Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Zusammenfassung

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Zusammenfassung

Unkontrollierter Blutzucker ist ein Markenzeichen von Diabetes mellitus und Begleiterkrankungen fördert wie Neuropathie, Nephropathie und Retinopathie. Mit der zunehmenden Verbreitung von Diabetes, sowohl immun-vermittelte Typ-1-und Adipositas-Linked-Typ-2-Studien bei der Abgrenzung Diabetes Pathophysiologie und therapeutische Mechanismen abzielen, sind von entscheidender Bedeutung. Die β-Zellen der Langerhans-Inseln Langerhans sind entsprechend Absonderung von Insulin in Reaktion auf einen erhöhten Blutzuckerspiegel verantwortlich. Zusätzlich zu Glukose und anderen Nährstoffen sind die β-Zellen auch durch spezifische Hormone stimuliert, Inkretine bezeichnet, die aus dem Darm in Reaktion auf eine Mahlzeit und wirken auf β-Zellen-Rezeptoren, die die Produktion von intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat zu erhöhen sezerniert werden ( cAMP). Verringerte β-Zell-Funktion, Masse und Inkretin Reaktionsfähigkeit sind gut zu verstehen, die das Entstehen der Typ-2-Diabetes beitragen, und werden auch zunehmend verknüpft with Typ 1 Diabetes. Die vorliegende Maus Inselisolierung und cAMP-Bestimmung Protokoll kann ein Werkzeug, um zu beschreiben Mechanismen zur Förderung Fortschreiten der Krankheit und Therapiemaßnahmen, insbesondere solche, die von den Inkretin-Rezeptoren vermittelt werden oder verwandte Rezeptoren, die durch Modulation der intrazellulären cAMP-Produktion handeln. Während nur cAMP-Messungen beschrieben werden wird, schafft das beschriebene Inselisolierung Protokoll eine saubere Präparation, ermöglicht auch viele andere Downstream-Anwendungen, einschließlich Glucose-stimulierten Insulinsekretion, [3 ^{H]-Thymidin-Einbau,} Proteinmenge und der mRNA-Expression.

Einleitung

Die strikte Einhaltung euglycemia ist zwingend notwendig, um Begleiterkrankungen wie Neuropathie, Nephropathie, Retinopathie und, die alle Markenzeichen der Pathologie des unkontrollierten Typ-1-und-2-Diabetes sind ¹ zu verhindern. Reduzierte β-Zell-Funktion und Masse in Typ 1 und 2 Diabetes stören Blutglukosekonzentrationen ^2. Während immun-vermittelte Typ-1-Diabetes resultiert aus einem verheerenden Verlust von Insulin-produzierenden β-Zellen, gestörte β-Zellen Insulin-Sekretion und periphere Insulin-Signal bei Typ-2-Diabetes zusammen fördern Hyperglykämie, Dyslipidämie und erhöhte hepatische Glukoseproduktion, die schließlich zu sowohl Verlust der β-Zellmasse und Insulin sekretorischen Kapazität von einzelnen β-Zellen ^3. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen β-Zellen in der Progression des Typ-1-und-2-Diabetes wird hoffentlich Anlass zu neuen Therapien zur Vorbeugung und Behandlung dieser Krankheiten.

In-vitro-tiUSGABE Kulturmodelle, wie der INS-1 und β-MIN6 verewigt Zelllinien können nützliche Werkzeuge für das Verständnis spezifischer β-Zell-Funktionen sein. Jedoch sind die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Insel können sich regulieren β-Zellfunktion. Beispielsweise die parakrine Einfluss von Glucagon (aus α-Zellen freigesetzt) ​​und Somatostatin (von δ-Zellen freigesetzt) ​​in zunehmenden und abnehm Insulinsekretion bzw. zeigt die Bedeutung der Zell Zelle in der Nähe des endokrinen Reaktion ^4. Darüber hinaus gap junctions zwischen β-Zellen verstärken die Freisetzung von Insulin ^5. Obwohl Fortschritte wurden bei der Erzeugung Insulinom Leitungen, die besser repliziert die physiologische Reaktion von isolierten Inseln zu Glucose vorliegen (z. B. das INS-1-abgeleiteten 832/13 und 832/3 Zelllinien), die Glucose-Empfindlichkeit immer noch von normalen Ratten unterscheidet Inselchen ^6,7. Darüber hinaus ist die Antwort dieser klonalen Zellinien InsulinomGlucagon-like-Peptid-1 (GLP-1)-Agonisten kann drastisch voneinander aus normalen Inseln ⁶ unterscheiden, sowie. Daher kann immortalisierte Zelllinien das beste Modell für die Untersuchung Agenten, die Auswirkungen auf die cAMP-Produktion nicht zu vertreten.

Im Gegensatz zu den Insulinom-Zelllinien, studiert β-Zellfunktion nur in Ganztiermodellen besitzt einen eigenen Satz von Komplikationen. Eine der größten Herausforderungen in der Arbeit mit endokrinen Gewebe präzise Messung der Konzentration des Hormons freigesetzt. Insbesondere spielt die Leber eine wichtige Rolle metabolisierenden Insulin und die Bauchspeicheldrüse Blutfluss geht direkt in die Leber. Somit kann eine Plasmainsulinmessung nicht genau schildern die Mengen an Insulin aus der Bauchspeicheldrüse oder der Auswirkung von verschiedenen Behandlungen auf die Geschwindigkeit der Insulinabsonderung ⁸ sezerniert. Darüber hinaus kann Nierenstoffwechsel von Glucagon die Zuverlässigkeit von Glucagon Ausgabe von α-Inselzellen ⁹ begrenzen. Daher isolieren primären Maus Inseln für in-vitro-Experimenten eine genauere Verständnis davon, wie die Insel ist auf bestimmte Reize reagieren zu ergänzen Messungen in vivo gemacht.

Das vorliegende Protokoll für die Isolierung von Maus-Inseln ist ein gut etabliertes Protokoll, das von einer Reihe von Gruppen (mit leichten Modifikationen, die helfen, den Erfolg zu erhöhen) ^10,11 eingesetzt. Darüber hinaus ist die Bestimmung der cAMP-Produktion erlaubt eine direkte Auslesen des Inkretin Ansprechbarkeit der β-Zellen. In Verbindung mit cAMP-Messung, Proteingehalt und Insulinsekretion kann auch aus dem gleichen Lager Probenvorbereitungs quantifiziert werden, zu helfen, um zu bestimmen, ob ein Defekt in der β-Zell-Funktion liegt proximal oder distal zu cAMP ^10. Die endgültige cAMP-Gehalt und die Insulinsekretion Anwendung in diesem Protokoll kann ein sehr mächtiges Werkzeug für das Verständnis der Einfluss der Pharma-und Nahrungsbestandteile, unter anderen seins, auf die cAMP-und Insulinsekretion. Neben der Stimulation von Glukose allein, können auch andere Verbindungen verwendet werden, um Veränderungen in der cAMP-und Insulin-Sekretion ^10,11 messen.

Schließlich, obwohl Insulin ist die primäre Hormon wir Assay von isolierten Inseln, andere Hormone, wie Glucagon und Somatostatin, sowie Zytokine, Eicosanoide und cyclischem Adenosinmonophosphat, kann ebenfalls gemessen werden, entweder durch eine vorübergehende Stimulation Assay oder durch Quantifizierung ihre Niveaus in Kulturmedium ^12. Schließlich, obwohl außerhalb des Geltungsbereichs dieses Manuskripts Inselisolierung mit der beschriebenen Kollagenase Isolationsmethode ermöglicht Insel Erhaltung so, dass viele andere Downstream-Anwendungen verfolgt werden, wie zum Beispiel Inseltransplantation, RNA-Isolierung für die quantitative Echtzeit-PCR-oder Microarray-Analysen, Protein Isolation für Western Blot, Immunfluoreszenz-und Insel Einbettung Bildgebung und [3H]-Thymidin als Maß für die Inselzell-ReplikationKation, von denen einige in früheren JoVE Artikel ^13-16 beschrieben. Insgesamt nach der im Protokoll beschriebenen Inselisolierung Verfahren kann ein Forscher mit wichtigen und nützlichen Informationen für die Entwicklung von Therapien und Förderung der Arzneimittelforschung zur Verbesserung β-Zell-Funktion ausgerichtet ist.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt. Das Protokoll, die demonstriert wurde unter der Anleitung und Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Universität von Wisconsin-Madison durchgeführt.

