Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Zusammenfassung

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Zusammenfassung

Multi-Color-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, um bestimmte Moleküle in der Zellmembran erkennen kann, mit Parallelplattenlaufkammer Assays zu Mechanismen, die Zell-Adhäsion unter dynamischen Strömungsbedingungen zu untersuchen gekoppelt werden. Beispielsweise können Krebszellen mit mehreren Fluorophoren über eine möglicherweise reaktive Substrat zu modellieren Mechanismen der Krebsmetastasierung perfundiert werden. Allerdings, Multi-Channel einzelnen Kamera-Systeme und Farbkameras zeigen Mängel in der Bildaufnahme für die Echtzeit-Live-Zellanalyse. Um diese Einschränkungen zu überwinden, eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem verwendeten wir gleichzeitig erfassen Echtzeit-Bildsequenzen von fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusskammer. Dual-Kamera-Systeme Emissionsspaltfilter definierten Wellenlängenbereichen in zwei monochrome CCD-Kameras, wodurch gleichzeitig erfassen zwei räumlich identisch, aber Fluorophor-spezifische Bilder. Anschließend werden psuedocolored Ein-Kanal-Bilder in einer einzigen kombiniertenEchtzeit-Sequenz zusammengeführt, die mehrere Zielmoleküle auf Zellen, die sich schnell über einen Bereich von Interesse offenbaren kann.

Einleitung

Verfahren zur Analyse von Molekülen auf der Zelloberfläche, wie z. B. Immunfärbung Sonden einzusetzen, die chemisch mit Fluorophoren konjugiert sind, was den Nachweis von Zielmolekülen. Live-Cell-Imaging-und hydrodynamischen Fluss-basierte Zelladhäsionsassays werden typischerweise mit monochromen CCD-Kameras entwickelt, um physiologische Prozesse auf zellulärer und / oder molekularer Ebene ^{1, 2} erfassen aufgezeichnet. Diese Kameras sind sehr empfindlich, liefern schnelle Bildraten (mehr als 30 Bilder pro Sekunde) und bieten außergewöhnliche zeitliche Auflösung (durch schnelle Bildraten und kurzen Belichtungszeiten). Allerdings kann nur Monochrom-Kameras erfassen einen einzigen Emissionskanal (Erfassung eines einzelnen Fluorophors), um Bilder zu sammeln. Einzelne Kamera Emissions Splitting-Systeme können integriert werden, um mehrere Emissionskanäle zu erfassen, aber oft reduzieren das Sichtfeld und benötigen die gleiche Belichtungszeit für die Abbildung aller Kanäle. Um das volle Farbspektrum von Zellen mit multip beschriftet erfassenle Fluorophore, eine Farbkamera kann als Alternative verwendet werden. Allerdings sind Farbkameras in der Regel nicht in der Lage, die für Live-Cell-Imaging in bestimmten Anwendungen gewünschten zeitlichen Auflösung. Eine weitere bildgebende Gerät ist für Anwendungen, bei denen es vorteilhaft ist, Bild lebenden Zellen bei mehreren Wellenlängen ist, unter Beibehaltung einer hohen zeitlichen Auflösung benötigt. Ein Hauptanwendungsgebiet ist die experimentelle Parallelplattenflusskammer Adhäsionstest, in denen Zellen in physiologisch relevanten Bedingungen über einen potentiell reaktive Substrat ^{1, 3} perfundiert. Zellen, die in Strömungs spezifische Zelloberflächenmoleküle exprimieren, haften und rollen auf dem Substrat, beispielsweise eine Zell-Monoschicht exprimieren Adhäsionsmoleküle oder Oberfläche adsorbiert extrazelluläre Matrixproteine, ^{4, 5.} Rollzellen können Rotations-und Translationsbewegung in Bruchteilen einer Sekunde durchlaufen. Molekularen Eigenschaften auf Walzen und adhärente Zellen, wie Cluster von Zelloberflächenmolekülen, auch die Potentiometeral aktive Reorganisation auf der Zelloberfläche zu unterziehen. Somit muß Abbildungssysteme eine außergewöhnliche zeitliche Auflösung liefern (30 Frames pro Sekunde oder mehr und "nahe Null" Belichtungszeiten), um eine Bildfolge, die die Schritt-für-Schritt-Fortschreiten der Zelle Walzen ^{6, 7} veranschaulicht zu erzeugen. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme sind in der Lage, diese Anforderungen zu erfüllen für die Bildgebung von Zellen mit mehreren Fluorophoren markiert.

Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme aufgeteilt und Filterfluoreszenzkanäle in zwei ähnliche Kameras erfassen gleichzeitig zwei räumlich identisch, aber Fluorophor spezifische Bilder unter Beibehaltung der vollen Sichtfeld. Diese Technologie ermöglicht den direkten Vergleich der in Echtzeit in jedem Kanal aufgenommene Bild und ermöglicht dem Benutzer, schnell zwischen Kamera-Modelle wechseln mit verschiedenen Imaging-Funktionen. Diese Funktion ist nützlich, um Einstellungen für Bild-Capture-Einstellungen in eine Kamera, die besser damit das System zu erfassenFluorophore mit unterschiedlichen Intensitäten, Gültigkeitsdauer und Extinktionskoeffizienten ^8. Gekoppelt mit Imaging-Software, Dual-Kamera-Emissionsspalt Systeme ermöglichen die Echtzeit-Aufzeichnung von Live-Cell-Imaging-Tests in mehreren Wellenlängen und kann in vitro-Assays, die Fluoreszenz zu verwenden, um das Verhalten der Zelle untersuchen zu verbessern.

Protokoll

1. Software-Installation

1. Kaufen StreamPix 5 Multi-Kamera-Software mit SimulPix Modul oder andere Imaging-Software in der Lage, das Sammeln und Kombinieren von Bildern durch monochrome CCD-Kameras eingefangen.
2. Mindestanforderungen für StreamPix 5 sind: Ein PC mit Core 2 Duo ausgestattet mit 2,4 GHz oder besser mit 2 GB RAM oder höher. Ein unterstützter IEEE digitale oder analoge Kamera und kompatible Framegrabber. Windows-XP/7/Vista 32 oder 64 Bit. Ein Monitor mit Auflösung 1024 x 768 oder höher. Eine Grafikkarte mit guter 2D-Leistung (OCU auszudrücken 16x oder besser wird empfohlen) und 7200-RPM-Festplattenlaufwerk für die Aufzeichnung mit RAID-O-Konfiguration.

2. Installation von Dual-Kamera-System, das Zwei-Farben-Simultan-Echtzeit-Imaging

1. Schließen Sie das DC2 Photometrics Emissions Splitter oder ähnliche Doppelkamera Emissionstrenneinrichtung, an das Mikroskop, indem Sie den DC2 C-Mount-Adapter in den Videoanschluss des MICROscope so dass das Gehäuse des dichroitischen auf der Vorrichtung zugänglich ist.
2. Legen Sie zwei monochrome CCD-Kameras in weibliche C-Mount-1 und weibliche C-Mount-2. Identische Kameras sind bevorzugt. Ähnliche Kameras verwendet werden, aber die Kompatibilität ist von internen Hardware, vor allem der CCD-Bildsensor.
3. Verwenden Imaging-Software, um Bilder von beiden Kameras anzuzeigen. Die folgenden Schritte (2.3.1 - 2.3.4) gelten für StreamPix 5 mit SimulPix Modul und muss für andere Multi-Kamera-Imaging-Software angepasst werden.
   1. Offene StreamPix 5 und wählen Sie "Arbeitsplatz" in der Task-Band.
   2. Öffnen Sie "Arbeitsbereich-Manager" am rechten Bildschirmrand und wählen Sie "neuen Arbeitsbereich".
   3. Nach der Benennung eine Kamera, folgen Sie Software dazu aufgefordert, einen Grabber aus einem bereits besiedelten Liste auswählen. Wählen Sie den passenden Grabber das Kameramodell, und wiederholen Sie für die zweite Kamera Arbeitsbereich. Für die fusionierte Arbeitsbereich noch einmal wiederholen, aber "alle Kameras im Einsatz sind" Fehler message erscheint. Diese Meldung ist normal.
   4. Sobald die fusionierte Arbeitsbereich geladen wird, weisen Kameras aus dem Arbeitsbereich 1 und 2 Arbeitsbereich zu dem neuen Arbeitsbereich in der auf der rechten Seite des Bildschirm befindet Docking Panel.
4. Richten Kameras in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem.
   1. Richten Kameras im Hellfeld oder Phasenkontrast mit dem Kalibrierungsgitter vom Hersteller mit einem PlanApo 40X-Objektiv (oder höher) zur Verfügung gestellt.
   2. Senden Licht in die Mikroskop-Okulare, legen Sie die mit metallischem Überzug Kalibrierungsgitter, die vom Hersteller auf dem Mikroskoptisch zur Verfügung gestellt wurde, und die Quadratur des Rasters auf dem Mikroskoptisch.
   3. Bringen Sie das Gitter in den Fokus.
   4. Verdrängen, aber nicht entfernen, den dichroitischen Gehäuse Kamera 1 (Bypass-Kamera) auszurichten. Zeigen Sie das Netz ohne Binning und ohne Autoskalierung. Stellen Sie das Bild mit dem Scharfstellknopf auf C-Mount-Anschluss ein.
   5. Schieben Sie das Gehäuse in die dichroitischen Dual channel Fassungseinrichtung vollständig, so dass das Bild durch den dichroitischen beiden Kameras aufgeteilt.
   6. Lösen Sie die drei 5/64 "Stellschrauben drehen und die zweite Kamera auf der weiblichen C-Mount-2, bis die Ausrichtung des Rasters ist in beiden Bildern identisch. Mit der Fokus-Einstellung Wahl auf C-Mount-Anschluss 2, bringen das Bild von der Kamera 2 in den Fokus.
   7. Schließen Sie die Ausrichtung mit dem kombinierten Bild in der zusammengeführten Arbeitsbereich der Bildbearbeitungssoftware. Dies erlaubt es, eine Echtzeit-Pseudoüberlagerung der beiden Bilder des Kalibrierungsgitter sehen. Anpassen der Bildpositionen kombiniert mit nur einem R / L-Knopf auf der rechten Seite des DC2. Stellen Sie diesen Regler, bis rechts / links vertikale Begrenzung der Bilder wird präzise ausgerichtet.
   8. Verwenden Sie die U / D-Regler, um den Auf / Ab-Ausrichtung des zweiten Bildes anpassen, bis die horizontalen Gitterstäbe richtig ausgerichtet sind.
   9. Wenn während der Auf / Ab-Ausrichtung eine leichte Drehung der Kamera auftritt, dieses Problem zu korrigieren, indem Sie die drei 5/64 "Zoll Eindrehenws zur Kamera 2 und zu drehen, bis das angezeigte Bild richtig ausgerichtet ist.

