Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion als adäquate Vorbehandlung Stimulus zu frühe ischämische Toleranz zu Focal zerebraler Ischämie induzieren

Zusammenfassung

Es wird vermehrt Hinweise darauf, dass ischämischen Präkonditionierung (PC) - verleiht einen transienten Schutz einer nachfolgenden Beschädigung ischämischen - eine schonende ischämischen Herausforderung an das Gehirn. Wir haben festgestellt, bilateralen Arteria carotis communis Okklusion (BCCAO) als Vorbehandlung Stimulus bis Anfang ischämischen Toleranz (IT), um transiente fokale zerebrale Ischämie (induziert durch Mitte Zerebralarterie, MCAO) induzieren in C57Bl6 / J Mäusen.

Zusammenfassung

Es häufen sich Beweise, dass ischämischen Präkonditionierung - verleiht einen vorübergehenden Schutz auf eine spätere schädliche ischämischen Insult - ein nicht-schädigenden ischämischen Herausforderung an das Gehirn. Wir haben die bilateralen Arteria carotis communis Okklusion als Vorbehandlung Stimulus gegründet, um frühen ischämischen Toleranz gegenüber transienten fokalen zerebralen Ischämie in C57Bl6 / J Mäusen zu induzieren. In diesem Video zeigen wir Ihnen, die Methodik für diese Studie verwendet.

Einleitung

Der ischämische Schlaganfall ist eine Erkrankung mit einer hohen Mortalität und eine enorme sozioökonomische Belastung ^1. Trotz intensiver experimenteller und klinischer wissenschaftlichen Bemühungen in den letzten Jahrzehnten bleiben Behandlungsmöglichkeiten für akuten ischämischen Schlaganfall-Patienten sehr begrenzte ^2. Im Gegensatz dazu, wird Zunahme des Anteils älterer Menschen in den entwickelten Ländern drastisch erhöhen Inzidenz und Prävalenz von Patienten mit ischämischem Schlaganfall in den nächsten Jahrzehnten ^3. Daher besteht ein dringender Bedarf für neue Behandlungsstrategien bei Patienten mit ischämischem Schlaganfall.

Ein Ansatz ist es, weitere Verständnis in Mechanismen der endogenen Anpassung des Gehirns mit einer schädlichen Reiz bewältigen zu gewinnen. Das Gehirn stammenden Neuroprotektion ist auch als ischämischen Präkonditionierung (PC) oder Ischämietoleranz (IT) bekannt und bezeichnet das Phänomen, bei dem ein nicht-schädlichen Reiz schädliche Einwirkung auf das Gehirn, induziert einen Übergangswiderstandgegen einen nachfolgenden schädlichen ischämischen Insult ^4. Es tritt in zwei verschiedenen Zeitfenstern: früh IT, die innerhalb von Minuten bis wenigen Stunden nach PC erfolgt verzögert und IT, was braucht eine Latenzzeit von ein paar Stunden bis ⁴ auftreten.

Bisher hat sich die Forschung auf die IT in Gehirn verzögert IT konzentriert. Viel weniger ist über die Mechanismen der frühen IT bekannt. Das Ziel dieser Studie ist es, die bilateralen Arteria carotis communis Okklusion (BCCAO), die ein etabliertes Stimulus verzögert IT induzieren, wie eine angemessene PC Stimulus zu induzieren etablieren frühen IT vorübergehender fokaler zerebraler Ischämie (induziert durch Mitte Zerebralarterie, MCAO) in C57Bl6 / J Mäusen.

Während der beiden chirurgischen Eingriffen (BCCAO und MCAO), wurde die Überwachung des zerebralen Blutflusses (CBF) durch Laser-Doppler-Flussmessung (LDF) durchgeführt.

BCCAO wurde betäubt und spontan atmenden Mäusen durchgeführt. Beide Arteria carotis communis (CCA) ausgesetzt wurdenund verschlossen für 60 Sekunden, gefolgt von 5 min der Reperfusion. Diese BCCAO / Reperfusion Sequenz wurde zweimal wiederholt. Nach der Operation erholte sich schnell und Mäusen zeigte keine Anzeichen von Funktionsstörungen. Um auszuschließen, dass die oben beschriebenen BCCAO Protokoll nicht in verzögerten Zelltod im Gehirn führen, führten wir eine TdT-vermittelte dUTP-Biotin-nick end labeling (TUNEL)-Färbung 72 h nach BCCAO (oder Schein-Operation) in ein separate Gruppe.

MCAO ist ein weithin etablierten Modell für die Induktion von fokaler zerebraler Ischämie bei Nagetieren ^5-7. Die chirurgischen Eingriffe wurden mit standardisierten Arbeitsanweisungen (SOP) ⁸ durchgeführt. Nach Aussetzen links CCA wurde ein Silizium-covered Monofilament in den distalen CCA über die Arteria carotis interna (ICA) in den Kreis der Willis vorgeschoben, bis die vordere Hirnarterie (ACA) und damit der Ursprung der mittleren zerebralen Arterie eingeführt ( MCA) für einen definierten Zeitraum verschlossen. In dieser Studie haben wirverwendet 45 min von MCAO, die typischerweise zu einem ischämischen Läsion in der MCA Hoheitsgebiets der striatalen und kortikalen Hirnregionen.

In unserer Studie untersuchten wir den zeitlichen Verlauf der frühen IT mit BCCAO als PC Reiz. Unsere Daten zeigen, dass die optimale Zeitverzögerung zwischen BCCAO und MCAO früh IT ist 30 min zu induzieren.

In diesem Video geben wir eine Demonstration der beiden chirurgischen Verfahren, dh BCCAO und MCAO.

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Protokoll

Alle Verfahren in diesem Artikel beschrieben, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften des Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Deutschland durchgeführt.

Pre-chirurgische Eingriffe

1. Herstellung von Monofilen

1. Zur Herstellung der intraluminalen Filamenten wurden 8-0 Nylonmonofilament Nähte verwendet und wurden auf eine Länge von je 13 mm geschnitten.
2. Für die Beschichtung der Monofile wurde Xantopren M Schleimhaut (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland), indem Sie einen Tropfen Aktivator-Lösung (Activator, Universal plus, Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) verwendet aktiviert.
3. Das Monofilament wurde langsam durch das Silikon gezogen, bis es vollständig damit bedeckt. Auf diese Weise würde das Monofilament gleichmäßig mit Silikon abgedeckt werden. Vermeiden Sie zu lange warten, weil die aktiviert Beschichtungsmaterial wird fest und trocken schnell.
4. Bevor das Silikon zu erstarren beginntEmpfiehlt es abzustreifen übermäßige Silikon von der Wendel durch Ziehen über ein Blatt Papier. Auf diese Weise kann die Silikonschicht aus einer ungefähren Dicke von 200 um verdünnt werden.
5. Die Basis des Silikon-covered Monofilament wurde in Knetmasse stecken in Ordnung, lassen Sie es über Nacht trocknen.

Anmerkung: Im Idealfall nur sterilisiert oder desinfiziert mindestens Monofilamente verwendet, um die Sterilität an der Operationsstelle zu gewährleisten. In der Praxis ist die Sterilisation oder Desinfektion der Hand-made monofilaments sehr schwierig, weil die Qualität der Monofile ⁹ verschlechtern kann. Daher kann es bevorzugt sein, im Handel erhältlich sterile Monofilamente zu verwenden.

2. Herstellung von chirurgischen Instrumenten und der Tiere

1. Alle chirurgischen Instrumente wurden in 70% igem Ethanol erhalten. Zusätzlich vor jeder neuen Operation wurden alle chirurgischen Instrumenten sorgfältig eine gereinigtend desinfiziert mit 70% igem Alkohol.
2. Der OP-Bereich wurde gründlich desinfiziert unter Verwendung von 70% igem Alkohol bei allen Tieren vor Durchtrennung. Die desinfiziert Websites durften vollständig, bevor Sie die Schnitte trocknen. Zusätzliche Clipping des Fells wurde nicht durchgeführt, da dies microabrasions und nachfolgende Entzündungen der Haut verursachen können ^9.

