Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) mit Auditive Stimulation in Singvögel

Lisbeth Van Ruijssevelt; Geert De Groof; Anne Van der Kant; Colline Poirier; Johan Van Audekerke; Marleen Verhoye; Annemie Van der Linden

doi:10.3791/4369

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
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Protokoll
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Diskussion
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Materialien
Referenzen
Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel zeigt ein optimiertes Verfahren zur Abbildung der neuronalen Substrate der auditiven Stimulation im Gehirn mit Hilfe der funktionellen Singvogel Magnetic Resonance Imaging (fMRI). Es beschreibt die Herstellung der akustischen Stimuli, die Positionierung des Motivs und der Erwerb und die anschließende Analyse der fMRI-Daten.

Zusammenfassung

Die Neurobiologie der Vögel, als Modell für menschliche Sprache ist ein ausgeprägter Bereich der Forschung in Behavioral Neuroscience. Während erlauben Elektrophysiologie und molekulare Ansätze die Untersuchung entweder verschiedene Reize auf wenige Neuronen oder einem Stimulus in großen Teilen des Gehirns, Blutoxygenierung pegelabhängigen (BOLD) funktioneller Kernspintomographie (fMRI) ermöglicht die Kombination beider Vorteile, dh die neuronale Aktivierung vergleichen induziert durch verschiedene Reize im gesamten Gehirn auf einmal. fMRI bei Singvögeln ist wegen der geringen Größe ihres Gehirns und weil ihre Knochen herausfordernd und vor allem ihre Schädel umfassen zahlreiche Hohlräume, induzieren wichtig Suszeptibilitätsartefakte. Gradient-Echo (GE) BOLD fMRI wurde erfolgreich an Singvögeln ^1-5 (für einen Überblick siehe ^6). Diese Studien über die primären und sekundären auditorischen Hirnarealen, die Regionen, die frei von Suszeptibilitätsartefakte sind konzentriert. Da jedoch proczesse von Interesse kann über diesen Regionen auftreten, wird BOLD fMRI ganze Gehirn erforderlich unter Verwendung eines MRT-Sequenz weniger anfällig für diese Artefakte. Dies kann durch Spin-Echo (SE) BOLD fMRI ^7,8 erreicht werden. In diesem Artikel beschreiben wir, wie man diese Technik in Zebrafinken (Taeniopygia guttata), die kleinen Singvögel mit einem Körpergewicht von 15-25 g ausgiebig in Verhaltens-Neurowissenschaften der Vögel untersucht wurden, sind zu verwenden. Das Hauptthema der fMRT-Studien auf Singvögel ist Song Wahrnehmung und Lernen Song. Die auditive Natur der Reize mit der schwachen BOLD Empfindlichkeit SE (im Vergleich zu GE) basierte fMRI Sequenzen macht die Umsetzung dieser Technik sehr anspruchsvoll kombiniert.

Protokoll

1. Vorbereitung der auditive Reize

Zunächst erfassen die Sound-Reize, während im Inneren der Bohrung des 7T MR-System gespielt wird. Die Bohrung ist eine auf engstem Raum, die die auditive Reize, was zu Verbesserung bestimmter auditiven Frequenzen verzerren können. Abbildung 1 zeigt die Frequenzen erhöht und unterdrückt von unseren Aufnahmen von weißem Rauschen an der Stelle der Kopf des Vogels innerhalb des Magneten gemacht gezeigt Bohrung mit einem LWL-Mikrofon (Optimic 1160, Optoacoustics). Um diese künstliche Verstärkung zu kompensieren, wird ein Equalizer-Funktion auf jeden Reiz mit WaveLab Software angewendet. Für unsere speziellen Setup besteht die Funktion einer Gaußschen Kernel mit den folgenden Parametern: maximale Amplitude:-20dB, auf 3.750 Hz, Breite zentriert: 0,05 Oktaven (entsprechend dem Bereich 2.500-5.000 Hz für unser System).
Der Song Reize aus mehreren einzelnen Song Motive jeder Vogel mit Zeiten der Stille verschachtelt komponiert. Die dration dieser Ruheperioden eingestellt wird, um die Gesamtmenge von Klang und Stille identisch über alle Reize zu halten. Diese Konstruktion spart die natürliche intra-individuelle und inter-individuelle Variabilität der Länge des Songs. Die Gesamtlänge jedes Stimulus 16 sec. Die Intensität der einzelnen Songs ist in Bezug auf normalisiert abgestimmt root-mean-square und High-Pass bei 400 Hz, bevor sie in der gesamten Stimulus (Gesang und stillen Perioden) integriert gefiltert. Diese Manipulationen sind fertig mit Praat Software.
Das Experiment besteht aus einem ON / OFF-Block-Design alternierenden Hörstimulation Perioden (ON Blöcke) mit Ruhezeiten (OFF Blöcke) (Abbildung 2). Jeder Block (ON und OFF) dauert 16 Sekunden, die auf den Erwerb von 2 Bildern (siehe unten für den Erwerb) entspricht. Jeder Reiz Typ 25 mal vorgestellt, was den Erwerb von 50 Bildern pro Reiz und pro Thema. Die Reihenfolge der Präsentation der Bedingungen sollte innerhalb und zwischen den randomisiertenThemen. Diese randomisierte Reihenfolge der Reize in Presentation Software kodiert werden.

2. Betreff Vorbereitung

2.1 Gegenstand und Gruppengröße

Hier präsentieren wir ein Protokoll speziell auf die Verwendung von (erwachsenen) Zebrafinken angepasst. Die Wahl der Art abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung. Jedoch können auch andere Überlegungen, wie Vogel Robustheit Anästhesie ebenfalls berücksichtigt werden. Zebrafinken (Taeniopygia guttata) sollte in Volieren unter einem 12 Stunden Licht untergebracht werden: 12 Stunden Dunkelheit Photoperiode und haben Zugang zu Futter und Wasser ad libitum während der gesamten Studie. Die minimale Anzahl von Individuen pro Experiment 15 ist. Diese Zahl berücksichtigt die Empfindlichkeit der Spin-Echo-fMRI und die natürliche inter-individuelle Variabilität biologischer Phänomene im Experiment gemessen.

2.2 Installation von Setup und Vorbereitung des Tieres

(Für Spezifikationder verwendeten Geräte, verweisen wir auf die Liste der spezifischen Reagenzien und Geräte am Ende dieses Artikels)

Installieren Sie den Schnabel Maske auf dem Bett eines MRI 7T MR-System und verbinden Sie es mit dem Gas-Controller-Gerät mit Kunststoffrohren. Öffnen Sie sowohl Sauerstoff als auch Stickstoff-Flaschen und Schalter an der Gas Controller-Gerät (Durchfluss Sauerstoff: 200 cc / min; Stickstoff: 400 cc / min).

Wie oben erwähnt, wird ein 7T MR-System in der dargestellten Konfiguration verwendet werden. Andere MR-Systemen mit unterschiedlichen Feldstärken sind möglich, aber 7T ein guter Kompromiss zwischen Signal-zu-Rausch-Verhältnis und der Grad der Suszeptibilitätsartefakte (siehe Diskussion) erreicht. Bei höheren Feldstärken das Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhöht sich mit dem Grad der Anfälligkeit Artefakte.

Schalten Sie das Feedback-geregelten Systems und warmen Luftstrom Gerät.
Betäuben der Zebrafinken mit 3% Isofluran in einem Gemisch von Sauerstoff und Stickstoff durch die Einführung seiner Schnabelin die Maske und mit dem Kopf nach unten, bis der Vogel ist vollständig betäubt. Dies kann durch Ziehen der Fuß weich überprüft werden: wenn der Vogel völlig sediert ist der Fuß nicht durch den Vogel eingefahren werden. Darüber hinaus werden die Augen des Vogels teilweise geschlossen werden.
Führen Sie die Kloake Temperaturfühler, um die Körpertemperatur zu screenen und Überwachung der Atemfrequenz, indem ein pneumatischer Sensor unterhalb des Zebrafinken Bauch. Schließen Sie die Jacke, um den Körper des Vogels (Abbildung 3) zurückzuhalten.
Pflegen Atemfrequenz im Bereich von 40 bis 100 Atemzüge pro Minute und halten die Körpertemperatur konstant in einem engen Bereich von 40 ± 0,5 ° C. Wenn die Atmung Bereich zu niedrig / hoch ist, um den Pegel der Anästhesie (% Isofluran) entsprechend. Wenn das Problem weiterhin besteht, sollte der Versuch abgebrochen werden und das Tier aus dem Setup entfernt werden, um sich zu erholen.
Positionieren Sie die nicht-magnetische dynamische Lautsprecher auf beiden Seiten des Kopfes und Zebrafinken converbinden sie mit dem Verstärker. Stellen Sie sicher, dass die Kabel der Lautsprecher entfernt von dem Temperaturfühler geführt, weil es die Temperaturmessung beeinflussen können, wenn zu schließen.
Legen Sie die Oberfläche HF-Spule auf der Oberseite des Kopfes und Zebrafinken Zebrafinken die Position in der Mitte des Magneten (und automatisch das Zentrum der Sendespule, die in der Mitte des Magneten befindet).
Reduzieren der Anästhesie Ebene zu 1,5% Isofluran mit Sauerstoff und Stickstoff gemischt.

3. Datenerfassung

Erwerben Sie einen Satz von 1 sagittal, 1 horizontale und 1 koronalen Gradienten-Echo (GE) Scout-Bild (tri-Pilotsequenz) und Sätze horizontal, koronalen und sagittalen Multi-Slice-Bilder (Pilotierung T _2-gewichtete schnelle Erfassung Entspannung-enhanced ( RARE) SE-Sequenz) zur Bestimmung der Position des Gehirns in dem Magneten (Abbildung 4).
Verringern Sie die Geräusche der Gradienten durch die Erhöhung ihrer Rampe mal zu 1.000 us.
Bereiten Sie die fMRI Sequenz: RARE T _2-gewichtete Sequenz, effektive TE: 60 ms, TR: 2000 ms, RARE-Faktor: 8, FOV: 16 mm, Matrix-Größe: 64 x 32, Ausrichtung: sagittal, Schichtdicke: 0,75 mm, Inter-Slice Spaltdicke: 0,05 mm, 15 Scheiben, die nahezu das gesamte Gehirn (Abbildung 4).
Wählen Sie die auditive Protokoll (auditive Reize und den Zeitpunkt der Lieferung Stimulus) in der Präsentations-Software. Das Protokoll besteht aus einer Folge von Befehlen - für die Einleitung bestimmter akustische Reize - die zu einem bestimmten Scan-Zahl ausgeführt werden. Bei jeder Wiederholung in der fMRI Sequenz wird die Scanner-Software einen Trigger zur auditorischen Darstellung Software, die wiederum registriert die Scan-Nummer und führt den entsprechenden Befehl zu senden.
Um sicherzustellen, dass die auditive Präsentation Software nicht verpassen keine Trigger aus dem Scanner, wird die auditive Protokoll initiiert erste. Sobald das Protokoll voll beladen ist, wird die fMRI Sequenz gestartet.
Jeder fMRI Experiment wird durch den Erwerb von 12 Dummy-Bildern, damit das Signal des Auftrags durch den Scanner Lärm um einen stationären bevor Hörstimulation erreichen voraus.
Nach Erwerb Null-füllen die Daten auf 64 x 64.
Werfen Sie einen ersten (vorläufigen) Blick auf die Ergebnisse mit dem Werkzeug in der Paravision (Option Verarbeitung / Functional Imaging). Berechnen Sie den differentiellen BOLD Reaktion zwischen all den Blöcken und der Grundlinie (OFF-Blöcke). Diese Analyse gibt einen ersten Hinweis auf die Qualität des Experiments. Wenn keine Aktivierung in der primären auditorischen Bereiche in diesem Stadium zu sehen, hat der Vogel wahrscheinlich nicht hören / die auditive Reize aufgrund technischer Probleme mit dem Stimulus Präsentation, Anästhesie Ebene usw. Das Setup sollte überprüft werden und die Messung wiederholt verarbeitet.
Führen Sie eine anatomische 3D-RARE T2-gewichtete Sequenz in der gleichen Ausrichtung wie die bisherigen fMRT-Scans und mit effektiven TE: 60 ms, TR: 2000 ms, RARE-Faktor: 8, FOV: 16 mm, Matrix-Größe: 256 x 128 x 64.
Null-füllen die Daten zu 256 x 256 x 256.
Nehmen Sie die Zebrafinken aus der MRI Bett und lassen Sie es von der Narkose erholen in einem Käfig unter einem roten Lampe. Normalerweise geht die Wiederherstellung eines Zebrafinken nach Isofluran-Narkose relativ schnell (maximal 5 min). Nach nur wenigen Minuten werden die Vögel versuchen, aufzustehen und einmal der Vogel vollständig erholt ist, wird es auf einem Zweig statt sitzen auf dem Boden des Käfigs zu hocken. Die Dauer der Anästhesie ist etwa 2 Stunden für das vorliegende Experiment. Die maximale Zeit von Isofluran-Narkose angewendet Zebrafinken in unserem Labor ist 6 Stunden, nach dem die Vögel auch innerhalb von 5 min gewonnen.

4. Data Processing

Konvertieren Sie die MR-Daten in oder Analysieren Nifti Format.
Da SPM entwickelt wurde, um fMRI Daten beim Menschen erfassten Prozessdaten, dh für Voxel von etwa 2 mm. Zahlreiche SPM-Einstellungen werden auf diesem ungefähre Voxelgröße angepasst. Wenn man nicht wAmeise, um all diese Einstellungen zu ändern, ist der einfachste Weg zu gehen, um künstlich erhöhen die Voxelgröße von Vogel fMRI-Daten. Passen Sie die Größe Voxel in der Kopfzeile durch Multiplikation des realen Voxelgröße von 10 mit MRIcro. Es sollte angemerkt werden, dass eine solche Anpassung beeinflusst nicht die Daten selbst, kein Resampling oder andere Änderungen an den Daten angewendet wird.

Eine Alternative dazu ist die Verwendung von "SPMMouse ', die einen Werkzeugkasten ermöglicht SPM zu öffnen und zu analysieren Dateien jeder Voxel Dimension ist. Das Tool ermöglicht SPM "gläserne Gehirn", um aus jedem Bild erstellt werden, und stellt sich automatisch auf Standardwerte Längenskalen die Header der Bilddateien oder vom Benutzer eingegebenen Daten. Daher funktioniert diese Toolbox in die entgegengesetzte Richtung als das, was wir vorschlagen. Statt die Voxel Größe der Bilder in SPM passen, werden die Standardeinstellungen des SPM geändert, um Bilder mit unterschiedlichen Voxelgrößen verwenden.

Richten Sie die fMRI-Daten. Co-Register der anatomischen 3D-Datensatz zu ter fMRI Zeitreihen. Normalisieren der 3D-Daten (und die Zusammenarbeit registrierte fMRI Zeitreihe) an die Zebrafinken Gehirn MRI Atlas. Übernehmen Sie die Transformationsmatrix der fMRI Datenmenge. Dies alles kann unter Verwendung Statistische Parametric Mapping (SPM) 8 Software werden.
Glätten Sie die Daten mit einem 0,5-mm Breite Gauß-Kern mit SPM8.
Führen Sie statistische voxelbasierte Analysen mit SPM8. Modell die Daten als Box-Auto (kein hämodynamischen Antwort-Funktion). Schätzpreis Modellparameter mit dem klassischen Restricted Maximum Likelihood Algorithmus. Berechnen Sie die mittlere Wirkung der einzelnen auditorischen Reizes in jedem Fach (Festnetz-Einfluss-Analyse) und dann berechnen Statistiken für Analysen wünschte Gruppe (mixed-Effekt-Analysen).
Projizieren Sie das statistische parametrische Karte auf den Zebrafinken atlas (Abbildung 5) ⁹ in SPM8 zu lokalisieren die funktionellen Aktivierungen (Abbildung 6).