Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Zusammenfassung

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Zusammenfassung

Patienten-abgeleitete iPSCs könnten eine unschätzbare Quelle von Zellen für zukünftige autologe Zelltherapieprotokolle sein. iPSC-abgeleitete myogene Stamm-/Vorläuferzellen, ähnlich wie pericyt-abgeleitete Mesoangioblasten (iPSC-abgeleitete Mesoangioblast-ähnliche Stamm-/Vorläuferzellen: IDEMs) können aus iPSCs hergestellt werden, die von Patienten generiert werden, die von verschiedenen Formen der Muskeldystrophie betroffen sind. Patientenspezifische IDEMs können mit unterschiedlichen Strategien(z.B. lentivirale Vektoren, menschliche künstliche Chromosomen) genetisch korrigiert und in ihrem myogenen Differenzierungspotenzial bei Überexpression des Myogenese-Reglers MyoD verbessert werden. Dieses myogene Potenzial wird dann in vitro mit spezifischen Differenzierungstests bewertet und durch Immunfluoreszenz analysiert. Das regenerative Potenzial von IDEMs wird in vivo,bei intramuskulärer und intraarterieller Transplantation in zwei repräsentativen Mausmodellen mit akuter und chronischer Muskelregeneration weiter evaluiert. Der Beitrag von IDEMs zum Wirtsskelettmuskel wird dann durch verschiedene Funktionstests an transplantierten Mäusen bestätigt. Insbesondere wird die Verbesserung der Motorkapazität der Tiere mit Laufbandtests untersucht. Die Zelltransplantation und -differenzierung wird dann durch eine Reihe von histologischen und immunfluoreszenz-Assays auf transplantierte Muskeln bewertet. Insgesamt beschreibt dieses Papier die Assays und Werkzeuge, die derzeit zur Bewertung der Differenzierungsfähigkeit von IDEMs eingesetzt werden, wobei der Schwerpunkt auf den Transplantationsmethoden und anschließenden Ergebnismaßnahmen zur Analyse der Wirksamkeit von Zelltransplantationen liegt.

Einleitung

Mesoangioblasten (MABs) sind gefäßassoziierte Muskelvorläufer, die aus einer Teilmenge von Pericyten^1-3abgeleitet sind. Der Hauptvorteil von MABs gegenüber kanonischen Muskelvorläufern wie Satellitenzellen⁴ liegt in ihrer Fähigkeit, die Gefäßwand zu überqueren, wenn sie intraarteriell geliefert werden, und trägt somit zur Skelettmuskelregeneration in Zelltherapieprotokollen bei. Diese Funktion wurde sowohl in murinen als auch in Canine Modellen der Muskeldystrophie^1,5,6bewertet und bestätigt. Diese präklinischen Studien haben die Grundlagen für eine klinische Erstphase-I/II-Studie auf der Grundlage einer intraarteriellen Transplantation von Spender-HLA-identischen MABs bei Kindern mit Duchenne-Muskeldystrophie (EudraCT-Nr. 2011-000176-33; derzeit im San Raffaele Hospital in Mailand, Italien) aufgebaut. Eine der Haupthürden der Zelltherapie-Ansätze, bei denen Milliarden von Zellen benötigt werden, um den Muskel eines ganzen Körpers zu behandeln, ist das begrenzte proliferative Potenzial des "Arzneimittels" (die Zellen). Darüber hinaus wurde vor kurzem gezeigt, dass es nicht möglich ist, MABs von Patienten zu erhalten, die von einigen Formen von Muskeldystrophien betroffen sind, da es bei Muskeldystrophie 2D (LGMD2D; OMIM #608099)⁷.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde vor kurzem ein Protokoll zur Ableitung von MAB-ähnlichen Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen und murinen iPSCs eingerichtet⁷. Dieses Verfahren erzeugt leicht erweiterbare Zellpopulationen mit einer vaskulären Gensignatur und einem Immunphenotyp, der erwachsenen, von Muskel-abgeleiteten MABs sehr ähnlich ist. Nach Expression des myogenen Regulatorischen Faktors MyoD werden sowohl murine als auch menschliche IDEMs (bzw. MIDEMs und HIDEMs) terminaler Skelettmuskeldifferenzierung unterzogen. Um dieses Ziel zu erreichen, können IDEMs mit Vektoren transduziert werden, die myoD-Expression antreiben können, entweder konstitutiv oder in duetzbarer Weise^8-10. Es wird ein lentiviraler Vektor verwendet, der MyoD cDNA enthält, der mit dem Östrogenrezeptor (MyoD-ER) verschmolzen ist, wodurch seine kernnukleare Translokation auf Tamoxifen (ein Östrogen-Analog-)Verabreichung^{ermöglicht wird 11}. Diese Strategie führt zur Bildung von hypertrophen mehrkernigen Myotuben mit hoher Effizienz⁷. Insbesondere IDEMs sind nichttumorigen, können bei der Transplantation die Wirtsmuskulatur ein- und differenzieren und können mit verschiedenen Vektoren(z. B. Lentiviren oder menschlichen künstlichen Chromosomen) genetisch korrigiert werden, was den Weg für zukünftige autologe therapeutische Strategien ebnet. Die Ableitung, Charakterisierung und Transplantation von IDEMs wurde in der obigen Publikation⁷beschrieben. Dieses Protokollpapier beschreibt die Assays, die durchgeführt wurden, um die in vitro myogene Differenzierung von IDEMs und die anschließenden Ergebnismessungen zu bewerten, um die Wirksamkeit ihrer Transplantation in Mausmodellen der Muskelregeneration zu testen.

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Protokoll

1. Bewertung des myogenen und Engraftment-Potenzials

1. In vitro: MyoD-induzierte Differenzierung
   1. Generieren Sie eine stabile Zelllinie von IDEMs, die mit dem tamoxifen-induzierbaren MyoD-ER lentiviralen Vektor transduziert werden und die Vielzahl der Infektionen titifizieren (MOI; z. B. 1, 5 und 50) unter Verwendung der in 1.1.9 (MyHC) beschriebenen Färbung als Ergebnis der Effizienz des Verfahrens.
   2. Eine 3,5 cm große Schale mit 1 ml 1% Matrigel beschichten und 30 min bei 37 °C bebrüten.
   3. Waschen Sie den Teller zweimal mit Medium, Samen 1 x 10⁵ MyoD-ER transduzierte IDEMs in der 3,5 cm Gewebekulturschale und inkubieren bei 37 °C in Wachstumsmedium.
   4. Erwarten Sie, dass Zellen in ein oder zwei Tagen den Zusammenfluss erreichen, und fügen Sie dann 1 M 4OH-Tamoxifen in das Wachstumsmedium^(1. Dosis) ein.
   5. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Wachstumsmedium durch differenzierungsmittel, ergänzt durch 1 M 4OH-Tamoxifen^(2. und letzte Dosis).
   6. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums jeden zweiten Tag durch ein frisches Differenzierungsmedium.
   7. Untersuchen Sie täglich die Kulturen auf Myotube-Bildung.
   8. Nach einer Woche (5 Tage im Differenzierungsmedium) die Platten vorsichtig mit PBS waschen und mit 4 % Paraformaldehyd für 5 min bei RT fixieren.
   9. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen Myosin-schwere Kette (MyHC) durch, um das Vorhandensein von Myotuben zu bestätigen. Gegenfleck mit einem Kernfarbstoff(z.B. Hoechst).

Die Effizienz der Differenzierung wird als Prozentsatz der Kerne in MyHC-positiven Zellen bewertet: Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Effizienz >50% beträgt.

2. In vivo: Engraftment in ein Modell der akuten Muskelregeneration
   Um den In-vivo-Beitrag von MyoD-ER IDEMs zur Muskelregeneration zu bewerten, sind die Zellen zuvor mit einer Vektorkodierung für das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) gekennzeichnet, die es ermöglicht, sie im Gewebe zu verfolgen. MyoD-ER GFP IDEMs werden dann in erwachsene murinische Muskeln injiziert, die zuvor mit einem Myotoxin(z.B. Kardiotoxin) verletzt wurden. Um eine Immunabstoßung gegen xenogene (z. B. HIDEMs) oder genetisch manipulierte/korrigierte Zellen zu vermeiden, ist es erforderlich, entweder immundefizienten oder immunsuppressiven Mäusen zu verwenden.
   1. Die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von 3,5 l/g 10 mg/ml Tamoxifen (lipolösliche Form) 24 Stunden vor der Transplantation und Pretreat-Zellen, die 1 M 4OH-Tamoxifen (wässrige Form) in das Wachstumsmedium über Nacht vor dem Transplantationstag hinzufügen, zurücknehmen.
   2. Verabreichen Sie der Maus Anästhesie und Analgesie gemäß den spezifischen Richtlinien, die chirurgische Eingriffe in der Tiereinrichtung regeln.
   3. Injizieren Sie 25 l von 100 m Kardiotoxin (CTX; von Naja mossambica mossambica; VORSICHT: potenziell schädliche Substanz) in den tibialis anterioren (TA) Muskeln.
   4. 24 Stunden nach der Behandlung der Tiere mit Tamoxifen und CTX, lösen Sie die Zellen durch Trypsinisierung und Zählen.
   5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 232 x g für 5 min.
   6. Waschen Sie das Zellpellet in Ca²⁺- und Mg²⁺- frei PBS, Zentrifuge und dann sanft das Zellpellet in Ca²⁺- und Mg²⁺-frei PBS auf eine Endkonzentration von 10⁶ Zellen/30 l, die das endgültige Volumen jeder Injektion sein wird.
   7. Injizieren Sie 30 l Zellsuspension in die zuvor verletzten Muskeln mit einer Spritze mit 29 oder 30 G Nadel. Achten Sie besonders darauf, während Sie die Nadel aus dem Muskel entfernen. Tun Sie es langsam, um zu vermeiden, dass die Zellsuspension durch die Spur der Nadel verschüttet wird. Transplantieren Sie die kontralaterale TA nicht und verwenden Sie sie nicht als Kontrolle, indem Sie 30 l Ca²⁺- und   Mg²⁺-freie PBS injizieren, um die Bedingungen des transplantierten ZU replizieren.
   8. Behandeln Sie die Tiere sechs weitere Tage mit Tamoxifen und verabreichen Sie analgesie(z.B. Carprofen) für zwei weitere Tage.
   9. Expflanzen Sie die Muskeln ab 14 Tagen nach der Transplantation. Verarbeiten und analysieren Sie die Proben gemäß den Protokollen 4 und 5.

2. Transplantation bei Mausmodellen der Muskeldystrophie

Dieser Transplantationstest ermöglicht die Bewertung des Ausmaßes der Transplantation von IDEMs in Mausmodellen der Muskeldystrophie. Die Tiere, die wie folgt behandelt werden, können auch auf funktionelle Verbesserung des Krankheitsphänotyps untersucht werden. Funktionelle Tests können ab zwei Wochen nach der Transplantation durchgeführt werden. Um die Engraftment zu verbessern, sollten Sie die Durchführung von VortransplantationLaufbandübungen (wie in Protokoll 3 beschrieben) und/oder serielleZellinjektionen alle drei Wochen für 3x(d. h. für insgesamt 3 Injektionen/Muskel) in Betracht ziehen.

1. Intramuskuläre Transplantation
   1. Die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von 3,5 l/g 10 mg/ml Tamoxifen (lipolösliche Formulierung) 24 Stunden vor der Transplantation und Pretreat-Zellen, die 1 M 4OH-Tamoxifen (wässrige Formulierung) in das Wachstumsmedium über Nacht vor dem Transplantationstag hinzufügen, zurücknehmen.
   2. Lösen Sie die Zellen bei 232 x g für 5 min durch Trypsinisierung, zählen und zentrifugieren.
   3. Waschen Sie das Zellpellet in Ca²⁺- und Mg²⁺-frei PBS, Zentrifuge und setzen Sie dann das Pellet in Ca²⁺- und Mg²⁺-frei PBS auf eine Konzentration von 10⁶ Zellen/30 l aus.
   4. Analgesie verabreichen und die Haut des Tieres (optional) mit einem Povidon-Jod- oder Chlorexidin-desin-basierten Desinfektionsmittel desinfizieren. Dies wird auch helfen, die Tibialis anterior (TA), Gastrocnemius (GC) und Quadriceps femoris (QC; speziell die vastus intermedius) Muskeln zu lokalisieren.
   5. Injizieren Sie 30 l Zellsuspension in die Muskeln mit einer Spritze mit 29 oder 30 G Nadel. Legen Sie für die TA 5 mm der Nadel 2 mm unter die Einfügung der proximalen Sehne (Kraniokaalrichtung) mit einer Neigung von 15° relativ zur Tibia ein und injizieren Sie langsam die Zellsuspension beim Einziehen der Nadel (leeren Sie die Spritze mit 2 mm der Nadel noch im Muskel). Für die GC und QC, wiederholen Sie das gleiche Verfahren wie für die TA detailliert, mit dem Hauptunterschied ist die kaudokranielle Insertion der Nadel 2 mm über der myotendinösen Kreuzung der Achillessehne für die GC und 2 mm über der distalen Sehne für die QC (15° Neigung in Bezug auf den Oberschenkelknochen). Achten Sie beim Entfernen der Nadel aus dem Muskel, um zu vermeiden, dass die Zellsuspension durch die Nadelspur verschüttet wird.
      TROUBLESHOOTING: Bei geringer Engraftment erwägen, juvenile (1-2 Wochen alt) Mäuse⁷ mit 3 x 10⁵ Zellen/10 l zu injizieren (beachten Sie, dass in diesem Fall Tamoxifen subkutan verabreicht werden muss).
2. Intraarterientransplantation
   Dieser Teil des Protokolls ermöglicht die Bewertung der Fähigkeit von MIDEMs und HIDEMs, in der arteriellen Zirkulation geliefert zu werden, die Gefäßwand zu überqueren und zur Regeneration der Skelettmuskulatur in den Muskeln flussabwärts zur Injektionsstelle beizutragen.
   1. Pretreat Tiere und Zellen wie oben in Schritt 2.1.1 beschrieben.
   2. Lösen Sie sich durch Trypsinisierung und Filter mit einem 40 m Zellsieb (um Cluster aus der Zellsuspension zu entfernen, falls die nächtliche Exposition gegenüber Tamoxifen die Fusion und Bildung von Myoröhren aus benachbarten Zellen antreiben könnte) die Zellen bei 232 x g für 5 min zählen und zentrifugieren
   3. Waschen Sie das Zellpellet in Ca²⁺- und Mg²⁺-frei PBS, Zentrifuge und setzen Sie dann das Pellet in Ca²⁺- und Mg²⁺-frei PBS mit 0.2 International
      Einheiten von Natriumheparin (optional) bis zu einer endgültigen Zellkonzentration von 10⁶ Zellen/50 l. Fügen Sie 10% Patent blauer Farbstoff (Endkonzentration: 1,25 mg/ml in normaler Saline oder Ca²⁺- und Mg²⁺-frei PBS) in die Lösung, um die Verteilung der Zellsuspension zu visualisieren.
   4. Verabreichen Sie der Maus anästhesie und analgesie gemäß den Richtlinien, die chirurgische Eingriffe in der jeweiligen institutionellen Tiereinrichtung regeln.
   5. Rasieren Sie die Leistenregion (auch bekannt als Femoral oder Scarpas Dreieck) und desinfizieren Sie die Haut mit einem Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-basierten Desinfektionsmittel.
   6. Machen Sie einen 5-7 mm Schnitt und lokalisieren Sie das Oberschenkelbündel: Vene, Arterie und Nerven (der Nerv liegt seitlich auf der Arterie und die Vene medial).
   7. Entfernen Sie vorsichtig die Bindefaszien, die das Bündel mit Zangen bedeckt.
   8. Trennen Sie die Femoralvene und den Nerv von der Arterie, indem Sie sanft die Spitze einer Zange (oder einer 30 G Nadel) dazwischen einführen und das Loch schrittweise vergrößern.
      TROUBLESHOOTING: Die femorale Vene ist zerbrechlich: Achten Sie darauf, sie während ihrer Ablösung von der Oberschenkelarterie nicht mit der Zange zu kneifen. Im Falle einer Blutung, abtropfen lassen Sie das Blut mit steriler Gaze und verwenden Sie einen Mikro-Kauteris, um Hämostase zu erleichtern.
   9. Heben Sie die Arterie mit einer Spitze der Zange an und klemmen Sie die Arterie mit der anderen Spitze.
   10. Punktieren Sie die Arterie mit einer Spritze, die mit einer 30 G Nadel ausgestattet ist. Injizieren Sie 50 l Zellsuspension nach dem gespannten Bereich mit einer Infusionsgeschwindigkeit von ca. 5 l/sek.
       TROUBLESHOOTING: Setzen Sie die Zellen in der Spritze vor der Injektion vorsichtig wieder auf: Es ist wichtig, die Ausfällung von Zellen und die Bildung von Luftblasen in der Spritze zu vermeiden. Der Durchmesser der Oberschenkelarterie ist etwas kleiner als eine 30 G Nadel: Achten Sie darauf, die Arterie nicht beim Einsetzen der Nadel zu fällen. Patent blauer Farbstoff ermöglicht die Erkennung der Wirksamkeit der Injektion: wenn richtig injiziert, wird die gesamte Gliedmaße schnell hellblau.
   11. Entfernen Sie langsam die Nadel und die Zange aus der Arterie, um den Blutkreislauf in der Gliedmaße wiederherzustellen.
   12. Setzen Sie Druck mit steriler Gaze auf, um Blutungen zu vermeiden und/oder nach Bedarf zu kauterisieren.
   13. Die Wunde besonieren und die Tiere bis zur Genesung von der Anästhesie überwachen.
   14. Analgesie 3 Tage lang verabreichen und die Wunde täglich inspizieren (bei einer Wundinfektion besprechen Sie dies mit dem Personal der Tiereinrichtung und verabreichen Sie bei Bedarf Antibiotika).

3. Ergebnismaßnahmen an transplantierten dystrophischen Tieren: Laufbandtest

Ab zwei Wochen nach der Zelltransplantation ist es möglich, die funktionelle Verbesserung der motorischen Kapazität behandelter Mäuse mit den Laufbandtests zu bewerten. Dieser Test ermöglicht die Bewertung der Trainingstoleranz/Ausdauer behandelter Mäuse. Eine Maus gilt als ermüdet, wenn sie sich für mehr als 5 Sek. im Ruhebereich legt, ohne zu versuchen, das Laufband nach einer Reihe von 3 aufeinanderfolgenden mechanischen Reizen (eine alle 5 Sek.) wieder einzubinden. Die Basismessungen beginnen etwa einen Monat vor der Behandlung und werden verwendet, um die Verbesserung jedes einzelnen getesteten Tieres zu bewerten. Diesem Test können zusätzliche Tests zur Überwachung der Faserfragilität, Der Kraftverbesserung, der Engraftmentierung, der Differenzierung transplantierter Zellen und der morphologischen Verbesserung der transplantierten Muskeln folgen (siehe Diskussion).

1. Akklimatisieren Sie die Tiere (in der Regel drei Gruppen: behandelt, unbehandelt und wilde Typ/nicht dystrophische Kontrollen) an die Übung vor der ersten Messung: Stellen Sie das Laufband auf eine Geschwindigkeit von 6 m/min für 10 min. Wiederholen Sie den Vorgang jeden zweiten Tag für eine Woche.
   TROUBLESHOOTING: Zeichnen Sie alle Messungen zur gleichen Tageszeit auf, um Verzerrungen aufgrund der zirkadianen Zyklen zu vermeiden.
2. Legen Sie die Tiere in das Laufband, das zuvor mit einer Neigung von 10° eingerichtet wurde.
3. Schalten Sie das Laufband mit einer Startgeschwindigkeit von 6 m/min ein (sorgen Sie für einen sanften mechanischen Reiz, falls die Tiere nicht bereit sind, die Übung zu beginnen).
4. Starten Sie den Timer und erhöhen Sie die Geschwindigkeit 2 m/min alle 2 min.
5. Sobald ein Tier mehr als 5 Sek. im Ruhebereich liegt, ohne zu versuchen, das Laufband wieder einzubinden, berühren Sie es vorsichtig mit einem Stock, um den Neustart der Übung zu stimulieren (siehe oben).
6. Zeichnen Sie die Leistung (Zeit und Entfernung) jedes Tieres auf.
7. Wiederholen Sie die Messungen wöchentlich oder alle 10 Tage für mindestens 3x.
8. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren nach der Transplantation.
9. Analysieren Sie Leistungsdaten, die die Messung jedes Tieres mit der Basisleistung vergleichen. Wir schlagen vor, die Werte in einem Diagramm als Prozentsatz der durchschnittlichen Motorkapazität relativ zum Ausgangswert darzustellen und sie durch einen ein- oder zweiseitigen ANOVA-Test zu analysieren, gefolgt von einem entsprechenden Post-Test, um die Gruppen zu vergleichen.

TROUBLESHOOTING: Mindestens 5 Alters-, Genotyp- und geschlechtsspezifische Tiere/Gruppen verwenden und die Messungen für mindestens das 3-fache nach der Transplantation wiederholen.

4. Bewertung der Zelltransplantation und Differenzierung in transplantierten Muskeln

Transplantierte und Kontrollmuskeln werden zum geeigneten Zeitpunkt geerntet (<2 Tage für die kurzfristige Transplantationsanalyse, 2-3 Wochen für die mittelfristige und >1 Monat für Langzeitanalysen). Wenn die transplantierten Zellen mit GFP gekennzeichnet sind, kann die Engraftmentierung in frisch isolierten Muskeln durch direkte Fluoreszenz unter einem UV-ausgestatteten Stereomikroskop beurteilt werden.

1. Legen und orientieren Sie sich entlang der vertikalen Achse frisch isolierte Muskeln in tragachanth Kaugummi (6% w/v)
2. Die Proben in vorgekühltem Isopentan für eine Minute dehydrieren, mindestens 2 min in flüssigem Stickstoff einfrieren und sofort bei -80 °C zur Lagerung aufbewahren.
3. Verarbeiten Sie die Proben mit einem Kryostat, um 7 m dicke Abschnitte auf polarisierten Dias zu erhalten. Probieren Sie den Großteil des Muskels auf den Dias und sammeln Sie ca. 8-10 Dias mit 30-40 Abschnitten/Dia. Es ist ratsam, eine Reihe von Abschnitten in eine 1,5 ml-Röhre zu sammeln, um molekularbiologische/biochemische Tests durchzuführen.
4. Bewerten Sie die Zellengraftierung mit unterschiedlichen immunfluoreszierenden Färbungen, je nach Versuchsaufbau. Zum Beispiel, im Falle einer HIDEM-Transplantation bei Sgca-null/scid/bg-Mäusen, Fleckenabschnitte mit: a) einem Antikörper gegen Lamin A/C zum Nachweis von transplantierten menschlichen Zellkernen; b) einen Antikörper gegen Laminin, um die Gesamtstruktur des Muskels zu visualisieren; und c) einen Antikörper gegen Sgca, um eine von Spendern abgeleitete Wiederherstellung des Proteins zu erkennen, das bei dem dystrophischen Tier fehlt.
5. Quantifizieren Sie mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops die Anzahl der Spenderkerne pro Muskelabschnitt innerhalb und außerhalb der Muskelfasern und die Anzahl der von Spendern abgeleiteten Skelettmyofiber pro Abschnitt.

5. Muskelhistopathologie

Histopathologische Analysen ermöglichen die Beurteilung der morphologischen Struktur des transplantierten Muskels. Als Ergebnis des Zelltherapieansatzes wird eine architektonische Verbesserung der Gewebestruktur erwartet.

1. Fixieren Sie die frisch isolierten Muskeln mit 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde bei 4 °C.
2. Dehydrieren Sie die Proben mit einem aufsteigenden Saccharosegradienten(z.B. 7.5-15-30% w/v).
3. Lassen Sie die Muskeln über Nacht in der höchsten Saccharoselösung.
4. Die Proben in Tissue Tek OCT einbetten, in vorgekühltes Isopentan einbetten, bis das OCT fest wird (vermeidung eines vollständigen Eintauchens der Proben), sie mindestens 2 min in flüssigen Stickstoff einfrieren und sofort bei -80 °C zur Lagerung platzieren.
5. Verarbeiten Sie die Proben mit einem Kryostat, um 7 m dicke Abschnitte wie oben beschrieben zu erhalten.
6. Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin oder Massons Trichrom nach den Standard-Herstellerprotokollen.

Hämatoxylin und Eosin Färbung ermöglicht die Berechnung von Kennzeichen der regenerierenden Muskeln, wie: a) die Anzahl der Myofiber; b) Querschnittsfläche; c) die Anzahl der Myofiber, die einen zentralen Kern enthalten. Massons Trichrom wird verwendet, um den fibrotischen Index zu berechnen, indem die Gesamtfläche der Skelettmyofiber von der Gesamtfläche des Bildes subtrahiert wird: der resultierende Bereich spiegelt hauptsächlich das Bindemittel und das Fettinfiltrat des Muskels wider. Alle Analysen auf den Bildern konnten mit ImageJ Software (NIH) mit dem Messwerkzeug und dem Zellzähler-Plugin durchgeführt werden.

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Ergebnisse

Die gemeldeten repräsentativen Ergebnisse folgen den wichtigsten In-vitro/in-vivo-Assays, die im Workflow in Abbildung 1dargestellt sind. 48 Stunden nach 4OH-tamoxifen Verabreichung MyoD-positive Kerne sind innerhalb von MyoD-ER transduced IDEMs in Kultur identifizierbar (Abbildung 2A). Die Zellen verschmelzen dann und differenzieren sich in mehrkernige Myoröhren (Abbildung 2B). Bei der intramuskulären Transplantation in ein murines Modell akuter Muskelverlet...

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Diskussion

iPSCs können auf unbestimmte Zeit erweitert werden, wobei ihr Selbsterneuerungspotenzial erhalten bleibt und so in eine breite Palette von Zelllinien¹²differenziert werden. Aus diesem und anderen Gründen gelten iPSC-abgeleitete Stamm-/Vorläuferzellen als vielversprechende Quelle für autologe Gen- und Zelltherapieansätze¹³. Eine zuvor veröffentlichte Arbeit der Autoren berichtete über die Erzeugung von Maus- und humanen myogenen Vorläufern aus iPSCs mit einem Phänotyp, der dem von Pericyt-ab...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
MegaCell DMEM	Sigma	M3942
DMEM	Sigma	D5671
IMDM	Sigma	I3390
Horse serum	Euroclone	ECS0090L
Foetal Bovine Serum	Lonza	DE14801F
PBS Calcium/Magnesium free	Lonza	BE17-516F
L-Glutammine	Sigma	G7513
Penicilline/Streptomicin	Sigma	P0781
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)	Gibco	51500-056
Nonessential amino acid solution	Sigma	M7145
Fer-In-Sol	Mead Johnson
Ferlixit	Aventis
Oleic Acid	Sigma	01257-10 mg
Linoleic Acid	Sigma	L5900-10 mg
Human bFGF	Gibco	AA 10-155
Grow factors-reduced Matrigel	Becton Dickinson	356230
Trypsin	Sigma	T3924
Sodium heparin	Mayne Pharma
Trypan blue solution	Sigma	T8154	HARMFUL
Patent blue dye	Sigma	19, 821-8
EDTA	Sigma	E-4884
Paraformaldehyde	TAAB	P001	HARMFUL
Tamoxifen	Sigma	T5648
4-OH Tamoxifen	Sigma	H7904
pLv-CMV-MyoD-ER(T)	Addgene	26809
Cardiotoxin	Sigma	C9759	HARMFUL
Povidone iodine
Tragachant gum	MP Biomedicals	104792
Isopenthane	VWR	24,872,323
Tissue-tek OCT	Sakura	4583
Sucrose	VWR	27,480,294
Polarized glass slides	Thermo	J1800AMNZ
Eosin Y	Sigma	E4382
Hematoxylin	Sigma	HHS32
Masson's trichrome	Bio-Optica	04-010802
Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody	DSHB	MF20
Mouse anti Lamin A/C antibody	Novocastra	NLC-LAM-A/C
Hoechst 33342	Sigma Fluka	B2261
Rabbit anti Laminin antibody	Sigma	L9393
MATERIALS AND EQUIPMENT
Adsorbable antibacterial suture 4-0	Ethicon	vcp310h
30 G Needle syringe	BD	324826
Treadmill	Columbus instrument
Steromicroscope	Nikon	SMZ800
Inverted microscope	Leica	DMIL LED
Isoflurane unit	Harvad Apparatus
Fiber optics	Euromecs (Holland)	EK1
Heating pad	Vet Tech	C17A1
Scalpels	Swann-Morton	11REF050
Surgical forceps	Fine Scientific Tools		5/45
High temperature cauteriser	Bovie Medical	AA01
MEDIA COMPOSITION
Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium: MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM) 5% fetal bovine serum (FBS) 2 mM glutamine 0.1 mM β-mercaptoethanol 1% nonessential amino acids 5 ng/ml human basic fibroblast growth factor (bFGF) 100 IU ml penicillin 100 mg/ml streptomycin Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in: Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 10% FBS 2 mM glutamine 0.1 mM β-mercaptoethanol 1% Nonessential amino acids (NEAA) 1% ITS (insulin/transferrin/selenium) 5 ng/ml human bFGF 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin 0.5 μM oleic and linoleic acids 1.5 μM Fe2+ (Fer-In-Sol) 0.12 μM Fe3+ (Ferlixit) MIDEMs growth medium: DMEM 20% FBS 2 mM glutamine 5 ng/ml human bFGF 100 IU ml penicillin 100 mg/ml streptomycin Differentiation medium: DMEM 2% Horse Serum (HS) 100 IU ml penicillin 100 mg/ml streptomycin 2 mM glutamine
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.