlichten Sequenzen der Zielgene.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Die Dopamin (DA) Neurone in der Substantia nigra pars compacta und pars reticulata und die benachbarten GABA Projektion Neuronen in der Substantia nigra pars reticulata haben unterschiedliche elektrophysiologischen Eigenschaften (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011.). Wie in Abb.. 1B2, zeigen SNr GABA Neuronen hochfrequente spontane spiking rund 10 Hz. Die Spitzen haben eine Basis Dauer ca. 1 ms. Nach hyperpolarisierenden Stromeinspeisung, Anzeige SNr GABA Neuronen eine schwache depolarisierende sag in Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung, was auf eine schwache Expression von I _h Strom in diesen Neuronen (Abb. 1B2). Im Gegensatz dazu zeigen die nigral DA Neuronen niedrigen Frequenz (ca. 2 Hz) spontane Spikes, die eine Basis Dauer ca. 3 ms haben. DA Neuronen zeigen auch eine ausgeprägte sag in Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung, was auf eine starke Expression von I _h-Strom (Abb. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011).

SCRT-PCR mRNA für Glutaminsäuredecarboxylase 1 (GAD1, das Schlüsselenzym für die GABA-Synthese und ein Marker für GABA Neuronen) in elektrophysiologisch identifiziert SNr GABA Neuronen, aber nicht in DA Neuronen (Abb. 1B4, 5). Im Gegensatz dazu erfasst SCRT-PCR mRNA für Tyrosin-Hydroxylase (TH, Schlüsselenzym für Dopamin-Synthese und ein Marker für DA Neuronen) in elektrophysiologisch identifiziert SNc und SNR DA Neuronen, aber nicht in GABA Neuronen (Abb. 1B4, 5). So SCRT-PCR Ergebnisse bestätigen die elektrophysiologischen Neuron Identifikation. Als nächstes wurde SCRT-PCR verwendet, um den Ausdruck der Spannung aktiviert Kv3 Kanaluntereinheiten, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 Profil. Diese Untereinheiten tragen zur spannungsabhängigen K ^+-Kanäle bilden verschiedener Eigenschaften in Abhängigkeit von Untereinheit Zusammensetzung (Ding et al. 2011). In dem Beispiel SNr GABA Neuron in Abb.. 1B4, mRNAs für Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 nachgewiesen wurden. In dem Beispiel SNr DA Neuronen in Fig.1B5 gezeigt, nur Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 nachgewiesen wurden. In unserem gepoolten Daten wurde Kv3.1 häufiger in SNr GABA Neuronen als in nigral DA Neuronen nachgewiesen, was auf eine höhere Expression von Kv3.1 in den schnell spiking SNr GABA Neuronen (Ding et al. 2011).

Abbildung 1. Elektrophysiologische Identifizierung SNr GABA Neuronen und nigral DA Neuronen A:.. Nigral Bereiche können durch ihre unterschiedlichen anatomischen Lage identifiziert werden A1 zeigt die Lage der SNC und SNr in einem koronalen Nissl-gefärbten Abschnitt mit einer 1X Ziel eingefangen. Die boxed-Bereich wurde CAPTURed mit einer 10X-Objektiv und in der Mitte, wie durch den Pfeil. Die zellreiche SNc-und Zell-armen SNr sind deutlich sichtbar. A2 zeigt die Lage der SNC und SNr in einer Live, ungefärbten Frontalschnitt mit einem 4X Ziel eingefangen. Die zellreiche SNc-und Zell-armen SNr sind auch eindeutig identifizierbar sein. VTA, ventralen Tegmentum. B1 zeigt eine SNr GABA Neuron als Patch in whole-cell-Modus gespannt. B2 zeigt die typischen elektrophysiologischen Eigenschaften von SNr GABA Neuronen in Stromzange Aufnahmemodus. Diese Neuronen feuern spontan Hochfrequenz Aktionspotential von kurzer Dauer und haben eine schwache I _{h-vermittelte} sag Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung. B3 zeigt die typischen elektrophysiologischen Eigenschaften von nigral DA Neuronen in Stromzange Aufnahmemodus. Sie feuern spontan niederfrequenten Aktionspotentiale von langer Dauer und haben eine herausragende I _{h-vermittelte} Negativfederweg (Pfeilspitze) als Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung. So sind SNr GABA Neuronen und nigral Dopamin-Neuronen deutlich elektrophysiologisch. Identifiziert B4 zeigt ein Gel Bild von SCRT-PCR-Produkte von elektrophysiologischen identifiziert SNr GABA Neurons. Glutamat-Decarboxylase 1 (GAD1) ​​mRNA, aber keine Tyrosin-Hydroxylase (TH) mRNA nachgewiesen wurde. mRNAs für Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 wurden in diesem SNr GABA Neuronen nachgewiesen werden. B5 zeigt SCRT-PCR-Nachweis von neuronalen Kv3 Kanal mRNAs in ein SNR DA Neurons. TH-mRNA, aber keine GAD1 mRNA wurde in einem elektrophysiologisch identifiziert SNr DA Neuronen nachgewiesen werden. mRNAs für Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 wurden in diesem SNr DA Neurons. B6 zeigt gepoolten Daten erkannt.

7. Mögliche falsch-negative und falsch positive Ergebnisse

Basierend auf unserer Erfahrung, können verschiedene Faktoren zu falsch-negativen SCRT-PCR Ergebnissen führen. Diese Faktoren schließen Versagen in Absaugen ausreichende Menge des Cytoplasma durch Pipettenspitze Verstopfung, RNase Kontamination und ineffiziente PCR-Primer-Patch. Patch-Pipette Verstopfung kann in der Regel auf dem Videomonitor zu sehen und gekennzeichnet durch einen besseren Zugang Widerstand. RNase Kontaminationen können durch gründliche Deaktivierung und das Tragen von Handschuhen vermieden werden. PCR-Primer Wirksamkeit sollte durch Gesamt-RNA aus einer Hirngewebe Punsch getestet werden (. Zhou et al 2008;. Ding et al 2011).

Da wir immer DNase zum ersten behandeln unsere Proben vor der RT, haben wir nicht falsch-positive Ergebnisse auftreten. Theoretisch, ohne DNase-Verdau, hat genomische DNA-Kontaminationen und damit falsch positive Nachweis kann auftreten, wenn das Gen intronlosen oder das Primerpaar nicht überspannen die Intron Region.

Diskussion

Die Kombination von Patch-Clamp-Aufzeichnung in Hirnschnitt mit SCRT-PCR haben wir gezeigt, hier bieten eine hervorragende Methode, um die mRNA-Expression-Profile für Ionenkanäle, Rezeptoren und Schlüsselenzyme für Neurotransmittersynthese in individuell charakterisiert Neuronen zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich, wenn das Protein in Frage nicht erkannt und lokalisiert werden mit anderen Methoden wie Immunhistochemie durch niedrige Expression und / oder mangels geeigneter Antikörper (Surmeier et al 1996;....

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