1. Herstellung von Lösungen

1. Das Verfahren der Euthanasie in diesem Protokoll ist Ausbluten unter Narkose Avertin (für eine Übersicht von Alternativen, siehe Diskussion). Um Avertin, fügen 0,625 g (1,25% oder 44,2 mM) 2-2-2 Tribromethanol zu 1,25 ml 2-Methyl-2-Butanol in einem 15 ml konischen Röhrchen und Wärme bei 37 ° C für 20-30 min. Mischen Sie die Lösung auf hoch für 10-15 Sekunden in einer Zeit, die 2-2-2 Tribromethanol vollständig auflösen. Einmal vollständig gelöst ist, fügen Sie die Lösung, um 48.75 ml doppelt destilliertem H ₂ O, filtriert durch ein 0,45 um Filter in ein neues 50 ml konischen Röhrchen, wickeln Sie die 50 ml konischenal Rohr in Aluminiumfolie und bei 4 ° C bis zu einem Monat. Bringen Sie den Schlauch auf RT vor der Injektion Mäusen.
2. Um Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS), Make-up 1 L 1x HBSS von einem 10fach (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) in doppelt destilliertem H ₂ O, fügen 0,35 g (4,2 mM) NaHCO _3, und speichern bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Für jede Maus, werden 105 ml dieser Lösung (plus 5-10 ml Extra zum Pipettieren Fehler) für die Inselisolierung erforderlich.
3. Inseln sind sehr anfällig für hypoxische Schädigung; daher wird HBSS mit 95% O _2/5% CO ₂ geleitet, um die Konzentration von O ₂ im Blut zu simulieren. Spezialgasgemische können erworben werden, und eine Blasenbildung Station mit einer Pasteur-Pipette auf flexiblen Schlauch befestigt gesetzt. Nachdem die Blasenbildung die erforderliche Menge an HBSS mit 95% O _2/5% CO ₂ für 15 min, 0,02% addieren RIA Grade BSA (Rinderserumalbumin) nach Volumen und auf Eis halten remainder der Inselisolierung.
4. Für die Herstellung Ficoll, wiegen 32,5 g Ficoll in einem 400 ml Becherglas mit 80 ml HBSS zugegeben und bei 500-700 rpm für 30 min. Nach der Auflösung, gießen Sie die Ficoll-Lösung in einen 250-ml-Messzylinder geben und HBSS auf die 130-ml-Marke auf dem Messzylinder, um eine 25% Ficoll-Lösung zu schaffen. Decken Sie die Oberseite des Messzylinders mit zwei Portionen Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) und kräftig schütteln mehrmals.
5. Für eine 23%, 20,5% und 11% Ficoll-Lösung hinzuzufügen 27.6, 24.6, und 13.2 ml 25% Ficoll, jeweils mit 50 ml konischen Röhrchen. Dann bringen jede Lösung bis zu insgesamt 30 ml mit HBSS und gut schütteln zu mischen. Alle vier Ficoll-Lösungen bei 4 ° C gelagert werden und sind für bis zu 2 Wochen.
6. Collagenase-Lösung, die für die Isolierung von aktiven Inseln ist von Collagenase aus Clostridium isoliert vorbereitet geweblicheum (Materialien Tabelle). Jede Partie muss für Enzymeffizienz getestet werden. Typischerweise wird Kollagenase bei 0,3-0,5 mg pro ml HBSS verwendet. Mit Hilfe Enzymkonzentrationen in diesem Bereich (in der Regel 3 verschiedene Konzentrationen), bestimmen die Qualität und Quantität der isolierten Inseln von Alter abgestimmte Mäuse oder Geschwistern, die Arbeitsenzymkonzentration eingestellt.
7. Sobald die richtige Konzentration bestimmt, jede Maus erfordert 35 ml Collagenase in HBSS für die gesamte Isolation Protokoll. Schwenken Sie die Kollagenase in HBSS, sich aufzulösen. Unmittelbar vor der Operation, vor-legen Sie eine 5-ml-Spritze mit Collagenase-Lösung, legen Sie die Kanüle auf und entfernen Sie Luftblasen, und lassen auf Eis, bis sie benötigt.
8. Das Inselchen Kulturmedien für O / N ist eine Inkubation ergänzt RPMI 1640 Medien. Für die Stammlösung aufzulösen RPMI 1640 ein Paket (Gibco, New York) in 1 l doppelt destilliertem H ₂ O und 1,19 g HEPES hinzufügen (5 mM) und 2 g NaHCO ₃ (24 mm). Einstellen des pH auf 7,4,Filter zu sterilisieren, und bei 4 ° C im Dunkeln.
9. Für die Medien ergänzt, mit 10% FBS und 100 IU/100 ug / ml Penicillin / Streptomycin, jeweils an den Aktien RPMI 1640 Medien. Wenn eine andere Glukosekonzentration erwünscht ist, kann die Glucose-freiem RPMI 1640-Medium verwendet werden, und eine spezifische Konzentration von Glucose, zugesetzt werden.
10. Für ein Lager Krebs-Ringer-Bikarbonat-Puffer (Krebs), fügen Sie die folgenden Zutaten, um destilliertes Wasser in den folgenden Konzentrationen verdoppeln: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), MgSO ₄ (1,18 mM), KH ₂ PO ₄ (1,18 mM ), NaHCO ₃ (25 mM), HEPES (5 mM) und _CaCl &sub2; (2,52 mM) bei pH 7,4. CaCl ₂ sollte zuletzt zugesetzt werden und diese Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen gelagert werden.
11. Um einen Arbeitsvorrat von Krebs, erste Gas mit 95% O _2/182 5% CO ₂ für 10-15 min mit einer Pasteur-Pipette auf 37 ° C, gefolgt von der Zugabe von 0,5% BSA RIA-Qualität machenVol. Weiter wird Glucose auf die gewünschte Konzentration für die in-vitro-Assay zugegeben.

2. Vorbereitung der Werkzeuge

1. Etwas stumpf die Spitzen der 30 - und 27-G-Nadeln mit einem Schleifstein zur Abrundung der scharfen Spitze. Setzen Sie ein 45-Grad-Kurve in der Nadel etwa ¼ Zoll von der Spitze mit einer Zange. Seien Sie vorsichtig, nicht zu fest drücken, die den Innendurchmesser der Nadel zu schließen wird ausgeschaltet.
2. Schneiden Sie die 3/0 Seide Faden in etwa 4 Zoll Länge, eine für jede Maus.
3. Bedecken Sie den Boden Binokular mit Plastikfolie und Klebeband ab.
4. Schneiden Sie mehrere Stücke von absorbierenden Papierbank, ca. 3 x 5 Zoll groß, für mindestens 2 pro Maus.

3. Vorbereitung der Maus

1. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 1 ml Avertin.
2. Injizieren Sie die Lösung Avertin intraperitoneal bei etwa 40 ul / g Körpergewicht.
3. Nach der Maus keine longer reagiert auf Schwanz oder Hinterfuß kneift, sorgfältig überträgt es auf dem Binokular Arbeitsplatz.
4. Mit der Maus in die Rückenlage und seinen Kopf nach distal, sprühen Sie die Maus mit 70% wässrigem Ethanol. Achten Sie darauf, eine ausreichende Menge an 70% Ethanol verwenden, um die Menge von Pelz in der Brusthöhle ausgesetzt zu begrenzen.

4. Eröffnung der Brusthöhle

1. Klemmen Sie das Fell und die Haut der Maus zwischen den beiden Hinterbeinen und machen einen ersten Schnitt durch die Epidermis, Dermis und die zugrunde liegenden Membran.
2. Während noch Kneifen der Haut und des darunterliegenden Membran, schneiden in Richtung des vorderen Gliedmaßen auf beiden Seiten die Maus kümmert sich um Schnitt keine inneren Organe.
3. Falten Sie die Haut und Membranklappe über dem Brustkorb und entfernen Sie den Schwertfortsatz einen leichteren Zugang zu der Bauchspeicheldrüse für die Inflation zu ermöglichen.
4. Richten Sie die Maus mit dem Kopf nach proximal und bewegen die inneren Organe in Richtung der rechten Seite der Arbeit station, die absteigende Aorta offenbaren.
5. Es sei denn, Blutgewebe gesammelt werden soll, kann der absteigenden Aorta geschnitten werden, um euthanization abzuschließen. Genießen Sie die überschüssige Blut mit Bank Papier oder einem Kimwipe für leichteren Zugang zum Gallengang.

5. Aufblasen des Pankreas

1. Mit einem Binokular, die Position des Dünndarm, so dass die Gallengang bildet eine senkrechte Linie mit dem Kopf von der Maus.
2. Nehmen Sie eine Zange und fassen Sie den Dünndarm und finden Sie den Sphinkter Oddi (Sphinkter Ampulle) am Ende des Gallengangs, die sich auf den Dünndarm aus dem Gallengang spreizt, ein weißes Dreieck auf dem rosa Darm bilden. Sobald der Sphinkter Oddi gefunden wurde, nehmen Sie sich ein # 5 Dumont Zange und schieben Sie die Spitze unter dem Gallengang so nahe an den Dünndarm wie möglich, man aufpassen, nicht, um den Kanal zu durchbohren.
3. Nach dem Durchstechen durch den Dünndarm und Bindegewebe, verwenden Sie dieSpitze der Dumont-Zange, um den Faden zu greifen und ziehen Sie sie unter dem gemeinsamen Gallengang. Binden Sie den Gallengang so nah an der Sphinkter Oddi wie möglich machen, dass der Knoten ist straff, um ein Auslaufen zu verhindern.
4. Fassen Sie beide Enden des Fadens und ziehen Richtung Schwanz, etwas Spannung auf den Gallengang gelegt. Mit einer freien Hand, machen einen kleinen Schnitt mit dem Mikro-Schere in den Hauptgallengang direkt über der letzten Gabelung in die Leber. Hinweis: Es ist wichtig, nicht zu nah an den Sphinkter Oddi schneiden, da dies in einem Teil Inflation der Bauchspeicheldrüse führen und vermeiden Schneiden durch den Gallengang, wie es auch in einem armen Inflation führen.
5. Während mit dem Gallengang straff hält die beiden Enden der Schnur, entfernen Sie die Spritze / Kanüle, die mit 5 ml Collagenase-Lösung aus dem Eiskübel vorinstalliert hat, unten die Spritze gesetzt, und legen Sie die abgestumpft 30 G Nadel in den Ausschnitt Gallengang, man aufpassen, nicht auf die durch die wa durchbohrenll des Kanals. Wenn die 30-G-Nadel ist nicht breit genug für den Gallengang um eine Dichtung um zu bilden, entfernen und ersetzen mit dem abgestumpft 27 G-Nadel.
6. Während im Ort hält die Nadel, lassen Sie die Naht und holen sich das 5-ml-Spritze. Den Kolben der Spritze langsam niederdrücken. Hinweis: Wenn die Nadel wurde erfolgreich in den Gallengang eingeführt wird, wird es zu erweitern.
7. Fahren Sie den Kolben langsam und Ablassen in einer pulsierenden Mode drücken, bis der erste Teil der Bauchspeicheldrüse bläst, gefolgt von sanften Druck konstant, bis der Bauchspeicheldrüse nicht mehr gefüllt wird. Hinweis: Die meisten Bauchspeicheldrüsen halten 3-5 ml vor dem Start zu lecken. Außerdem wird eine erfolgreiche Aufblasen mäßige Verteilung der exokrinen Gewebe haben und der Teil des Pankreas auf dem Bauch aufgeblasen werden.
8. Entfernen Sie die Nadel aus dem Gallengang und machte sich auf die Seite.

6. Bauchspeicheldrüse Removal

1. Nehmen Sie eine Zange in der einen Hand und eine gekrümmte Schere indas andere. Mit der Zange, fassen den Dünndarm an der Sphinkter Oddi. Bei geschlossenen Schere, mit der Spitze auf separaten Teil der Bauchspeicheldrüse aus dem Dünndarm.
2. Verbreiten Sie die Schere auseinander, um die Lücke zwischen dem Dünndarm und der Bauchspeicheldrüse zu erweitern.
3. Platzieren Sie die "V" von der Schere wo der Dünndarm und Bauchspeicheldrüse befestigen zueinander an der rechten Seite des Spaltes, die gerade hergestellt wurde. Mit der Zange ziehen Sie vorsichtig den Dünndarm an den Schere, um die Bauchspeicheldrüse zu entfernen.
4. Halten Sie die Arbeitsdünndarm in den rosa Bindegewebe. An diesem Punkt, nehmen Sie den Dünndarm in der Nähe, wo es in den Magen legt und schneiden die Bauchspeicheldrüse weg vom Rest des Dünndarms. Hinweis: Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse schnippeln, wie es anfangen zu entlüften.
5. Packen Sie vorsichtig die Teil der Bauchspeicheldrüse, den Magen mit einer Zange (Flachzange am besten) angebracht. Während Sie sanft auf die Bauchspeicheldrüse, verwenden Sie die Kurved Schere an den Verbindungen zwischen der Bauchspeicheldrüse und Magen snip entfernt.
6. Suchen Sie die Milz und halten Sie es mit der Zange über der Bauchspeicheldrüse. Nehmen Sie die gebogenen Schere und schneiden Sie die Verbindungen zwischen der Milz und der Bauchspeicheldrüse.
7. Zu finden, wo die Bauchspeicheldrüse in den Dickdarm angebracht. Nehmen Sie den Dickdarm mit einer Pinzette und mit der Spitze der Schere durch zu stecken. Verbreiten die Schere auseinander vor, um eine Lücke zwischen dem Dickdarm und Bauchspeicheldrüse erzeugen.
8. Halten Sie den Dickdarm mit einer Pinzette: Das wird in der Bauchspeicheldrüse entfernt fallen auf, deren genaue Verbindungen zu den Dickdarm führen. Snip entfernt die restlichen Verbindungen.
9. Finden Sie die rosa Bindegewebe der Bauchspeicheldrüse und Dünndarm verbunden und so nah an der Bauchspeicheldrüse, wie möglich. Hinweis: Wenn Stechen der Bauchspeicheldrüse ist ein Anliegen, ist es ratsam, um näher an den Dünndarm zu schneiden, wie das Bindegewebe wird in späteren Schritten gefiltert werden.
10. Grab, wie viel von der Bauchspeicheldrüse wie möglich, und heben Sie sie vorsichtig. Mit einer gebogenen Schere, schneiden Sie die restlichen Verbindungen zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Brusthöhle, um die Bauchspeicheldrüse vollständig zu entfernen. Hinweis: Die Bauchspeicheldrüse sollte immer noch aufgeblasen, wenn sie richtig entfernt werden.
11. Speichern die Bauchspeicheldrüse entfernt in ~ 2,5 ml Collagenase-Lösung in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis, bis alle anderen Bauchspeicheldrüsen aufgeblasen worden sind und für den Versuch entfernt.

7. Wasch

1. Nehmen Sie alle isoliert Bauchspeicheldrüsen und verschieben Sie sie trennen 50 ml konische Röhrchen je 25 ml frischem Kollagenase-Lösung, die
2. Legen Sie die 50 ml konische Röhrchen aufrecht in einem 37 ° C Schüttelwasserbad schwingfähig bei 220-250 Umdrehungen pro Minute, mit der Schüttler ausgeschaltet.
3. Gas je 50 ml konischen Röhrchen mit 95% O _2/5% CO ₂ für 5 Minuten mit einer Pasteur-Pipette.
4. Verschließen Sie jedes Rohr verschließen und seitlich in SchüttelwasserbadBad unterhalb der Oberfläche des Wassers. Schütteln bei 220 bis 250 Umdrehungen pro Minute für 20 Sekunden, jede Minute, bis zu 16 min ab 6 min. (Schütteln bei 6, 8, 10, 12, 14, und 16 min)
5. Sofort die Rohre zu einer Zentrifuge bei Raumtemperatur für eine schnelle Runde zu übertragen. Bringen Sie die Zentrifuge bis zu 1500 Umdrehungen pro Minute (400-500 g), und schalten Sie sofort.
6. Mit Hilfe eines Vakuumfalle, absaugen etwa 22,5 ml der Collagenase-Lösung, ohne das Pellet zu stören. Waschen mit 10 ml HBSS und Wirbel sanft, brechen die Pellets.
7. Führen Sie eine weitere schnelle Runde bei Raumtemperatur bis zu 1.500 Umdrehungen pro Minute (400-500 g).
8. Aspirat etwa 10 ml der Lösung, wiederum ohne das Pellet zu stören.
9. Waschen Sie sich mit weiteren 10 ml eiskaltem HBSS und Wirbel sanft wieder brechen die Pellets. Wiederholen Sie die schnelle Runde und saugen 10 ml der Lösung.
10. Vortexen Sie vorsichtig das Pellet in den verbleibenden 2,5 ml HBSS-Lösung. Gießen Lösung durchEin 1000 um Maschen in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Dadurch wird die große Gewebestücke nicht durch die Kollagenase zu entfernen.
11. Spülen Sie die alte 50 ml konischen Röhrchen mit 2,5 ml eiskaltem HBSS. Verwenden einer Pasteur-Pipette, um die Seiten des Rohres gründlich vor dem Übertragen der 2,5 ml HBSS durch das Gitter in die neue 50 ml konischen Röhre zu spülen.
12. Führen Sie eine weitere schnelle Runde bei Raumtemperatur bei 1.500 rpm (400-500 g), um das Gewebe zu pelletieren.
13. Saugen Sie alle HBSS durch Kippen der Röhre in Richtung der Vakuumfalle. Anmerkung: Es ist sehr wichtig, um das Pellet nicht stören, da dies zum Verlust der Inseln führt. Wenn die Pellets lose oder beginnt, in Richtung der Vakuumfalle bewegen, stoppen Absaugen der Lösung und erneut pelle das Gewebe und dann weiter, um die verbleibende Lösung abzusaugen.
14. Sobald alle HBSS entfernt wurde, fügen Sie 4,8 ml 25% Ficoll-Lösung und Wirbel, brechen die Pellets.
15. Schicht sorgfältig 2,4 ml 23% Ficoll-Lösung auf die Oberseite der 25% Ficoll-Lösung durch Zugabe der 23% Ficoll-Lösung auf der Seite der 50 ml konischen Röhrchen. Um zu gewährleisten, auch Layering, drehen Sie den 50 ml konischen Röhrchen beim Hinzufügen des Ficoll-Lösung.
16. Wiederholen Sie das Verfahren zur Schichtung 20,5% und dann 11% Ficoll-Lösungen. Hinweis: Wenn vier verschiedene Schichten nicht vorhanden sind, fügen HBSS bis zur 50 ml-Marke und das Röhrchen 4-6 mal, oder bis die Ficollgradienten nicht mehr existiert. Re-Pellet das Gewebe, und wiederholen Sie Schritte 7,14-7,16.
17. Drehen Sie das 50 ml konischen Röhrchen bei RT bei 1820 rpm (800 g) für 15 min.
18. Gießen Sie alle Ficoll in ein frisches 50 ml konischen Röhrchen, kümmert sich um das Pellet der exokrinen Gewebe hinter sich zu lassen. In eiskaltem HBSS bis zur 50 ml-Marke und das Röhrchen 4-6 mal die Ficoll und HBSS zusammen mischen.
19. Spin der 50 ml konischen Röhrchen bei RT bei 1.820 Upm (800 g) für 5 min.
20. Vorsichtig die meisten der HBSS / Ficoll Mischung absaugen unter Verwendung einer Vakuum traSeite Bitte nicht stören das Pellet wie es ist locker und leicht abgesaugt werden.
21. Nehmen Sie eine Pasteur-Pipette und übertragen die Pellets in ein Einweg-Kulturröhrchen.

8. Picking-Inseln

1. 5 ml Kommissionierung Medien (dh. Ergänzt RPMI 1640 oder Krebs-Ringer-Bikarbonat-Puffer) auf die Einweg-Kulturröhrchen. Hinweis: Die Kommissionierung Medien werden je nach Downstream-Anwendungen variieren.
2. Lassen die Inseln auf dem Boden der Kulturröhrchen für 5 Minuten absetzen. Übertragen Sie sie mit einer Pasteurpipette auf eine 15 mm um 60 mm Polystyrol-Petrischale. Hinweis: Es ist wichtig, eine Petrischale, da diese nicht behandelt werden, zu verwenden und wird die Inseln aus in die Schale haftet.
3. In einem separaten 15 mm um 60 mm Petrischale aus Polystyrol, 5 ml Maus-Inselkulturmedien (100 ml RPMI 1640 Lizenz Medien, 10 ml hitzeinaktiviertem FBS, 1 ml Pen / Strep, Filter sterilisiert).
4. Mit Hilfe eines Binokular mit backlight Fähigkeit, mit einem P-20 Pipette auf die Inseln in die Petrischale mit Kulturmedien Insel holen, kümmert sich um die Übertragung zu vermeiden acinar Gewebereste. Als Hintergrundbeleuchtung, werden Inseln erscheinen bräunlich-Gold und ihren äußeren Membran kann glitzern, während acinärem Gewebe wird hellgrau und langweilig erscheinen. Wenn die Insel Vorbereitung eine große Menge von Schutt enthält, ist es ratsam, die Hand-Pick-Inseln zweimal in frisches Medium. Reduzierung Schutt Kontamination Insel Verklumpung nach einer Inkubation über Nacht zu begrenzen. Hinzufügen DNAse (3000 U / ml) auf die Verdauungspuffer kann auch helfen, Insel Verklumpung (JWJ, persönliche Beobachtung) zu begrenzen. Hinweis: Es ist wichtig, die Anzahl von Inseln isoliert, um für nachfolgende Experimente planen zählen.
5. Inkubieren Sie die Inseln O / N im Brutschrank auf 37 ° C mit 5% CO ₂ eingestellt.

9. CAMP Assay

1. Beschriften 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, einer für jede Wiederholung des Assays. Hinweis: cAMP-Assays sollte mindestens du habenDuplikate für jede Behandlung Zustand, aber mehr Wiederholungen pro Behandlung bevorzugt.
2. Nach Begasung des Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer für 15 min mit 95% O _2/5% CO ₂ mit der Pasteur-Pipette 0,5% BSA RIA-Qualität und eine Endkonzentration an Glucose von 1,7 mM (Vorinkubation Lösung). Dann, 1 ml der frisch vergast Krebs zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen. Zwei ml Krebs wird pro Röhrchen für die Pre-Inkubation und Behandlungszeitpunkte erforderlich; es wird jedoch empfohlen, mindestens 5-10 ml zusätzliche vorzubereiten.
3. Schwenken Sie die Inseln bis in die Mitte der Petrischale, und mit einer P-20-Pipette, Hand-nehmen die Inseln zu einem neuen 15 mm um 60 mm Polystyrol-Petrischale mit 5 ml der Vorinkubation Lösung, um die glukosehaltigen Kulturmedium waschen von den Inseln.
4. Die cAMP-Assay-Kit verwendet wird, ist die GE Healthcare cAMP Direkt BioTrak EIA. Das verwendete prococol ist eine Modifikation des für "Intrazelluläre cAMP meas beschriebensung unter Verwendung der nicht Acetylierung UVP-Verfahren mit den neuen Lysereagenzien ", und wurde für die Verwendung mit der minimalen Anzahl von Inseln pro Röhrchen optimiert, so dass eine erhöhte Anzahl von Behandlungsbedingungen und technische Replikate. Verwendung eines P-20 abpipettiert, mindestens 13 Inseln in jedes Röhrchen aus Schritt 9.2, Aufrechterhaltung Inselgröße Konsistenz zwischen den Rohren, mit 1 ml-Inkubationspuffer. Hinweis: Je höher die Anzahl der Wiederholungen ist vorteilhafter als die Anzahl der Inseln pro Röhre. Allerdings, wenn es genügend Inseln, die Anzahl der Inseln pro Rohr gleichmäßig zu erhöhen, empfiehlt es sich, dies zu tun, bis zu 25-50 Inseln pro Röhre.
5. Mit den Mikrozentrifugenröhrchen Kappen offen, Transfer in ein 37 ° C-Inkubator bei 5% CO ₂ und Inkubation für 45 min, um die Insulin-Sekretion von allen Inseln zu einem Basisniveau zu normalisieren.
6. Während die Proben inkubiert, bereiten die Behandlungen (dh 8 mm, 11,1 mm, 16,7 mM Glucose, etc.) in der begasten Krebs from Schritt 9.2. in 15 ml konische Röhrchen mit 1 ml extra für jede Pipettierfehlers Konto. Add 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) zu einer Endkonzentration von 200 uM. IBMX eine allgemeine Phosphodiesterase Inhibitor, die den Abbau von cAMP, was cAMP in der Zelle zu akkumulieren, wie es hergestellt wird. (Hinweis:.. Dies ist eine wahre cAMP-Produktion Assay Siehe die Diskussion Abschnitt für Instanzen bei der Messung der cAMP-Produktion kann nicht wünschenswert sein, wenn IBMX aus dem Test gelassen wird, wird mehr Inseln pro Rohr erforderlich, um Daten in die cAMP zu erhalten linearen Bereich der Standardkurve).
7. Nach 45 min Vorinkubation, entfernen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Inkubator, Mütze und Pulswirbel jede Probe (weniger als 0,5 s). Dies ist eine Verwechslung der Insulin-Gradienten, die wahrscheinlich auf den Inseln in dem Boden des Röhrchens konzentriert erzeugt wurde. Ist darauf zu achten, nicht zu hart vortexen werden, da dies negative Auswirkungen auf die Stabilität Insel (Hinweis: CappedRohre mit kleinen Inseln kann sanft blätterte oder umgekehrt, wenn es nicht möglich ist, leicht-Wirbelimpuls werden. Diese Optionen werden Zeit, um den Test, die berücksichtigt werden sollten bei der Planung des Experiments) hinzufügen.
8. Übertragen Sie jede Röhre zu einer Tischzentrifuge (RT) und Spin, bis die Inseln erreichen 10.000 rpm (7,000-7500 g) und biegen Sie dann sofort aus.
9. Verwenden Sie ein P-1000 Pipette, die meisten der Krebs in jeder Mikrozentrifugenröhrchen entfernen, wobei ca. 10-15 ul Krebs auf der Insel Pellets. Verwenden Sie einen P-20-Pipette, um den Teil der Insel am nächsten Pellet entfernen. Wenn Pellet wird gestört, pipettieren, die den Krebs wieder in die Röhre und Re-Spin.
   (Hinweis: Wenn der Experimentator findet es zu schwierig, alle der Krebs von der Insel Pellet ohne sie zu stören zu entfernen, kann die letzten 10-15 ul auf und links entfielen im Gesamtvolumen später im Protokoll.
10. Erhalten Sie eine ausreichende Menge von flüssigem Stickstoff in einem isolierten Behälter zu schnappen Einfrieren der Proben nach der Inkubation.
11. Nehmen Sie die Proben aus dem Inkubator, Kappe, Wirbel schnell (weniger als 0,5 sec) drehen die Mikrozentrifugenröhrchen in einer Tischzentrifuge (RT) bis zu 10.000 Umdrehungen pro Minute (7,000-7500 g) und dann sofort abgeschaltet. Wenn Insulin oder anderen Metaboliten ist eine gewünschte Anwendung abwärts, verwenden Sie ein P-1000 Pipette einen aliquoten Teil Medium sammeln in einem Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C bis zur weiteren Analyse. Wenn Stimulation Medien nicht gesammelt, kann es verworfen werden.
    (Anmerkung: IBMX ist ein starker Potentiator von Glukose-stimulierte Insulinsekretion (GSIS) Daher GSIS Ergebnisse von cAMP Stimulation Medium erhalten nicht genau die wahre Wirkung von bestimmten Behandlungen auf GSIS repräsentieren, vor allem, wenn diese Effekte sind subtiler.).
12. Wiederholen Sie Schritt 9,9, so viel Stimulation Medium wie möglich, ohne die Insel Pellet aufzurühren entfernen. Schnellfrost die Insel-Pellet in flüssigem Stickstoff, wenn es weniger als 10-15 ul Krebs links auf der Insel Pellets. Sobald das gesamteProben wurden schockgefroren, bei -80 ° C bis cAMP-Messung.
13. Am Tag der cAMP-Bestimmung, bereiten die neuen Lysereagenzien nach Protokoll der Hersteller. In 200 ml Lyse-Reagenz 1B in jedes Mikrorohr und Wirbel bei Höchstgeschwindigkeit für 30 Sekunden. Lassen Sie die Röhrchen sitzen auf Eis für 10 min, Vortexen alle 2 min 30 sec. (Anmerkung: Das Protokoll empfiehlt Durchführung einer mikroskopischen Analyse mit Trypanblau an Zelllyse zu gewährleisten, jedoch ist dies nicht für Inseln durchgeführt).
14. Bereiten Sie die Arbeitsstandards und richten Sie den EIA Mikro genau wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Nach der Enzym-Substrat wurde mit dem Mikro für 30 min inkubiert wurde, führen Sie die optionale 1,0 M Schwefelsäure Schritt, und bestimmen Sie die Absorption der Mikro Kavitäten bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
15. Cyclic AMP Ergebnisse werden als fmol / aufgezeichnet werden. Dies sollte auf das Gesamtvolumen der ursprünglichen Probe (200 ul + beliebige normalisiertRest Krebs links auf den kleinen Inseln von Schritt 9.9). Weiter können die Ergebnisse entweder auf die Gesamtzahl von Inseln normalisiert werden, so dass fmol cAMP erzeugt / Insel oder Lysat Proben können Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay, um die Ergebnisse der Gesamtzellprotein (was fmol / &mgr; g Protein) zu normalisieren unterworfen werden . Letzteres wird empfohlen, wenn Insel Größen inkonsistent zwischen den Proben und kann ein Ersatz für die Inselgröße. Der Pierce BCA-Protein-Assay-Kit wurde mit Erfolg in diesem Protokoll verwendet wurden, und erfordert nur 25 ml Probe. Die BSA-Standards sollten in Lyse-Reagenz 1B von der cAMP-Assay-Kit vorbereitet werden.

Ergebnisse

Um eine hohe Ausbeute bei der Isolierung Insel zu gewährleisten, sollten chirurgische Techniken im Protokoll beschriebenen genau befolgt werden. Obwohl die hier vorgestellten Verfahren wird jedem Labor zugeschnitten werden, gibt es ein paar wichtige Schritte, die zu einem erfolgreichen Isolierung führen. Um den gemeinsamen Gallengang leicht zugänglich zu machen, ist es empfehlenswert, dass die Organe auf der rechten Seite der Maus (Fig. 1) verschoben werden kann. Darüber hinaus ermöglicht dies die ...

Diskussion

Mit der Verbreitung von Diabetes voraussichtlich um 7,7% der Weltbevölkerung betreffen, ist die Voraussetzung für neuartige Forschungstechniken unerlässlich, sowohl Diabetes verstehen und zu behandeln ^18. Die vorliegende Inselisolierung ist ein gut etabliertes Protokoll für die in-vitro-Versuche verwendet und hat vorher mit leichten Modifikationen ^11,14,16 vorgestellt. Obwohl die Insulinsekretion ist ein gemeinsames stromabwärts Anwendung isolierten Inseln, die sich auf stromaufwärts...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (powder)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
0.8 mm Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15003-08
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe	BD	309646
1 ml BD syringe	BD	309628
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
27 G BD Needle 1/2" Length	BD	305109
Sharpening Stone	Fine Science Tools	29008-01
2-2-2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG