Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Zusammenfassung

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Zusammenfassung

Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren. Bei externen und / oder intrinsische Signale könnten Zellen sterben oder geben Sie einen stabilen Zellzyklus genannt Seneszenz. Mehrere zellulären Mechanismen, wie Telomerverkürzung und abnormale Expression mitogene Onkogene, haben gezeigt, dass Seneszenz bewirken. Seneszenz nicht auf normalen Zellen beschränkt; Krebszellen haben auch berichtet, altern.

Chemotherapeutika wurde gezeigt, Seneszenz in Krebszellen zu induzieren. Es bleibt jedoch umstritten, ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung. Als es schließlich könnte Patienten-spezifischen, wird eine schnelle und empfindliche Methode zur Seneszenz in Krebszelle beurteilen bald erforderlich sein.

Zu diesem Zweck stellt die Standard-β-Galactosidase-Assay wird die aktuell verwendete Methode, wesentliche Nachteile: es ist zeitaufwendig und nicht empfindlich. Wir schlagen hier eine Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Seneszenz auf li studierenve Zellen. Dieser Test hat den Vorteil, dass eine schnelle, empfindliche und können zur Immunmarkierung von verschiedenen zellulären Marker gekoppelt werden.

Einleitung

Seit Anfang der sechziger Jahre und seiner Entdeckung durch Hayflick und Moorhead, Seneszenz bleibt eine zelluläre Neugier ^1. Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren und durch Seneszenz Hayflick und Moorhead den zellulären Alterungsprozess geprägt. Seneszenz ist eine stabile Arretierung des Zellzyklus in dem Zellen metabolisch aktiv bleiben, um Zelltod entgegen. Bisher wurden vier zellulären Mechanismen gezeigt, Seneszenz induzieren: Verkürzung der Telomere, DNA-Schäden, Chromatin Störung und abnormale Expression von Onkogenen mitogene ^2. Dies deutet darauf hin, dass nicht nur normale Zellen, sondern auch Krebszellen sind in der Lage, Seneszenz ³ zu unterziehen. In der Tat wurden Krebszellen unterziehen Seneszenz gezeigt, um eine Barriere zur weiteren Tumorprogression ^4-5 darstellen. Allerdings haben einige Berichte nun darauf hin, dass unter bestimmten Umständen, zelluläre Seneszenz kann auch die Förderung Bösartigkeit ^6-7 hingewiesen. Studieren Seneszenz von Krebs cells ist im Begriff, ein Drang in der Krebsforschung als derzeit verwendeten Chemotherapeutika können Seneszenz von Krebszellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo ⁸ führen werden.

Die Master-Assay, um das Vorhandensein von alternden Zellen zu untersuchen ist β-Galactosidase-Assay bei saurem pH-Wert. Diese histochemischen Test spiegelt die in lysosomalen Biogenese vorkommenden in den meisten alternden Zellen erhöht. Kurz gesagt, wird exogene X-gal, die auf Zellen von β-Galactosidase in Lysosomen von alternden Zellen angereichert gespalten, was zu einer blauen Farbe ^9. Die blauen alternden Zellen können dann unter einem Hellfeld-Mikroskop quantifiziert werden. Obwohl sehr beliebt, stellt die β-Galactosidase Assay große Nachteile. Zuerst wird dieser Test auf fixierte Zellen durchgeführt. Zweitens ist es sehr zeitaufwendig, weil es um den Grad der Seneszenz durch Zählen eine signifikant hohe Anzahl von alternden Zellen unter einem Mikroskop zu quantifizieren impliziert. Drittens, dieser Testnicht empfindlich ist als die Unterscheidung zwischen alternden und nicht-alternden Zellen ganz auf die Betrachter.

Wir diskutieren hier ein ungenutztes, schnell und empfindlich Durchflusszytometrie basierende Assay auf das Vorhandensein von lebenden alternden Zellen beurteilen. Dieser Assay auf der Hydrolyse von einer Membran durchlässig Molekül, das 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C ₁₂ FDG) basiert, durch β-Galactosidase in alternden Zellen angereichert. Nach der Hydrolyse-und Laser-Anregung emittiert der C ₁₂ FDG grüne Fluoreszenz und kann daher mittels Durchflusszytometrie ^{10, 11} detektiert werden. Der Nachweis von alternden Zellen via Durchflusszytometrie bietet den großen Vorteil, dass sie schneller und empfindlicher. Darüber hinaus kann die Erfassung von alternden Zellen mittels Durchflusszytometrie mit der Detektion von anderen zellulären Marker gekoppelt werden. Dieser Test kann verwendet werden, um alternde Zellen in einer Population von Krebszellen mit einer Chemotherapie behandelt werden, erkennen und kann routinemäßig eingestellt werdenauf Gewebeschnitten nach zellulären Dissoziation, in der Klinik.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Herstellung von C12FDG, Bafilomycin A1 und Zellkultur

1. Man löst den C ₁₂ FDG Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer Endkonzentration von 20 mM. Aliquot und bei -20 ° C DMSO sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden.
2. Man löst den bafilomycin A1 Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 0,1 mM. Aliquot und lagern bei - 20 ° C. Bafilomycin sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden.
3. Kultivieren RPMI 8226-Zellinie, oder andere Zelllinien haftende oder nicht, in Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum und 1% Antibiotika, bei 37 ° C, 5% CO _2. Schätzen der Anzahl von Zellen für das Experiment benötigt. Um eine ausreichende Anzahl von Ereignissen in der Durchflusszytometrie aufgezeichnet werden 5 x 10 ⁵ Zellen erforderlich. Um den Prozentsatz der alternden Zellen bestimmen, drei Zellproben erforderlich: für unmarkierte Proben, unbehandelte Zellen, die mit C ₁₂ FDG gefärbt, behandelte Zellen angefärbt mitC ₁₂ FDG.
4. Seed die Zellen 24 Stunden vor Durchführung des Experiments so dass die Zellen in der log-Phase der Zellproliferation Kurve sind.

2. Induktion von Seneszenz

1. Induce Seneszenz von Krebszellen, indem Sie eine chemotherapeutische Medikament. Drug Konzentration und Dauer der Behandlung sollte der Zelltyp getestet angepasst werden. Beginnen mit einer 48-Stunden-Behandlung in einer Endkonzentration von 50 nM Doxorubicin für eine Konzentration der Zellen bei etwa 10 ⁶ Zellen / ml. Vergessen Sie nicht, unbehandelten Probe sind (negative Kontrolle).

3. Bafilomycin A1 Behandlung

1. Überprüfen Zelllebensfähigkeit durch Mischen von Zellen mit Trypanblau (v / v), die chemotherapeutische Medikament in dem vorhergehenden Schritt verwendet werden, um die Apoptose führen könnten. Füllen Sie in eine Kammer Malassez und zählen die Anzahl der blauen Zellen (tote Zellen) und der weißen Blutkörperchen (lebende Zellen). Wenn der Prozentsatz der Lebensfähigkeit ist weniger als 70%, vielleicht toten Zellen rem seinoved Verwendung eines geeigneten Kit, um sicherzustellen, dass tote Zellen nicht beeinflussen die nachfolgende Analyse.
2. Entfernen Sie die Kulturmedien und ersetzen durch vorgewärmte frische Kulturmedien. Behandeln der Zellen mit einer Endkonzentration von 100 nM bafilomycin A1. Bafilomycin A1 wird verwendet, um den sauren pH der Lysosomen zu neutralisieren. Inkubieren 1 h bei 37 ° C, 5% CO _2.

4. C ₁₂ FDG Färbung

1. Auflösen C ₁₂ FDG in vorgewärmte frische Nährmedien in einer Endkonzentration von 2 mM.
2. In der Verbindung zu den Zellen mit einer Endkonzentration von 33 uM und inkubiert 2 h bei 37 ° C, 5% CO _2. Bei der Verwendung von nicht-haftenden Zellen zentrifugiert, die Zellen bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C (die Geschwindigkeit haben könnte, um den verwendeten Zelltyp angepasst werden), 2x mit PBS waschen. Zellpellet in 500 ul kaltem PBS. Bei Verwendung von anhaftenden Zellen, entfernen Sie die Medien und waschen 2x mit PBS. Ernten Sie die anhaftenden Zellen unter Verwendung einer Trypsin-Lösung und ZentrifugeZellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C (die Geschwindigkeit möglicherweise zum verwendeten Zelltyp eingestellt werden). Zellpellet in 500 ul kaltem PBS. In beiden Fällen sollte die Zellkonzentration etwa 10 ⁶ Zellen / ml.
3. Führen Sie eine Co-Immunmarkierung weiter zu charakterisieren, die Bevölkerung von alternden Zellen.

5. Durchflusszytometrie

1. Kalibrieren des Durchflusszytometer unter Verwendung der Steuerung Perlen vom Hersteller des Durchflusszytometer empfohlen. Für alle Schritte müssen mindestens 10 ⁴ Ereignisse aufgezeichnet werden sollen.
2. Führen Sie die erste Probe, die unmarkierten Zellen. Bereiten Sie eine Zwei-Parameter-Grafik Anzeige Forward Scatter Channel (FSC) gegen Side Scatter Channel (SSC). Stellen Sie die Photomultiplier Tubes (PMT) und definieren Sie einen Bereich von Interesse außer abgestorbenen Zellen und Zelltrümmer, die während der Probenvorbereitung erschien haben könnte. Tor diese Region von Interesse in einer Ein-Parameter-Histogramm, FL1 auf der logarithmischen Skalader x-Achse und die Anzahl von Ereignissen in der y-Achse. Die Gesamtzahl der Ereignisse die Anzahl der analysierten Zellen. Stellen Sie die PMT so dass unmarkierten Zellen in der ersten Dekade erscheinen auf der logarithmischen Skala der x-Achse. Bestimmen Sie die Autofluoreszenz der Zellen, wenn nötig.
3. Führen Sie die zweite Probe, die unbehandelten Zellen. Auf der Ein-Parameter-Histogramm, FL1 (Fluoreszenz von C ₁₂ FDG), platzieren Sie den Cursor nach der schwach markierten Bevölkerung. Diese Schwelle wird es die Unterscheidung zwischen nicht-alternden Zellen (schwach markierten Zellen) und alternden Zellen (hell markierten Zellen).
4. Führen Sie die dritte Probe, die behandelten Zellen. Hell markierten Zellen scheinen also alternden Zellen über dem Schwellenwert in dem vorherigen Schritt bestimmt. Bewerten Sie den Prozentsatz der alternden Zellen, indem die Zahl der hellen Ereignisse pro Gesamtzahl der Veranstaltungen. Falls erforderlich, kann die Aktivität der β-Galactosidase auch unter Verwendung der mittleren Fluoreszenz werdenIntensität.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Multiples Myelom, eine hämatologische Malignität, wurde verwendet, um das Altern von einem chemotherapeutischen Verfahren induziert bewerten. Dazu muss ein handelsübliches MM-Zelllinie (RPMI 8226) für 2 Tage mit Doxorubicin, einem chemotherapeutischen Medikament behandelt wurde. Die Zellen wurden dann bafilomycin A1 unterzogen und weiter mit C ₁₂ FDG inkubiert. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Abbildung 1 zeigt die verschiedenen Schritte und zeigt, dass der Proze...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Wir präsentierten hier eine Durchflusszytometrie basierende Methode, um zelluläre Seneszenz in lebenden Krebszellen zu quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Verwendung der Membran durchlässig Verbindung, die C _12-FDG Basis und kann daher in allen Zelltypen und nach verschiedenen Behandlungen verwendet werden, solange die Verbindung von den Zellen aufgenommen. Nach Aufnahme in die Zelle ist die C ₁₂ FDG hydrolysiert durch die β-Galactosidase, in Lysosomen von alternden Zellen angereichert...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside	Invitrogen	D-2893
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Bafilomycin A1	Sigma	B1793
Doxorubicin	Sandoz
Trypan blue	Sigma	T8154
RPMI 1640 cell culture medium	Lonza	BE12-702
Fetal calf serum	PAA Laboratories GmBH	A15 101
Antibiotics	Gibco	5290-018
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter	A94291