Chirurgische Verfahren

3. Die Positionierung der Probe und LDF LDF Überwachung

1. Für die Induktion der Anästhesie wurden die Mäuse mit einem Gasgemisch, bestehend aus 30% Sauerstoff, 70% N ₂ O und 2,5% Isofluran mit einem Verdampfer ausgesetzt. Für die Wartung der Anästhesie wurde Isofluran-Konzentration auf 1,5% reduziert. Die Mäuse wurden spontan atmenden über Atemmaske während des chirurgischen Eingriffs.
2. Eine rektale Temperatursonde wurde eingesetzt und Mäusen wurden dem stereotaktischen Rahmen Aussetzen des parietalen Kopf fixiert. Während der Operation wurden die Mäuse auf ein ruhtThermostat gesteuerte Heizkissen, wodurch eine konstante Kerntemperatur von 37,0 ± 0,5 ° C. Eine sagittale Mittellinienschnitt (~ 1 cm Länge) wurde durchgeführt, um die parietal Schädel freizulegen.
3. Die linke Seite des Schädels wurde sorgfältig seziert und eine faseroptische Sonde wurde direkt auf den Schädel 2 mm und 5 mm kaudal lateral von Bregma mit Sekundenkleber fixiert. Danach wurden Wundränder sorgfältig auf Gehirn Hypothermie sowie Infektionen zu vermeiden.
4. Die Maus wurde um die ventrale Seite des Halses gedreht freizulegen. Die faseroptische Sonde wurde der LDF Gerät (Periflux System 5000, Perimed, Järfälla, Schweden) über Verbindungsleitungen Sonde Adapter (; Järfälla, Schweden Master-Probe 418-1, Perimed) verbunden.

Kommentar: Drehen Sie die Maus um, die faseroptische Sonde sollte mit Vorsicht gebogen werden, um zu vermeiden, dass es bricht aus dem Schädel.

5. Die LDF Gerät wurde an einen Laptop angeschlossen comComputer. Kontinuierliche Aufzeichnung von LDF-Werte wurde eingeleitet mit PeriSoft für Windows (Version 2.50, Järfälla, Schweden). Abbildung 1 zeigt den mittleren Verlauf von zehn CBF LDF Aufnahmen während BCCAO und Reperfusion erhalten.

4. Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion

1. Die Narkose wurde aufrechterhalten, wie in 3.1 beschrieben. Maus wurde auf den Rücken gelegt. Den Schwanz des Tieres und Pfoten wurden dem Heizkissen mit Klebeband fixiert. Eine sagittale ventralen Mittellinienschnitt (~ 1cm Länge) durchgeführt wurde.
2. Beide mundwässernden Drüsen wurden sorgfältig getrennt und mobilisiert werden, um die zugrunde liegende CCA visualisieren.
3. Sowohl CCA wurden sorgfältig von den jeweiligen Vagus Nerven und Begleitvenen ohne Schädigung dieser Strukturen getrennt. Manipulationen des Vagus-Nerven vielleicht vorübergehende oder dauerhafte Funktionsstörung des parasympathischen Nervensystems, die das Potenzial für das Auftreten von signifikanten kardialen arr hat dazu geführt,hythmia oder sogar irreversible Herzstillstand. Daher ist es wichtig, keine Manipulationen der Vagus-Nerven zu vermeiden. Eine lockere 5-0 Seidenfaden Schleife wurde um jeden CCA gemacht.
4. Ein kleiner Silikonschlauch (Durchmesser 2 mm) wurde zwischen dem CCA und die Seidenfäden auf jeder Seite eingefügt. Dieser Schlauch wurde als Schienung des CCA verwendet werden, um Beschädigung der Gefäßwand zu vermeiden, wenn die Nähte wurden angezogen (Fig. 4).
5. Sowohl CCA wurden für eine Minute durch Anziehen der Seidenfäden verschlossen. Nur Mäuse, in denen die LDF Signal auf <10% des Ausgangswertes Signal reduziert wurde, wurden in die Studie eingeschlossen. Nach Wiedereröffnung der beiden CCA wurde ein 5 Minuten Reperfusionsperiode eingeleitet. Durch LDF eine komplette Reperfusion wurde sichergestellt. Tiere mit unvollständiger Reperfusion (dh <90% für die Verwertung von CBF im Vergleich zum Ausgangswert CBF) wurden ausgeschlossen. Die Sequenz von einer Minute und fünf Minuten BCCAO Reperfusion wurde zweimal für insgesamt BCCAO durati wiederholtauf der 3 min. Abbildung 1 zeigt den mittleren Verlauf von zehn CBF LDF Aufnahmen während BCCAO und Reperfusion erhalten. Während des Verfahrens, ist es empfehlenswert, um den Hals gewickelt nass mit physiologischer Kochsalzlösung.
6. Nach der letzten Reperfusion wurden alle Rohre und Nahtmaterial sowie die faseroptische Sonde, die an dem Schädel entfernt, die Wunden vernäht und Lidocain Salbe (Xylocain 2%; AstraZeneca GmbH, Wedel, Deutschland) wurde wiederholt, um die Wunden angewendet wie für erforderlich analgetische Management.
7. Die Mäuse wurden in eine vorgewärmte übertragen (30 ° C) Rückgewinnungskasten (MediHEAT. PecoServives Ltd Brough, Cumbria, UK), bis sie komplett das Bewusstsein wiedererlangt hatte. Danach wurden die Mäuse auf ihre Tierkäfige zurückgegeben.

5. Middle Cerebral Artery Occlusion

1. Die Mäuse wurden wieder anästhesiert wurde ein rektalen Temperaturfühler eingefügt und die Mäuse wurden auf einem Heizkissen angeordnet, um die ventrale Seite des Halses freizulegen. Danach w sieere, werden wie im BCCAO Abschnitt beschrieben.
2. Eine permanente Ligatur mit einem langen 7-0 Seidenfaden wurde um den linken proximalen CCA gemacht und der Faden wurde sanft kaudal mit einem Moskito-Klemme (Abbildung 4) gezogen.
3. Eine weitere dauerhafte Ligatur um die linke äußere Halsschlagader (ECA) und der Faden auf der rechten Seite des Tieres gezogen (Fig. 4).
4. Bindegewebe rund um den linken ICA wurde vorsichtig mobilisiert und die Hypoglossus wurde leicht angehoben, um einen guten Überblick über den Verlauf des distalen ICA erhalten. Die linken ICA biegt nach links, während die pterygopalatina Arterie (PPA) folgt dem Verlauf des proximalen ICA nach rechts (Abbildung 4).

Kommentar: Es ist eine andere Arterie identifiziert, die sich auf der rechten Seite in Richtung Schwanzflosse werden. Dies ist die A. occipitalis, die variabel stammt entweder aus dem CCA Bifurkation oder von der proximal Teil der ECA (Abbildung 4).

5. Eine lose Fadenschleife wurde um den proximalen ICA unter Verwendung eines 5-0 Seidenfaden.
6. Mit einem kleinen microvascular Klemme wurde die ICA vorübergehend distal der 5-0 lose Fadenschleife (Abbildung 4) verschlossen.
7. Ein kleiner Einschnitt in dem distalen Teil des CCA CCA kurz vor der Verzweigung mit mikrovaskulären Schere (Abbildung 4).
8. Eine vorgewählte Silikon bedeckten Monofilament wurde in der CCA über den kleinen Schnitt eingeführt und dann in den ICA, bis es an der mikrovaskulären Klemme (Abbildung 4) gestoppt.
9. Die microCLAMP wurde vorsichtig von der ICA entfernt, während das Monofilament wurde tiefer in den ICA vorgeschoben, bis sie (Fig. 4) gestoppt. Kommentar: An dieser Stelle, drehen die Zange in der linken Hand, so dass Sie nicht halten es wie ein Stift. Dies hilft, den Faden mit der Pinzette leichter greifen.Die Gefäßklemme-Applikator sollte in der rechten Hand gehalten werden. Es könnte notwendig sein, ziehen Sie die losen fast 5-0 Naht um die ICA, um Blutungen aus dem Einschnitt Seite zu verhindern.
10. Die genaue Lage des Monofils Spitze identifiziert wurde, um zu überprüfen, ob es in der ICA und nicht in den PPA vorgeschoben wurde. Wenn das Monofilament Spitze in der proximalen PPA eingeführt wurde, wurde das Filament leicht wieder kurz vor dem ICA / PPA Bifurkation gezogen. Es wurde versucht, das Monofilament in die ICA wieder vorrücken, während leichtes Ziehen der proximalen ICA ein bisschen auf der rechten Seite. Damit war der natürliche Verlauf des distalen ICA simulierten macht es einfacher, die ICA zugreifen.
11. Nachdem das Monofilament in die ICA vorgeschoben wurde fast vollständig, wurde das lose 5-0 Fadenschleife um den proximalen ICA angezogen werden, um den Faden zu fixieren. Danach wurden alle Seidenfäden verkürzt und die Haut Wunde wurde genäht.
12. Der Flüssigkeitsverlust während der Operation wurde ReplenIshed durch die Injektion von 1,0 ml Kochsalzlösung ip Danach wurde die Maus auf den vorgewärmten Erholung Box übertragen, bis sie vollständig das Bewusstsein wiedererlangte.
13. Für Reperfusion wurden die Mäuse erneut narkotisiert und das Monofilament wurde nach vorsichtiges Lösen der 5-0 Seidenfaden um den proximalen ICA entfernt. Danach wurde die 5-0 Naht wieder vorsichtig angezogen werden, um Blutungen zu verhindern.
14. Nach Bestätigung der vollständigen Hämostase wurde die Wunde am Hals genäht.
15. Lidocain Salbe wurde wiederholt lokal auf die Haut aufgetragen, wie zur Schmerzlinderung erforderlich, und die Maus wurde auf die vorgewärmten (30 ° C) übertragen Rückgewinnungskasten bis es komplett das Bewusstsein wiedererlangte.
16. Als ein erster Hinweis für eine erfolgreiche MCAO Verfahren, im Uhrzeigersinn kreisen des Tieres beobachtet wurde. Die Schwere der funktionellen Defizit wurde mit Hilfe der Bederson Punktzahl für Mäuse ¹⁰ modifiziert. Nach diesem modifizierten Bederson Punktzahl, neurologischen Scores wir0 (normal Motorik), 1 (Beugung des Rumpfes und kontralateralen Vorderbein, wenn die Maus am Schwanz aufgehoben wurde), 2 (kreisen um der Gegenseite, wenn die Maus am Schwanz wurde auf eine flache Oberfläche gehalten, aber normal: wie folgt gestaffelt neu Haltung at rest), 3 (lehnt an der Gegenseite in Ruhe) und 4 (keine spontane motorische Aktivität oder tot).

6. BCCAO Sham Surgery

Für BCCAO Schein Verfahren wurden die Mäuse narkotisiert für die Dauer von einem echten PC BCCAO Verfahren wurden die Drüsen Speichelfluss mobilisiert und die CCA ausgesetzt waren. Es ist entscheidend, dass die direkte Manipulationen an den Halsschlagadern oder Vagus Nerven während Schein-Verfahren vermieden werden. Manipulationen des CCA beschädigen können seine Endothelschicht, das kann zu einer Freisetzung von vasoaktiven Verbindungen aus Endothel oder induzieren lokale Thrombose im arteriellen Lumen führen. Als Konsequenz daraus könnten thromboembolischer Ereignisse nach Schein-Operation auftreten. Dies wäre ein wichtiger Confounder von th werdene Verfahren. Auf der anderen Seite könnte Manipulationen der vagale Nerven vorübergehende oder dauerhafte Funktionsstörung des parasympathischen Nervensystems, welche das Potential für das Auftreten von signifikanten Herzrhythmusstörungen oder sogar irreversible Herzstillstand führt. Daher ist es wichtig, keine Manipulationen der vagale Nerven während BCCAO vermeiden.

Post-chirurgischen Eingriffen

7. Infarktvolumen Messungen

Für die Beurteilung der Infarktgrößen überlebten Mäuse für 72 Stunden nach MCAO. Danach waren tief narkotisierten Tiere, Gehirne entnommen, schockgefroren in methylbutan, geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin (mit Papanicolau dem Protokoll) für Infarktvolumen Messungen. Gehirn Schnitte wurden bei 600 um-Intervallen und Infarkt Bände gesammelt wurden unter Verwendung eines Bildanalysator (MCID Kern 7.0 Rev.2.0, GE Healthcare Niagara Inc) und korrigiert bei Ödemen nach der Methode von Lin et al. ^7,11 .

8. Einschlusskriterien

Wir enthalten nur Tiere, die eine LDF-gemessenen CBF Reduzierung um mehr als 90% in jedem der drei BCCAO Folgen hatte. Idealerweise sollte LDF Überwachung in beiden Hemisphären während BCCAO durchgeführt werden. Für Praktikabilität, führten wir LDF Überwachung nur in der linken Hemisphäre, die unterworfen später MCAO werden. Dieser Ansatz hat sich vor ^6,12 beschrieben worden. Reperfusion nach jedem BCCAO Folge war erforderlich, um vollständig sein (dh Rückkehr zu den Ausgangswerten). Aus Gründen der Verkürzung der Dauer Mäusen unter Narkose gehalten wurden, haben wir nicht überwachen CBF während MCAO Chirurgie. In einer Pilotstudie mit einer separaten Gruppe von Tieren, aber wir überwacht CBF durch LDF während MCAO Chirurgie. In dieser Gruppe von Mäusen, setzen wir konsequent gemessen eine Reduktion von 90% CBF im Vergleich zum Ausgangswert vor CCA Okklusion. Zusätzlich nach der Entfernung von Monofilamenten CBF zurückgewonnen, um> 90% des jeweiligenBaseline-Werte nach CCA Okklusion. Diese LDF Kriterien sind in der Literatur und Ergebnis in Einklang Infarkt Bände ⁷ etabliert. Wir haben nur Tiere, die enthalten ein Bederson Punktzahl von mindestens 1 nach Erwachen aus der Narkose nach MCAO hatte. Darüber hinaus zeigten die Tiere nur für 72 Stunden nach MCAO und welche überlebt keine Anzeichen von intrakraniellen Blutungen in der Studie enthalten waren.

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Ergebnisse

Unsere BCCAO Protokoll führte zu sofortigen und tiefen (> 90%) CBF Kürzungen, wenn beide CCA wurden verschlossen (Abbildung 1). Wiedereröffnung des CCA ist Reperfusion führte zu vervollständigen, wie durch LDF (Abbildung 1) überwacht. Nach PC zeigte Tieren keine Anzeichen einer funktionellen Behinderung. Darüber hinaus gab es keine Mortalität. TUNEL-Färbung durchgeführt 72 Stunden nach BCCAO in einer separaten Gruppe von Tieren zeigte keine Anzeichen von verzögerten Zellto...

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Diskussion

In unserer Studie haben wir gezeigt, dass drei Sequenzen BCCAO, jede dauert eine Minute, gefolgt von Reperfusion für fünf Minuten, eine angemessene ischämischen PC Stimulus zu früh IT induzieren.

Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Vorbehandlung Protokoll verwendet eine sichere und kleinere invasives Verfahren ohne nennenswerte postoperative Morbidität, keine Anzeichen von Apoptose in Gehirn und ohne Mortalität ist. Mehrere verschiedene Vorkonditionierung Protokolle wurden zuvo...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	SteREO CL 1500 ECO
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	David Kopf	Model 930
Scissors	FST	91460-11
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Mircovascular clamp	FST	00398-02
Clamp applicator	FST	00072-14
Springscissors	FST	15372-62
Needle holder	FST	12010-14
Needles	Feuerstein, Suprama	BER 562-20
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama