Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Zusammenfassung

Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.

Zusammenfassung

Knorpelabbau ist ein zentrales pathologisches Merkmal der Arthrose, eine führende Ursache von Behinderungen in den USA. Knorpel in den Erwachsenen nicht sehr effizient regenerieren in vivo, und als Ergebnis führt Arthrose, Knorpel Verlust irreversibel und wird von chronischen Schmerzen und Unbeweglichkeit ^1,2 begleitet. Cartilage Tissue Engineering bietet vielversprechende Möglichkeiten, sich zu regenerieren und wiederherstellen Gewebe-Funktion. Diese Technologie umfasst in der Regel Aussaat Chondrozyten in natürlichen oder synthetischen Gerüsten und Kultivieren der resultierenden 3D in einem ausgewogenen Medium bauen über einen Zeitraum von Zeit, mit dem Ziel der Technik ein biochemisch und biomechanisch ausgereifte Gewebe, das in eine Fehlstelle in vivo ^3-6 können transplantiert werden . Das Erreichen einer optimalen Voraussetzung für Wachstum und Chondrozyten-Matrix Ablagerung ist für den Erfolg von Knorpel Tissue Engineering unverzichtbar.

In der nativen Gelenkspalt, Knorpel an der articdere Oberfläche des Knochens ist in Gelenkflüssigkeit gebadet. Diese klare und viskose Flüssigkeit liefert Nährstoffe an die avaskuläre Gelenkknorpel und enthält Wachstumsfaktoren, Zytokine und Enzyme, die wichtig sind für Chondrozytenmetabolismus ^7,8. Darüber hinaus erleichtert Synovialflüssigkeit reibungsarme Bewegung zwischen knorpeligen Oberflächen hauptsächlich durch Sekretion zwei Hauptkomponenten, Hyaluronsäure und lubricin ^{9 10.} Im Gegensatz dazu ist Gewebezüchtung Knorpel meist in künstlichen Medien kultiviert. Während dieser Medien eher in der Lage sind, mehr definierten Bedingungen für das Studium Chondrozytenmetabolismus bieten, Synovialflüssigkeit am besten reflektiert die natürliche Umwelt, von denen Chondrozyten wohnen in.

In der Tat hat Synovialflüssigkeit den Vorteil, leicht zu beschaffen und zu speichern, und können oft regelmäßig durch den Körper wieder aufgefüllt werden. Mehrere Gruppen haben das Kulturmedium mit Gelenkflüssigkeit ergänzt wachsende Mensch, Rind, Kaninchen und Hund chondrocytes, aber meist nur geringe Mengen von Gelenkflüssigkeit (unter 20%) ^11-25 verwendet. Während Huhn, Pferd und Mensch Chondrozyten in das Medium mit höherer Prozentsatz der Gelenkflüssigkeit gezüchtet haben, wurden diese Kultur Systemen zweidimensionalen ^26-28. Hier präsentieren wir unsere Methode der Züchtung menschlichen Chondrozyten in ein 3D-System mit einem hohen Anteil von Gelenkflüssigkeit (bis zu 100%) über einen Zeitraum von 21 Tagen. Dabei überwanden wir eine große Hürde durch die hohe Viskosität der Gelenkflüssigkeit vor. Dieses System bietet die Möglichkeit des Studiums humanen Chondrozyten in Synovialflüssigkeit in einer 3D-Umgebung, die weiter mit zwei weiteren wichtigen Faktoren (Sauerstoff-Partialdruck und mechanischer Belastung) ^29,30, dass die natürliche Umwelt darstellen für Knorpel, die natürliche Milieu für imitieren können kombiniert werden Knorpel Wachstum. Darüber hinaus kann dieses System auch für die Bestimmung von Gelenkflüssigkeit Aktivität auf Chondrozyten verwendet werden und bieten eine Plattform für die EntwicklungKnorpelregeneration Technologien und therapeutische Optionen für Arthritis.

Protokoll

Ein 3D-System zur Kultivierung von menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

In dieser Arbeit haben wir die menschliche Chondrozyten in Alginatkügelchen mit einem modifizierten Herstellung-schlug Encapsulation Protokoll (Lonza, und ³¹⁾ gekapselt. Mit Hilfe dieser 3D-Konstrukte, haben wir ein System zur Kultivierung von Zellen in einem Kulturmedium, das abwechslungsreiche Prozentsätze der menschlichen Synovialflüssigkeit entwickelt und bewertet diese 3D-Konstrukte für die Knorpel-Genexpression.

1. Bereiten menschlichen Chondrozyten (HAC) für die dreidimensionale (3D)-Kapselung

1. Tauwetter ein Fläschchen (1 ml) des menschlichen Chondrozyten (HAC) (Lonza) (Passage 2) in 37 ° C Wasserbad für 1 min.
2. Mix mit 1 ml Chondrozyten Nährmedien (Lonza) und Zentrifuge bei 3000 rpm für 3-5 min, um die Zellen zu sammeln. Überstand verwerfen.
3. Resuspendieren Zellpellet in Chondrozyten Nährmedien (Lonza).
4. Platte von Zellen in einer 10 cm GewebeKultur-Platte (BD Biosciences), und die Kultur in Chondrozyten Nährmedien (Lonza), bis die Zellen konfluent. HAC sollte in einem Durchgang Zahl nicht höher als 3 oder 4 (P3 oder P4) verwendet werden.
5. Wash HAC auf dem Teller mit 155mm NaCl anstelle des Standard-PBS, durch trypsinzation gefolgt, um Zellen für die Alginat-Bead-Kapselung zu sammeln. Sobald Zellen sind freistehend, Spin-down der Zellen bei 3000rpm für 5min. Die Zellen sind nun bereit für 3D-Kapselung.

2. Encapsulate HAC in 3D-Perlen

Resuspendieren HAC in 1,2% Alginat-Lösung (Sigma) in einer Dichte von 8x10 ⁵ Zellen / ml. Die Zellzahlen wurden vor der Einkapselung, bestimmt mit einem Standard-Zell-Zähler. Es ist sehr wichtig, gut zu mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in die Perlen zu sichern.

1. Pipette die HAC / Alginat-Lösung Mischung in eine 12 ml Spritze an einer 22-Gauge-Nadel (Tyco Healthcare, Inc.).
2. Inzwischen bereiten ein 50 mL Becherglas mit 102 mM CaCl ₂ bei einem Volumen 5 Mal, dass der HAC / aginate Lösung. Platzieren Sie einen Rührstab in das Becherglas und rühren die 102 mM CaCl _2-Lösung langsam (bei ​​ca. 150 rpm).
3. Halten Sie die Spritze Spitze ca. 6 cm über der Oberfläche der CaCl _2-Lösung und fügen Sie den HAC / Alginat-Gemisch in die CaCl _2-Lösung getropft. Im Allgemeinen sind die daraus resultierenden Alginatkügelchen 2mm im Durchmesser mit einer Verkapselung Dichte von etwa 10 ⁴ Zellen / Perle. Hinweis: Die Höhe der Spritze über die CaCl _2-Lösung ist wichtig. Kürzere Strecke wird in Tropfenform statt kugelförmige Perlen geformt führen, wodurch ungleichmäßige mechanische Integrität und Verkapselung von Zellen.
4. Lassen Sie die Kugeln in die CaCl _2-Lösung für 20-25 min rühren. Während andere Alginat Kapselungsprotokolle eine viel kürzere Inkubationszeit von 10min zeigen, fanden wir, dass längere Inkubationszeit mit der CaCl _2-Lösung die Integrität der verbessert werdenAnzeigen.
5. Entfernen Sie die CaCl _2-Lösung, waschen Sie die Perlen 2-3 mal in 2-3 Volumina NaCl, und dann noch einmal in die Differenzierung der Chondrozyten Medium (Lonza). Während andere Alginat Perle Kapselung Protokolle mit einzubeziehen einen Filter für die oben genannten Waschverfahren, fanden wir, dass die Alginatkügelchen oft gefangen werden in den Filter und austrocknen, wodurch die Effizienz der Kapselung. Wir fanden es am effizientesten, damit die Perlen auf den Boden des Bechers vor der Entsorgung regeln die Lösung.
6. Verwenden Sie ein Standard-Spatel auf die Perlen in Kulturschalen übertragen. Wir in der Regel Kultur 12 Perlen pro 3 cm auch für 2 Tage in Chondrozyten Wachstumsmedium zu ermöglichen Chondrozyten auf die Verkapselung Prozess in dem Medium, den sie vor der Umstellung auf die Differenzierung der Chondrozyten Medium (Lonza) mit Gelenkflüssigkeit angebaut wurden anzupassen.

3. Kultur Chondrozyten in Synovialflüssigkeit Kulturmedium

1. Frische Gelenkflüssigkeit kann aus einem o erhaltenutpatient Klinik (Wir erhalten Synovialflüssigkeit von der Tufts Medical Center). Die Gelenkflüssigkeit kann in 15ml Falcon-Röhrchen an das Labor übertragen werden, und sofort bei 3000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Aliquot zellfreien Synovialflüssigkeit in 1,5 ml Reaktionsgefäße, um zu vermeiden wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Überstand kann bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
2. Vor der Kultivierung Mix der Gelenkflüssigkeit mit Chondrozyten-Differenzierung Medium (CDM, Lonza) bei unterschiedlichen Volumenverhältnisse, mit einer konstanten Konzentration von 100 mM Ascorbinsäure und 9 mM CaCl ₂ (diese Spur von CaCl ₂ ist es, die Integrität der Alginat sorgen Perlen).
3. Halten Sie die Platte auf einem Schaukelstuhl-Plattform in einem 37 ° C Inkubator (rocking-Frequenz: etwa 75 mal / min), um Nährstoffe Verteilung innerhalb der Alginatkügelchen helfen, und zur Verringerung der Verklumpung der Perlen. Dies ist besonders wichtig, da wir diese Kultur Chondrozyten über einen längeren Zeitraum (bis zu 4 Wochen). Note: Während Chondrozyten Wachstum und die Differenzierung Medien (Lonza) zwei häufig verwendete Antibiotika Gentamycin und Amphotericin enthalten, haben wir nicht alle Antibiotika zu ergänzen, wenn wir unterschiedliche Anteil der Synovialflüssigkeit verwendet für Chondrozyten kultiviert. Keine Kontamination wurde niemals beobachtet.
4. Ändern Medien Mischungen alle 2-3 Tage. Die Viskosität der Gelenkflüssigkeit hat eine wichtige Hürde in Kultivierung Chondrozyten in Alginatkügelchen während der langfristigen Kulturen eingekapselt worden. Wir fanden es am effektivsten, Synovialflüssigkeit-ergänzt Medium mit 102mm CaCl ₂ (50% V / V), die verstärkt auch die Integrität der Alginatkügelchen verdünnen. Auf diese Weise kann das Medium langsam mit einer Pipette entfernt werden, ohne Beschädigung der Perlen.

4. Ernte-HAC in Alginatkügelchen zur Genexpressionsanalyse

Besondere Vorsicht ist bei der Ernte der HAC von der Alginatkügelchen zur Genexpressionsanalyse werden.

1. Waschen Sie die Alginatkügelchen 3 Times in 102 mM CaCl ₂ für ca. 5 min jeder Zeit.
2. Rufen Sie die Chondrozyten, indem 55 mM NaCitrate bei einem Volumen 4-5 mal, dass der Perlen. Es ist wichtig, dass die Alginatkügelchen total in die NaCitrate Lösung eingetaucht. Shake oder Rock für 20-30 min.
3. Spin down den Zellen und den Überstand verwerfen.
4. Für die RT-PCR-Analyse, Zellpellet in Zell-Lyse-Puffer (Qiagen RNA Isolation Kit), und fahren Sie mit RNA Aufreinigung.

5. Fix HAC in Alginatkügelchen für die histologische Analyse

Besondere Sorgfalt ist darauf zu achten, die HAC aus dem 3D-Perlen für die histologische Analyse der Ernte werden.

1. Waschen Sie die Alginatkügelchen 3 mal in 102 mM CaCl ₂ für ca. 5 min jeder Zeit. Um das Gerät vollständig abzuwaschen das zähflüssige Gelenkschmiere, fanden wir es am effektivsten, mit Chondrozyten-Differenzierung Medium (Lonza) über Nacht zu waschen, rocking in einem 37 ° C Inkubator (rocking-Frequenz: etwa 75 Mals / min). Die Chondrozyten-Wachstumsmedium wurde verwendet, um das Überleben der Chondrozyten in dieser verlängerten waschen zu gewährleisten und maximale Durchdringung des Fixiermittels zu ermöglichen.
2. Fix die Perlen in 70% Ethanol über Nacht, und fahren Sie mit histologische Analyse. Um DAPI-Färbung, inkubieren Alginatkügelchen mit DAPI-Lösung (500ng/ml) für 1 Stunde unter leichtem Schütteln, und waschen für 3-mal mit 102mm CaCl ₂ für je 15 min Zeit. Dapi Bilder können dann unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Die Perlen können auch geschnitten für Alcianblau und H & E Färbung.

6. Repräsentative Ergebnisse

Unsere 3D-Kultivierung Methode für den menschlichen Chondrozyten in hohen Prozentsätzen der Gelenkflüssigkeit ist in der schematischen Darstellung in Abbildung 1 gezeigt, dargestellt. Nach humanen Chondrozyten in Alginatkügelchen verkapselt waren, durften sie in Medium mit unterschiedlichen Verhältnissen der Gelenkflüssigkeit ergänzt wachsen. Wegen der Viskosität der Gelenkflüssigkeit, ist es wichtig,Kultur Chondrozyten unter ständiger rocking Bedingungen verhindern das Verklumpen des Knorpels Konstrukte und um eine gleichmäßige Verteilung der Nährstoffe zu gewährleisten. Es ist auch wichtig, die Alginatkügelchen ausgiebig zu waschen, bevor das Abrufen der Chondrozyten, so dass die Festsetzung oder Lysepuffer können die Perlen zu durchdringen (Abb. 1). Hellfeld (BF) Bilder von Chondrozyten in der Alginat-Beads sind in Abb. 2 dargestellt. DAPI-Färbung wurde durchgeführt, um usniform Verteilung der Zellen innerhalb der Kügelchen (Abb. 2) zu bestätigen. Am Ende der 21-tägigen Kultur Periode wurde Genexpressionsanalyse mittels qRT-PCR durchgeführt. Die Referenz-Gen GAPDH wurde zur Normierung für alle PCRs verwendet, wie es war bestimmt einer der zuverlässigsten Hinweis Gene für qPCR-Analyse auf Chondrozyten ³² sein. Ein Beispiel ist in Abb. dargestellt. 3, wo wir analysierten die Ergebnisse von menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit von sechs Patienten mit Osteoarthritis zusammengefasst kultiviert. Im Einklang mit der Tatsache, dass die Chondrozyten ausLonza in 2D Kulturen, was zwangsläufig zu Entdifferenzierung ³³ würde führen erweitert worden, fanden wir, dass Tag 0 Chondrozyten exprimiert minimal Ebenen der Knorpelmatrix Gene (Abb. 3). 3D-Kultivierung von Chondrozyten mit Chondrozyten-Differenzierung Medium (Lonza) oder Medium mit Gelenkflüssigkeit ergänzt deutlich erhöht Knorpel Genexpression von Kollagen, Aggrecan und MMP13, die Chondrozyten re-Differenzierung zeigt by Day 21 (Abb. 3) ^34. Erhöhung des Anteils der Gelenkflüssigkeit in den Medien führte zu einem vergleichbaren Grad der Knorpelmatrix Marker Kollagen II und Aggrecan mRNA-Expression (Abb. 3a und 3b). Darüber hinaus Chondrozyten in 100% Synovialflüssigkeit kultivierten sogar zeigten eine Abnahme der Knorpel abbauende Enzym MMP13 mRNA-Expression als mit den kultivierten in Medium allein (Abb. 3c) verglichen. Interessanterweise ist die Expression von Zelltod Indikator Caspase 3 allmählich nahm mit zunehmendem Verhältnis von Gelenkflüssigkeit, was darauf hindeutet, dass synovial Flüssigkeit Kultivierung hat zu einer verminderten Apoptose Ebenen (Abb. 3D) geführt. Deshalb zeigen unsere Ergebnisse, dass Kultivierung menschlicher Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit in einer 3D-Umgebung eine praktikable Technologie ist.

Tabellen und Abbildungen

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Verfahrens zur Kultur menschlichen Chondrozyten in hohen Prozentsätzen der Gelenkflüssigkeit in 3D Alginatkügelchen. Erstens sind Chondrozyten und Alginat-Lösung gemischt. Beim Auftragen tropfenweise zu der CaCl _2-Lösung werden Chondrozyten innerhalb der vernetzten Ca-Alginat-Hydrogel-Kügelchen immobilisiert. Diese 3D-Konstrukte werden dann in der Chondrozyten-Differenzierung Medium (Lonza) mit unterschiedlichen Verhältnissen des menschlichen Synovialflüssigkeit kultiviert. Nach 21 Tagen der Kultivierung unter einem Schaukelstuhl Zustand sind Alginatkügelchen enthaltenden Zellen intensiv, wonach die Zellen für die Gen abgerufen werden gewaschenExpressions-Analyse.

Abbildung 2. Hellfeld (BF) und DAPI Bilder von menschlichen Chondrozyten gekapselt Kulturen mit 0%, 30%, 50%, 70% und 100% Synovialflüssigkeit. Chondrozyten wurden kugelförmig in alle Kulturbedingungen. Bilder von Hellfeld (BF) und DAPI wurden überlagert, um die Lage und Verteilung der Chondrozyten zu bestätigen. Intarsien, vergrößerten Bildern. Pfeilspitzen, Kolokalisation von Chondrozyten in BF und DAPI-Färbung Bilder.

Abbildung 3. QRT-PCR-Analyse von verkapselten menschlichen Chondrozyten am Tag 0 (D0) ein nach 21 Tagen der Kultivierung (D21) in Medium mit unterschiedlichen Verhältnissen der Gelenkflüssigkeit (SF) (0%, 30%, 50%, 70 ergänzt % und 100%). Die Ergebnisse von vier unabhängigen Proben werden hier gezeigt. GAPDH wurde als interne Referenz für alle PCRs verwendet. A. Collagen II mRNA-Expression. B. Aggrecan mRNA-Expression. C. MMP13 mRNA-Expression. D. Caspase 3-mRNA-Expression. Statistische Signifikanz wurde für Proben vom Tag 0 und Tag 21 Proben von 0% und 100% Synovialflüssigkeit (SF) Kultivieren, mit INSTAT Software beurteilt. * Bezeichnet P <0,05.

Diskussion

In diesem Bericht haben wir eine Methode, die für die Kultivierung humaner Chondrozyten ermöglicht in einer 3D-Umgebung in Medium, das hohe Konzentrationen von menschlichen Gelenkflüssigkeit enthält. Synovialflüssigkeit ist eine der wichtigsten Komponenten, die die natürliche Umwelt darstellen in der Gelenkpfanne, wo Chondrozyten befinden. Allerdings hat die Viskosität der Gelenkflüssigkeit eine große Herausforderung für die dreidimensionale langfristige Kultivierung von Chondrozyten wurde. Zur Überwindung de...

Materialien

Name des Reagens	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Alginat (Alginsäure Natriumsalz)	Sigma	A2158-250G	2,4%-Lösung bei 40 ° C gelagert
Calciumchlorid-Dihydrat, Granular	JT Baker	A19339
Chondrogene Nährmedien	Lonza	CC-3156 (base Medien)
		CC-4409 (Ergänzung)
Chondrogene Differenzierung Medien	Lonza	CC-3226 (base Medien)
		CC-4408 (Ergänzung)
Menschliche Chondrozyten	Lonza	CC-2550
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid)	Sigma-Aldrich	D9542
RNeasy Mini Kit (für RNA-Extraktion)	Qiagen	74104
PCR-Reagenzien: SYBR-Grün	Quanta	95053-500
12 ml Spritze	Tyco-Kendall-Monoject	512852
22-Gague Injektionsnadel	Tyco-Kendall-Monoject	8881
Mikroskop	Olymp	IX71
Platform Wippe	Thermoscientific Thermolyne	Vari-mix
Primer-Sequenzen
Collagen IIa-forward	5'-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3 '
Collagen IIa-reverse	5'-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3 '
MMP13-forward	5'-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3 '
MMP13-reverse	5'-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3 '
Caspase 3-vorne	5'-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3 '
Caspase 3-reverse	5'-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3 '