3. Herstellung von Krebszellen für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhäsionsassay

1. Kultur BT-20-Brustkrebszellen in Minimum Essential Medium (MEM) ergänzt Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C und 5,0% CO _2, wie zuvor beschrieben ² abzuschließen.
2. Ernte Krebszellen mit einer verdünnten Trypsin-Behandlung und zählen Zellen mit einer Zählkammer.
3. Wasch und Zellen zu suspendieren 10 ⁷ Zellen / ml in 0,1% Albumin aus Rinderserum (BSA) in DPBS mit Calcium und Magnesium (DPBS +).
4. Verdünnte primäre Antikörper, gereinigtes Maus-anti-Mensch-CD24 und gereinigte Ratten HECA-452 (Anti-sialofucosylated Antigene), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Zellen inkubieren 30 min ^{9, 10.}
5. Centrifuge Zellen bei 1.200 min um ein Zellpellet zu erhalten. AspiRate primärer Antikörper, und waschen die Zellen zweimal mit 0,1% BSA DBPs +.
6. Verdünnte sekundäre Antikörper, Ziegen-Anti-Maus-IgG AlexaFluor 568 (Emissions max, 603 nm) und Ziege-anti-Ratte-IgM AlexaFluor 488 (Emissions max, 519 nm), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Inkubieren Zellen für 30 min.
7. Waschen der Zellen zweimal auszusetzen 0,1% BSA in DPBS + 10 ⁶ Zellen / ml in 0,1% BSA-DPBS +.

4. Herstellung von Reaktiv Substrat für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhesion Assay

1. Verbindung von zwei getrennten Rohrlängen zu den Einlass-und Auslassöffnungen der Parallelplattenflusskammer, die innerhalb eines 35-mm-Gewebekulturschale passt. Ein Rohr wird in das Reservoir der markierten Zellen in 0,1% BSA-DPBS + und das andere an der Spritzenpumpe, die Flüssigkeit bei einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit zurückzuziehen ausgesetzt verbinden.
2. Schließen Sie eine Vakuumleitung zur Strömungskammer ^ein.
3. Die Flusskammer Position über der 35 mm-Gewebekultur dish, das eine Monoschicht aus Ovarzellen des chinesischen Hamsters E-Selectin (CHO-E) exprimieren. CHO-E-Zellen wurden in MEM-Komplettmedium bei 37 ° C gezüchtet und 5,0% CO _{² 2.}
4. Die Durchflusskammer und / oder Strömungskammer Dichtung einen angemessenen Vakuumdichtung ¹ zu gewährleisten.
5. Ziehen Flüssigkeit aus dem Behälter, die Überwachung der Durchflusskammer-Anordnung für die richtige Dichtung und ohne sichtbare Anzeichen von Luftblasenbildung ^ein.
6. Zeigen Flusskammer Montage auf Mikroskop (Leica DMI 6000B) ^ein.

5. Zwei-Farben-Bildaufnahme

1. Strom ein Leica EL-6000 kompakte Lichtquelle, oder ein ähnliches Gerät, um Licht mit hoher Intensität und Paar es in einen Lichtleiter zu erzeugen. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, dieses Licht durch eine Kombination Filterwürfel, dh G / R (grün / rot) Filterwürfel passieren, um Fluorophore einer gewünschten Farbe / Intensität zu erregen.
2. Stellen Sie sicher, dichroitischen Gehäuse ist in der richtigen Arbeitsposition (depressiv) undnicht in den Bypass-Modus.
3. Betreiben Sie in der Fluoreszenz-Mikroskop-Modus und wählen Sie das richtige Fluoreszenzfilterwürfel (grün / rot).
4. Bestimmen Sie die Belichtungszeit und Gain-Kamera 1 (rot, 620 ± 60 nm) und die Kamera 2 (grün, 535 ± 40 nm).
   1. Drücken Sie den dichroitischen um Bilder sowohl in den roten und grünen Emissions Kanäle zu erhalten. Verwenden Sie eine Durchflusskammer-Assays mit Zellen nur mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert und erhalten ein Bild in den roten Kanal, indem die Belichtungszeit der Kamera 1 in "Live-Einstellungen" der Imaging-Software.
   2. Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera 2 auf die Belichtungszeit der Kamera ein. Wenn ein Bild in den grünen Kanal beobachtet, vorliegen Durchbluten Artefakte und die Belichtungszeit in beiden Kameras verringert werden muss.
   3. Halten der Belichtungszeitwert in der Kamera 1 und Kamera 2, die Belichtungszeit zu verringern, bis das Durchbluten Artefakt nicht mehr im grünen Kanal sichtbar. Stellen Sie die Verstärkung der Kamera ein Bild zu verbessern visibility im roten Kanal, falls erforderlich.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.1 - 5.4.3 mit Zellen nur mit dem grünen Fluorophor markiert, aber definieren Belichtungszeit mit der Kamera 2 Bildzellen im grünen Kanal ohne Durchbluten Artefakte im roten Kanal von Kamera 1 gesammelt.
   5. Retitrate Antikörper, wenn Durchbluten Artefakte nicht beseitigt werden ^11, oder wenn Belichtungszeiten von Kamera 1 und Kamera 2 wesentlich sind solche, die zusammengeführt Bilder können zeitlich falsch ausgerichtet sein.
5. Verwenden Imaging-Software, um Bilder gleichzeitig von zwei monochrome CCD-Kameras in der Flusskammer Experiment gefangen zu sehen.
6. Merge Bilder von beiden Kameras mit dem SimulPix Modul StreamPix 5 oder eine alternative Software-Paket gesammelt.
7. Verwenden digitalen Korrekturanpassungen in SimulPix oder alternative Software, um räumlich richten Sie die zusammengeführten Bilder, falls erforderlich. Bilder können mit dem Modul SimulPix für horizontale, vertikale korrigiert werdenUnd Dreheinstellungen.

Ergebnisse

Eine Parallelplattenlaufkammer Haftung Assay wurde verwendet, um eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, die gleichzeitig in zwei Emissionskanäle erfasst Echtzeit-Bildsequenzen (Abbildung 1) zu demonstrieren. Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem erkannt BT-20-Zellen, die mit Fluoreszenz-Anti-Human-CD24 und HECA-452 (Erkennung sialofucosylated Antigene) monoklonale Antikörper und entsprechenden Sekundärantikörper (Abbildung 2) markiert waren. Einige Roll Zellen angezeigt rote Signale ...

Diskussion

Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem hat die räumliche, zeitliche und optische Auflösung benötigt, um qualitativ hochwertige Bilder in Anwendungen, bei denen Zell-oder Molekularbewegung schnell ist zu erfassen. Bei der Erzeugung der repräsentative Ergebnisse, Parameter in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, einschließlich Software-Einstellungen und Kameraeinstellungen wurden optimiert, um eine zusammengeführte Bildfolge, in der Walz-und adhärenten Zellen waren zeitlich und räumlich ausgerichtet zu erhalten. Di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix