In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Zusammenfassung

Neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf eine mukosasale bakterielle Infektion trägt zu Epithelverletzungen und klinischen Erkrankungen bei. Es wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, das Erreger, menschliche Neutrophile und polarisierte menschliche Epithelzellschichten kombiniert, die auf Transwell-Filtern angebaut werden, um Untersuchungen zur Entwirrung der molekularen Mechanismen zu erleichtern, die dieses Phänomen orchestrieren.

Zusammenfassung

Schleimhautoberflächen dienen als Schutzbarrieren gegen pathogene Organismen. Angeborene Immunantworten werden bei der Erfassung von Krankheitserregern aktiviert, die zur Infiltration von Geweben mit wandernden Entzündungszellen führen, in erster Linie Neutrophilen. Dieser Prozess hat das Potenzial, gewebezerstörend zu sein, wenn er übermäßig ist oder in einem ungelösten Zustand gehalten wird.  Cokultivierte In-vitro-Modelle können verwendet werden, um die einzigartigen molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an pathogenerinduzierter neutrophiler transepitheliale Migration beteiligt sind. Diese Art von Modell bietet Vielseitigkeit im experimentellen Design mit der Möglichkeit für die kontrollierte Manipulation des Erregers, Epithelbarriere, oder Neutrophil. Die pathogene Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter Epithelmonolayer, die auf durchlässigen Transwellfiltern angebaut werden, löst physiologisch relevante basolaterale zu apikale transepitheliale Migration von Neutrophilen aus, die auf die basolaterale Oberfläche aufgetragen werden. Das hier beschriebene In-vitro-Modell zeigt die verschiedenen Schritte, die zum Nachweis der neutrophilen Migration über eine polarisierte Lungenepithelmonoschicht erforderlich sind, die mit der pathogenen P. aeruginosa (PAO1) infiziert ist. Die Aussaat und Kultivierung durchlässiger Transwells mit menschlichen Lungenepithelzellen wird beschrieben, zusammen mit der Isolierung von Neutrophilen aus ganzem menschlichen Blut und der Kultivierung von PAO1 und nichtpathogenem K12 E. coli (MC1000).  Der Emigrationsprozess und die quantitative Analyse erfolgreich migrierter Neutrophilen, die als Reaktion auf pathogene Infektionen mobilisiert wurden, werden mit repräsentativen Daten, einschließlich positiver und negativer Kontrollen, dargestellt. Dieses In-vitro-Modellsystem kann manipuliert und auf andere Schleimhautoberflächen aufgebracht werden. Entzündungsreaktionen, die eine übermäßige neutrophile Infiltration beinhalten, können zerstörerisch für Wirtsgewebe sein und können ohne pathogene Infektionen auftreten. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, die die neutrophile transepitheliale Migration durch experimentelle Manipulation des hier beschriebenen In-vitro-Kokultur-Assay-Systems fördern, hat ein erhebliches Potenzial, neue therapeutische Ziele für eine Reihe von mukosalen infektiösen sowie entzündlichen Erkrankungen zu identifizieren.

Einleitung

Schleimhautoberflächen dienen als physikalische und immunologische Barrieren, die Schutz vor äußeren Bedrohungen bieten, die in der Umwelt allgegenwärtig sind^1,2. Diese schützende Epithelbarriere kann beeinträchtigt werden, wenn pathogene Organismen in²eindringen. Im Falle eines bakteriellen Erregers löst diese Begegnung oft einen entzündlichen Prozess aus, indem sie das angeborene Immunsystem aktiviert und eine schnelle Mobilisierung von First Responder-Granulozyten, bekannt als Neutrophile^2-4,auslöst. Chemotaktische Wirkstoffe, die die Neutrophilenrekrutierung erleichtern, werden zum Teil von den Mukosalepithelzellen produziert, die versuchen, den Wirt von dem beleidigenden Erreger^2-4zu befreien. Übermäßige oder ungelöste neutrophile Infiltration der Schleimhautepitheloberfläche kann eine signifikante Pathologie verursachen^1,5. Dies ist eine Folge von unspezifischen Gewebeschäden, die durch das antibakterielle Neutrophilenarsenal^5-7verursacht werden. In solchen Fällen wird die bakterielle Clearance-Kapazität von Neutrophilen durch die Zerstörung des Wirtsgewebes während einer infektiösen Beleidigung überschattet.  Eine Störung der funktionalen Epithelbarriere kann zu einer verstärkten Exposition des darunter liegenden Gewebes gegenüber Mikroorganismen und/oder Toxinen führen und die Krankheitspathologie weiter verschlimmeren^8,9. Diese Folgen können in mehreren Organsystemen einschließlich der Lunge und des Verdauungstraktes beobachtet werden^1,5. Darüber hinaus sind nichtinfektiöse entzündliche Erkrankungen wie schwere Asthmaanfälle, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), akutes Atemnotsyndrom (ARDS) und entzündliche Darmerkrankungen (IBD) durch den pathologischen Bruch der Schleimhautepithelbarriere durch eine übermäßige neutrophile Reaktion^4,5,10-12gekennzeichnet.

Der komplexe Prozess der Neutrophilenrekrutierung nach einer Schleimhautinfektion umfasst mehrere abgeschottete Schritte^1,5,13,14. Zunächst müssen Neutrophile über eine Reihe von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen, die die transendotheliale Migration erleichtern, aus dem Kreislauf abweichen^1,13. Neutrophile navigieren als nächstes durch den vorhandenen interstitiellen Raum, der die extrazelluläre Matrix^1,14enthält. Um das Lumen der infizierten Schleimhaut zu erreichen, müssen Neutrophile dann über die Epithelbarriere^1,4,5wandern. Dieses komplizierte multistep Phänomen wird oft aggregiert mit in vivo Tiermodelle der Infektion¹⁵untersucht. Solche Modelle sind nützlich, um die Notwendigkeit spezifischer Faktoren wie Chemokine, Adhäsionsmoleküle oder Signalwege zu ermitteln, die am Gesamtprozess beteiligt sind, aber weitgehend unzureichend sind, um molekulare Beiträge zu lösen, die für jeden einzelnen unterteilten Schritt kritisch sind¹⁶. Cokultivierte In-vitro-Systeme, die trans-endotheliale, transmatrix- oder transepitheliale Migration von Neutrophilen modellieren, waren in dieser Hinsicht besonders nützlich^1,14,16,17.

Ein robustes Cokultur-Assay-System wurde entwickelt, um Mechanismen zu entschlüsseln, die für die neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf pathogene Infektionen verantwortlich sind^18-22. Dieses Modell beinhaltet die Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter menschlicher Epithelzellschichten mit einem bakteriellen Erreger, gefolgt von der Anwendung frisch isolierter menschlicher Neutrophile auf die basolaterale Oberfläche^18-22. Neutrophile wandern über die Epithelbarriere als Reaktion auf epitheliale chemotaktische Produkte, die nach pathogener Infektion^18,21-23sezerniert wurden. Dieses Modellsystem wurde mit Darm- und Lungenepithelkulturen eingesetzt, die geeigneten gewebespezifischen bakteriellen Krankheitserregern ausgesetzt sind, und hat neuartige molekulare Mechanismen enthüllt, die für den Neutrophilenrekrutierungsprozess während einer Schleimhautinfektion wichtig sind^3,8,19,24-28. Die Stärke dieses In-vitro-Kokulturmodells besteht darin, dass ein reduktionistischer Ansatz es dem Forscher ermöglicht, den Erreger, die Epithelbarriere und/oder neutrophile in einem gut kontrollierten, hochreproduzierbaren, ziemlich preiswerten System experimentell zu manipulieren. Die aus diesem Ansatz gewonnenen Erkenntnisse können effektiv genutzt werden, um eine fokussierte Analyse von kompartumlierten Ereignissen während der Neutrophilenrekrutierung mit In-vivo-Infektionsmodellen ^22,29,30durchzuführen.

Dieser Artikel zeigt die verschiedenen Schritte, die für die erfolgreiche Etablierung dieses reproduzierbaren Modells erforderlich sind, um pathogene induzierte neutrophile transepitheliale Migration zu erforschen. Lungenepithelbarrieren, die mit dem Erreger Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, sind in diesem Artikel enthalten; andere Gewebeepithelien und Krankheitserreger können jedoch durch geringfügige Modifikationen ersetzt werden. Die Aussaat und Kultivierung polarisierter Lungenepithelzellschichten auf invertierten kollagenbeschichteten durchlässigen Transwellfiltern wird hierin detailliert beschrieben, ebenso wie das Wachstum der pathogenen P. aeruginosa und die Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut. Wie diese Komponenten kombiniert werden, um pathogeninduzierte neutrophile transepitheliale Migration zu beobachten, wird zusammen mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen vorgestellt, um einen reproduzierbaren Assay zu etablieren. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes zur Untersuchung verschiedener Aspekte der pathogenen induzierten neutrophilen transepitheliale Migration wird unter Bezugnahme auf spezifische Studien in der Literatur diskutiert.

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Protokoll

Die Schritte (1-3) sollten in einer sterilen Umgebung unter einer laminaren Durchflusshaube durchgeführt werden.

1. Kollagenbeschichtung Transwells

1. Machen Sie eine 30 g/ml Kollagenlösung. Verdünnen Sie 3 mg/ml Kollagenbestand 1:100 in 60% Ethanol, das durch eine 0,2 m Filtereinheit geleitet wurde.
2. Vortex verdünnt 30 g/ml Lösung. Hinweis: Es ist nicht notwendig, die 3 mg/ml Kollagen-Stammlösung zu wirbeln, da diese Lösung recht zähflüssig ist und Luftblasen eingeführt werden können, was die Genauigkeit beim Pipetieren verringern kann.
3. Entfernen Sie 0,33 cm² Wachstumsflächenmitwinde mit einer Porengröße von 3 m von außen und legen Sie die 24-Well-Platte mit 12 Transwells kopfüber in die Haube.
4. Bodenplatte abheben und beiseite stellen. Hinweis: Transwells ruhen nun auf dem Deckel der 24-Well-Platte
5. Bunsenbrenner einschalten. Flamme Hämostat für Sterilität und abkühlen lassen.
6. Mit sterilem Hämostat Transwells auf eine 150 mm x 25 mm Petrischale übertragen und in umgekehrter Position halten. Hinweis: Achten Sie darauf, die Sterilität der leeren 24-Well-Platte plus Deckel zu erhalten, um Transwells zu beherbergen, sobald sie mit Epithelzellen gesät wurden.
7. Pipette 70 l der 30-g/ml-Kollagenlösung auf die Filtermembran jedes invertierten Transwells. Hinweis: Die Oberflächenspannung sollte dieses Lösungsvolumen an Ort und Stelle halten, da es keine Wände um die Filtermembran herum gibt, wenn sie auf die Oberfläche der Unterseite zugreifen. Achten Sie darauf, dass die Kollagenlösung nicht die Seite des Transwells heruntertropft und vermeiden Sie, sich während des Beschichtungsvorgangs zu bewegen.
8. Lassen Sie den Deckel der Petrischale für mindestens 4 Stunden ab, damit die Ethanollösung verdampfen kann. Um die Sterilität während dieses Prozesses aufrechtzuerhalten, halten Sie den Kapuzenlüfter und das ultraviolette Licht an.
9. Nachdem die Transwells getrocknet sind, können sie sofort verwendet oder bei Raumtemperatur bis zu einer Woche gelagert werden, sofern die Petrischalenabdeckung vorhanden ist und die Sterilität erhalten bleibt.

2. Durchgangsflasche von Epithelzellen zum Aussaat von Transwells

(Dieses Protokoll beschreibt speziell den Umgang mit der Lungenepithelzelllinie H292 zur Erzeugung von Epithelbarrieren, die auf Transwells angebaut werden. Andere Epithelzelllinien können mit leichten Modifikationen verwendet werden.)

1. Bereiten Sie Kulturmedium durch Zugabe von 10% hitzeinaktiviertem Fetal Bovine Serum (HI-FBS) und 1x Penicillin/Streptomycin zu RPMI 1640 vor.
2. Warmmedien, Trypsin-EDTA (T-EDTA) und D-PBS im 37 oC Wasserbad.
3. Entfernen Sie den T-75-Kolben, der Zellen enthält, aus dem Inkubator und bewerten Sie den Zusammenfluss visuell mit dem invertierten Mikroskop. Hinweis: Bei Verwendung von H292-Zellen sollten Die Kolben nahe oder vollständig konfluent sein.
4. Aspirieren Sie Medien aus dem Kolben. Reduzieren Sie die Zeit, die Zellen trocken sind, indem Sie die nächste Lösung in der Kapuze mit gelockerter Kappe haben.
5. 5 ml D-PBS zu T-75 Kolben geben und wirbeln. Vermeiden Sie blasen. Entfernen Sie PBS nach Aspiration.
6. Fügen Sie 3 ml T-EDTA auf T-75 Kolben und Wirbel, um unten zu decken.
7. Entfernen Sie den größten Teil von T-EDTA, so dass ca. 0,3 ml in T-75 Kolben.
8. Verteilen Sie das kleine Restvolumen von T-EDTA über die Oberfläche der Zellen und legen Sie es unter Standardkulturbedingungen in einen befeuchteten Inkubator (37 oC, 5%_CO2).
9. Nach einer gewissen Zeit, entfernen Sie Kolben aus dem Inkubator. Hinweis: Zellen sollten sich leicht von der Oberfläche des Kolbens lösen, indem sie sanft auf den Kolben auf seiner Seite tippen. Zellen sollten nun gerundet und schwebend sein, wenn sie unter dem Mikroskop visualisiert werden. Die durchschnittliche Zeit, die dies für H292-Zellen dauern wird, beträgt 5-10 min.
10. Fügen Sie 10 ml Kulturmedien in den Kolben ein, um T-EDTA zu neutralisieren und Zellen wieder auszusetzen. Zeichnen Sie die Zelllösung in die Pipettenspitze und werfen Sie sie etwa fünfmal auf die Oberfläche von Kolben, die Zellen enthalten, um alle Zellen wieder auszusetzen.
11. Übertragen Sie resuspendierte Zellen in ein 15 ml-Röhrchen zur Aussaat von Transwells. Hinweis: Die Konzentration der auf diese Weise hergestellten resuspendierten H292-Zellen sollte zwischen etwa 1 x 10⁶-1,8 x 10⁶ Zellen/ml liegen.

3. Saat Kollagen beschichtete Transwells mit Epithelzellen

1. Fügen Sie jedem invertierten kollagenbeschichteten Transwell 70 l resuspendierte Zelllösung aus dem 15 ml-Röhrchen hinzu. Hinweis: H292-Zelllösungen mit einem Konzentrationsbereich zwischen 1 x 10⁶-1,8 x 10⁶ Zellen/ml ergeben ca. 70.000-120.000 Zellen/Transwell.
2. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das Rohr regelmäßig sanft invertieren, um zu verhindern, dass sich die Zellen während der Aussaat der Transwells an den Boden des 15 ml-Rohrs absetzen. Hinweis: Wirbelzellen nicht vorstoßen und vorsichtig sein, dass die Pipettespitze nicht in direkten Kontakt mit kollagenbeschichtetem Membranfilter kommt.
3. Sobald alle invertierten Transwells mit Epithelzellen ausgesät sind, ersetzen Sie die Petrischalenabdeckung und legen Sie sie vorsichtig in den Inkubator der Gewebekultur, befeuchtet, 37 oC, 5%_CO2. Achten Sie darauf, die Zellsuspension, die der kollagenbeschichteten Filtermembran zugesetzt wurde, nicht zu stören.
4. Bewahren Sie invertierte Transwells im Gewebekultur-Inkubator auf, befeuchtet, 37 oC, 5%_CO2 über Nacht. Hinweis: Die Blase von flüssigkeitshaltigen Zellen sollte während der nächtlichen Inkubation mit der durchlässigen Filtermembran des Transwells assoziiert bleiben. Wenn die Filtermembran durch Verdunstung von Flüssigkeit trocken wird oder weil die Flüssigkeit auf der Seite der Transwells tropft, können die Epithelschichten nicht richtig wachsen.
5. Am nächsten Tag 1 ml Medien in die ursprüngliche sterile 24-Well-Platte geben und jeden invertierten Transwell mit einem sterilisierten Hämostat in jeden Brunnen kippen, der 1 ml Medien enthält.
6. 0,2 ml Medien in die obere Kammer jedes Transwells geben und zum Gewebekultur-Inkubator zurückkehren, befeuchtet, 37   oC, 5%_CO2.
7. H292 invertierte Transwells können von 8 Tagen bis zu 1 Monat nach der Aussaat verwendet werden. Hinweis: Wir empfehlen, mindestens 8 Tage nach der Aussaat von Transwells zu warten, um sicherzustellen, dass die Epithelmonolayer vollständig gebildet sind und eine funktionelle Barriere aufweisen. Man kann die Epithelbarriere H292 testen, indem man bestimmt, ob die Monoschicht in der Lage ist, den transepitheliaalen Fluss des Proteins Meerrettichperoxidase (HRP) nach Zugabe der basolateralen Oberfläche¹⁸zu begrenzen.

4. Vorbereitung von Bakterien zur Infektion von Epithelschichten auf Transwells

1. Einen Tag vor dem Experiment eine Kolonie von P. aeruginosa PAO1 aus einer Pseudomonas Isolation Agar Platte und eine Kolonie von K12 E. coli MC1000 aus einer Luria-Bertani (LB) Agar-Platte extrahieren und in separate Röhrchen mit 3 ml LB-Brühe geben. VORSICHT: P. aeruginosa ist ein menschlicher Erreger, beim Umgang mit diesem Organismus sollten standardmäßige BSL2-Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden.
2. Schütteln Sie über Nacht bei 225 Rpm in einer 37 oC Umgebung.
3. Am nächsten Tag 1 ml aus den dichten Bakterienkulturen entfernen und in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen geben.
4. Drehen Sie in Derichtis bei 15.800 x g für 5 min und entfernen Sie dann Überstand.
5. Bereiten Sie Hanks' Balanced Salt Solution mit Kalzium und Magnesium (HBSS+) im Voraus vor. 23,8 g HEPES und 97,5 g HBSS+ Pulver zu 9,5 l destilliertem Wasser geben. Fügen Sie kleine Mengen von 10 M NaOH zur Lösung hinzu, während Sie den pH-Wert überwachen, bis ein stabiler pH-Wert von 7,4 erreicht ist. Volumen bis zu 10 L bringen und bei 4 oC lagern.
6. Setzen Sie jedes bakterielle Pellet mit 1 ml HBSS+ wieder auf. Vortex, um sicher zu sein, dass eine gleichmäßige bakterielle Suspension erreicht wird.
7. Drehen Sie wieder bei 15.800 x g für 5 min und entfernen Sie Überstand.
8. Setzen Sie das PAO1-Pellet mit 0,6 ml HBSS+ und das MC1000-Pellet mit 0,5 ml HBSS+ wieder auf. Wirbel die bakteriellen Suspensionen.
9. Die REsuspendedpellets PAO1 und MC1000 1:100 in HBSS+ weiter verdünnen. Fügen Sie z. B. 50 l des 0,6 ml PAO1-Resuspendedpellets zu 5 ml HBSS+ hinzu. Anmerkung: Mit Hilfe von optischen Dichtemessungen (OD) zur Bestimmung der Kulturdichte sowie der Standard-Verdünnungsbeschichtungsmethodik der Kolonieformeinheit (CFU) ergeben PAO1- und MC1000-Lösungen, die auf diese Weise hergestellt werden, konstant zwischen 3 x 10⁷-6 x 10⁷ KBE/ml. Die Dichte einer Bakterienkultur ist positiv korreliert mit der OD-Messung der Kultur bei 600 nm und diese Korrelation kann verwendet werden, um die Bakterielle Zellkonzentration abzuschätzen. Um die Bakterielle Zellkonzentration zu bestätigen, kann die Kultur auf eine sehr niedrige geschätzte Konzentration verdünnt und auf einer Agarplatte so plattiert werden, dass man erwarten würde, dass zwischen 30-200 Bakterienzellen auf der Platte vorhanden sind. Die Zellen werden über die Platte verteilt und über Nacht bei 37 oC inkubiert, so dass jede Zelle eine einzelne Zellkolonie bildet, die groß genug ist, um sichtbar zu sein, und Kolonien dann gezählt werden können.

5. Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut

1. Die Säurecitrat-Dextrose-Lösung (ACD) wird als Antikoagulans verwendet und unter Zugabe von 6,9 g Zitronensäure, 12,5 g Natriumcitrat und 10 g Dextrose zu 500 ml destilliertem Wasser hergestellt. Sobald alle Komponenten gelöst sind, wird die ACD-Lösung durch eine 0,2 m-Filtereinheit sterilisiert. ACD-Lösung bei 4 oC speichern.
2. Vor dem Blutziehen 5 ml ACD zu 50 ml Spritze geben und 21 x 3/4 G Schmetterlingsnadel mit 12 Inden befestigen.
3. Tourniquet auftragen, Vene mit Alkohol abwischen und Nadel einsetzen. Hinweis: Jedes Forschungsprotokoll, an dem Menschen beteiligt sind, muss von einem institutionellen Prüfungsausschuss genehmigt werden, und jeder Blutspender muss schriftlich in Kenntnis der Sachlage einzusprechen sein. Beispielsweise wurden Experimente, die mit diesem Protokoll durchgeführt wurden, vom Massachusetts General Hospital Institutional Review Board genehmigt und dem Protokoll #1999-P-007782 zugewiesen.
4. Ziehen Sie langsam 45 ml Blut, um sicherzustellen, dass sich das Blut einmal in der Spritze mit ACD mischt.
5. Wenn 45 ml gezogen wurden (50 ml Gesamtvolumen), das Tourniquet vor dem Entfernen der Nadel aufbinden. Sofort Druck auf die Wunde mit steriler Gaze ausüben, wenn die Nadel entfernt wird.
6. Blut langsam über ca. 5-10 Sek. an der Seite einer 50 ml Tube absenken.
7. Drehen Sie in zentrifuge bei 1.000 x g mit der Bremse für 20 min bei Raumtemperatur deaktiviert. Hinweis: Ein zusätzlicher Schritt mit Verdünnung von Vollblut in PBS- und sorgfältiger Überlagerung von verdünntem Blut auf Ficoll-Paque vor der Zentrifugation kann eingesetzt werden, um ein etwas höheres Maß an Neutrophilenreinheit zu erreichen, indem das buffy Fell effizienter von den Granulozyten⁸getrennt wird. Das Weglassen dieses Schritts dient dazu, Zeit zu sparen, ohne die Ausbeute oder Reinheit für die Zwecke dieses Assays drastisch zu beeinträchtigen, und daher bevorzugen wir es, die Blutüberlagerung nicht auf Ficoll-Paque-Schritt einzuschließen.
8. Während das Blut sich dreht, fügen Sie sehr langsam 1 g Gelatine in 50 ml erhitzte Hanks' Balanced Salt Solution ohne Kalzium und Magnesium (HBSS(-)) ein, um 2% Gelatinelösung vorzubereiten. Halten Sie die Lösung bei 37 oC.
9. Mit einer mit Sigmacote behandelten Glaspipettenspitze wird Plasma aus der 50 ml-Röhre des Blutes angesaugt und entsorgt.
10. Weitere Aspirate sehr sorgfältig, um das buffy Mantel zu entfernen, die weiße Blutkörperchen enthält, einschließlich Lymphozyten.
11. Wenn das buffy Fell langsam entfernt wird, verschwindet das weißlich-gelbe trübe Material über der Roten Blutkörperchen(RBC)-Schicht. Beenden Sie die Aspiration, sobald buffy Mantel entfernt wird und RBC-Schicht kann klar visualisiert werden, wenn sie von oben über der Röhre betrachten.
12. Versuchen Sie nicht, die RBC-Schicht zu stören, da Granulozyten, meist Neutrophile, in der Nähe der Oberfläche der RBC-Schicht sind, aber nicht sichtbar sind.
13. Zu einem Volumen von 15 ml RBC-Schicht 30 ml warme 2% Gelatinelösung (2x Volumen der RBC-Schicht) hinzufügen.
14. Invertieren Rohr sanft zu mischen, unter Vorsicht, um die Bildung von Blasen zu minimieren.
15. Inkubieren bei 37   oC für 25 min. Hinweis: RBCs sollten sich aggregieren und sich am boden niederlassen. Als Alternative zur Gelatine kann große Molekulargewichts-Dextrans eingesetzt werden, um RBCs⁸zu sedimentieren.
16. Nach der Inkubation, übertragen Deckschicht Licht rötliche Lösung, die Granulozyten in einem neuen 50 ml Rohr mit Pipette enthält, achten Sie darauf, nicht die besiedelte dunkle RBC-Schicht während der Übertragung stören. Nach dem Trennen dunkle RBC-Layer verwerfen.
17. Spin übertragene lichtrötliche Lösung mit Granulozyten und einige RBCs in Zentrifuge bei 1.000 x g mit Bremse für 10 min bei Raumtemperatur aktiviert, um Zell zu pellet.
18. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab oder aspirieren Sie ihn, da das rötliche Zellpellet, das sich nach der Zentrifugation bildet, in der Regel lose ist.
19. RBC-Lysepuffer im Voraus vorbereiten und bei 4 oC speichern, indem man 8,29 g Ammoniumchlorid (NH₄Cl), 1 g Natriumbicarbonat (NaHCO₃) und 0,038 g EDTA zu 1 L destilliertem Wasser in einem Becher glasiert. RBC-Lysepuffer bei 4 oC speichern.
20. Rötliches Zellpellet mit einem kleinen Volumen kalten RBC-Lysepuffers auflösen und auflösen. Sobald das Zellpellet in Lösung ist, füllen Sie das Rohr auf 50 ml mit RBC-Lysepuffer. Hinweis: An diesem Punkt und vorwärts, halten Sie die Zellen auf Eis oder bei 4 oC.
21. Drehen Sie in zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4   oC und gießen Sie dann aus oder aspirieren Sie den Überstand. Hinweis: Der Überstand wird etwas rötlich sein, der lysierte RBCs enthält. Das Pellet sollte an dieser Stelle gelblich weiß sein. Wenn signifikante RBCs im Pellet verbleiben, wie durch ein rötliches Pellet angegeben, kann Schritt 5.20-5.21 wiederholt werden. Signifikante RBCs verbleiben im Zellpellet, wenn das rötliche Pellet aus Schritt 5.20 nicht ausreichend aufgebrochen ist.
22. Weißliches Pellet mit einem kleinen HBSS(-)-Volumen auflösen und aufbrechen und dann mit HBSS(-) auf 50 ml füllen. Hinweis: HBSS(-) und nicht HBSS+ sollte verwendet werden, um das weißliche Zellpellet wieder auszusetzen. HBSS(-) fehlt Kalzium und Magnesium.
23. Drehen Sie wieder in Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4   oC.
24. Überstand abgießen und das Pellet auf ein Endvolumen von 1 ml HBSS(-) aussetzen.
25. In einem 1,5 ml Eppendorf-Rohr 5 l der 1 ml Zellsuspension zu 250 l HBSS(-) geben und mit einer Pipette sanft nach oben und unten mischen.
26. Fügen Sie 25 l verdünnte Zellsuspension zu 25 l 0,4% Trypan blau hinzu.
27. Fügen Sie auf jeder Seite eines Standardhämozytometers 12 l Gemisch hinzu.
28. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen, die den Trypan-Blaufarbstoff ausgeschlossen haben und sich im mittleren Quadrat beider Seiten des Hämozytometers befinden.
29. Um die Zellkonzentration zu berechnen, multiplizieren Sie den Durchschnitt der 2 Quadrate mit 100 (Dilutionalfaktor) und multiplizieren Sie dann mit 10^4, um die Anzahl der Zellen/ml zu geben.
30. Stellen Sie die Endkonzentration auf 5 x 10⁷ Zellen/ml ein. Wenn sie größer als 5 x 10⁷ Zellen/ml sind, stellen Sie dies durch Hinzufügen von HBSS(-) ein. Wenn weniger, pellet die Zellen und resuspendieren auf entsprechendes Volumen.
31. Halten Sie Zellen auf Eis, bis sie für den Migrationstest bereit sind. Hinweis: Diese Zellen stellen die Granulozytenpopulation weißer Blutkörperchen dar. Die Mehrheit der Granulozyten, die aus dem ganzen menschlichen Blut isoliert sind, sind Neutrophile. Zellen werden in HBSS(-) bis zur Migration auf Eis gehalten, um Zellen in einem Ruhezustand zu halten.

6. Vorbereitung von Epithelzellschichten für den Migrationstest

(DieseSchritte müssen nicht innerhalb einer sterilen Kapuze durchgeführt werden.)

1. Entfernen Sie aus inkubator 24-Well-Platte unterstützen den Epithelschichten, die auf der Unterseite der Transwell-Filtermembranen für mindestens acht Tage kultiviert wurden.
2. Greifen Sie den Rand jedes Transwells mit einem Hämostat, heben Sie aus der 24-Well-Platte und kehren Sie den Transwell über einen Abfalleimer um, um Kulturmedien aus der inneren Kammer des Transwells zu entsorgen. Tauchen Sie jeden Transwell in einen Waschbecher mit HBSS+, um die Innere Kammer des Transwells mit HBSS+ zu füllen. Entsorgen Sie Flüssigkeit aus der Innenkammer in einen Abfalleimer.
3. Wiederholen Sie Schritt 6.2 für eine zweite Wäsche in HBSS+. Nach zwei Waschungen transwells in eine neue 24-Well-Platte mit 1 ml HBSS+ in jedem Brunnen geben. Hinweis: Alle Wässer sollten mit HBSS+ durchgeführt werden, das auf 37 oC erwärmt wird.
4. Beobachten Sie die obere Kammer jedes Transwells, um die Epithelzellschichtintegrität zu bewerten. Hinweis: HBSS+ sollte nicht in die obere Kammer des Transwells eindringen und diese füllen, wenn sie in den Brunnen einer 24-Well-Platte mit 1 ml HBSS+ gelegt wird.
5. Nach sorgfältiger Beobachtung jedes Transwells 0,2 ml HBSS+ in die obere Kammer geben.
6. In den Inkubator bei 37   oC, 5%_CO2 in eine befeuchtete Kammer für 30-60 min geben, um Epithelzellschichten auszulagern.

7. Neutrophiltransepitheliale Migration Assay

1. Entfernen Sie aus inkubator 24-Well-Platte von gewaschenen Transwells gleichinlassen in HBSS+.
2. Greifen Sie jeden Transwell mit einem Hämostat und entsorgen Sie Flüssigkeit in der Oberseite gut in einen Abfalleimer.
3. Stellen Sie jeden Transwell auf den Kopf in eine 150 mm x 25 mm Petrischale.
4. Zu sechs der invertierten Transwells 25 l HBSS+ hinzufügen. An drei der invertierten Transwells mit 25 l P. aeruginosa (PAO1) verdünnt in HBSS+ wie in Schritt 4 beschrieben. Zu den letzten drei invertierten Transwells, infizieren Sie mit 25 l E. coli K12 (MC1000) in HBSS+ hergestellt, wie in Schritt 4 beschrieben. Dies ist etwa 0,8 x 10⁶-1,5 x 10⁶ KBE/Epithelschicht für jede Bakterienart, da die Konzentration der in Schritt 4 hergestellten bakteriellen Lösungen ungefähr 3 x 10⁷-6 x 10⁷ KBE/ml beträgt.
5. Inkubieren bei 37   oC, 5%_CO2 in einer befeuchteten Kammer für 60 min.
6. Bereiten Sie fMLP als Positivkontrolle für die Neutrophilenmigration vor, indem Sie 5 l von 10 mM fMLP-Bestand zu 5 ml HBSS+ hinzufügen, was eine 10-M-Lösung ergibt.
7. Waschen Sie Transwells, indem Sie mit einem Hämostat greifen und wieder in eine 24-Well-Waschplatte kippen, die 1 ml HBSS+ in den unteren Kammern enthält. 0,2 ml HBSS+ in die oberen Kammern geben.
8. Mit einem Hämostat bestreichen und von der ersten Waschplatte entfernen. Bevor Sie Transwells in eine zweite 24-Well-Waschplatte mit 1 ml HBSS+ legen, entsorgen Sie Flüssigkeit aus der oberen Kammer in einen Abfalleimer. 0,2 ml HBSS+ in die obere Kammer geben.
9. Wiederholen Sie die Schritte 7.8 noch einmal für insgesamt 3 Wähbe. Hinweis: Alle Transwells sollten dem gleichen Handhabungs- und Waschschema unterzogen werden, unabhängig davon, ob sie mit Bakterien infiziert wurden oder nicht, um sicherzustellen, dass alle transwells, die untersucht werden, auf die gleiche Weise manipuliert wurden. Eine 60-min-Infektion mit PAO1 oder MC1000 verringert weder die Lebensfähigkeit noch verändert sie die Barriereeigenschaften der H292-Monoschicht, wie sie durch einen toxikologischen Assay auf Laktatdehydrogenase- und HRP-Flusstest bzw.^18,22bewertet werden.
10. Bereiten Sie 24-Well-Migrationsplatte vor, indem Sie 1 ml HBSS+ in 12 Brunnen der 24-Well-Platte hinzufügen. Hinweis: Diese Platte kann im Voraus vorbereitet werden.
11. Nach dem dritten Waschen, entsorgen Sie Flüssigkeit aus den oberen Kammern von Transwells in einen Abfalleimer mit einem Hämostat und legen Sie drei der nicht infizierten Transwells in drei Brunnen der 24-Well-Migrationsplatte mit 1 ml HBSS+, die die negative Kontrolle darstellt.
12. Pipette 10 l einer 10-M-Lösung von fMLP in jede der drei Brunnen der 24-Well-Migrationsplatte mit 1 ml HBSS+ (100 nM).
13. Platzieren Sie drei der nicht infizierten Transwells in drei Brunnen der 24-Well-Migrationsplatte mit 100 nM fMLP, was eine positive Kontrolle für die Fähigkeit isolierter Neutrophilen darstellt, zu migrieren.
14. Platzieren Sie drei mit PAO1 infizierte Transwells und drei mit MC1000 infizierte Transwells in jeweils drei Brunnen der 24-Well-Migrationsplatte mit 1 ml HBSS+. Fügen Sie 0,1 ml HBSS+ in die obere Kammer jedes Transwells ein.
15. Zusätzlich zu den 0,1 ml HBSS+ in jedem Transwell, sorgfältig 20 l der neutrophilesuspension (5 x 10⁷ Zellen/ml) wie in Schritt 5 beschrieben zubereitet. Hinweis: Dies entspricht etwa 1 x 10⁶ Neutrophilen/Transwell.
16. Inkubieren Bei 37 oC, 5%_CO2 in einer befeuchteten Kammer für 2 Stunden, um eine transepitheliale Migration von Neutrophilen zu ermöglichen.
17. Bereiten Sie eine Standardkurve vor, um die Anzahl der Neutrophilen zu bestimmen, die nach 2 Stunden migriert wurden. Fügen Sie 40 l der Neutrophilensuspension (5 x 10⁷ Zellen/ml) in 2 ml HBSS(+) ein und übertragen Sie 1 ml in 1 ml HBSS(+) und führen Sie serielle 2-fache Verdünnungen acht weitere Male für insgesamt 10 Standards von ca. 2.000 Zellen/ml bis 1 x 10⁶ Zellen/ml durch. 1 ml HBSS(+) für leer einschließen.
18. Nach 2 Stunden Migration heben Sie die Transwells an, indem Sie mit einem Hämostat greifen und sanft gegen die Innenwände der 24-Well-Migrationsplatte tippen. Transwells entsorgen.
19. Bewerten Sie die Migration von Neutrophilen grob in den Brunnen, indem Sie Brunnen der 24-Well-Migrationsplatte unter einem invertierten Mikroskop mit dem 10-Fach-Objektiv betrachten (siehe Abbildung 1 für Bilder von migrierten Neutrophilen in jedem Zustand).
20. Fügen Sie jedem gut verwendeten 24-Well-Migrationsteller, jedem Standard und dem Rohling 50 l von 10 % Triton X-100 hinzu.
21. Drehen Sie die 24-Well-Migrationsplatte, Standards und Leerung bei niedriger Geschwindigkeit für 20 min bei 4   oC.
22. Bereiten Sie 1 M Citratpuffer im Voraus vor. 52,5 g Zitronensäure und 73,5 g Natriumcitrat zu 400 ml destilliertem Wasser in ein Becherglas geben. PH auf 4.2 bringen. Destilliertes Wasser zur von 500 ml hinzufügen. Lösung bei 4 oC lagern.
23. Bereiten Sie ABTS Substratlösung frisch an diesem Tag. 3 ABTS-Tabletten (je 10 mg) und 5 ml 1 M Citratpuffer zu 45 ml destilliertem Wasser geben. Lassen Sie Tabletten vollständig in Lösung auflösen. Eine Zugabe von 50 l 30 % Wasserstoffperoxid zurückhalten, bis die ABTS-Substratlösung benötigt wird (siehe Schritt 7.27).
24. Fügen Sie jedem Brunnen, der in der 24-Well-Migrationsplatte verwendet wird, jedem Standard und dem Rohling 50 l Citratpuffer hinzu.
25. Übertragen Sie 100 l jeder Probe gut in Doppelter Ausführung auf eine 96-Well-Platte. Hinweis: Es ist sehr wichtig, den Inhalt in jeder Probe gründlich zu mischen, bevor Sie auf die 96-Well-Platte wechseln. Pipette die Lösung mindestens fünf Mal vor dem Transfer.
26. Übertragen Sie 100 l jedes Standards und den Rohling nach dem Mischen auf die 96-Well-Platte (leer in Duplikat).
27. Fügen Sie der ABTS-Lösung und dem Wirbel 50 l 30 % Wasserstoffperoxid hinzu.
28. Fügen Sie jeder Probe auf der 96-Well-Platte 100 l ABTS-Substratlösung hinzu.
29. Lassen Sie Platte für 5-10 min im Dunkeln zu entwickeln. Hinweis: In bestimmten Brunnen sollte sich eine grüne Farbe entwickeln, die mit der Anzahl der Neutrophilen korreliert, die in jedem Brunnen vorhanden sind.
30. Mit einer Wellenlänge von 405 nm mit einem Mikroplattenleser ablesen.
31. Berechnen Sie die Anzahl der Neutrophilen, die über die Epithelschicht migriert sind, anhand der Standards, bei denen eine lineare positive Korrelation zwischen der bekannten Anzahl von Neutrophilen, die als Standards hergestellt werden, und der Menge der Peroxidaseaktivität, gemessen durch die optische Dichte bei 405 nm, besteht (siehe Abbildungen 2 und 3 für repräsentative Daten). Anmerkung: Diese Methode der neutrophilen Quantifizierung nutzt die große Menge an Peroxidase-Aktivität, die von Neutrophilen aufgrund der Myeloperoxidase-Expression gezeigt wird. Alternative Ansätze zur Quantifizierung von Neutrophilen können in Betracht gezogen werden, wie methoden, bei denen Neutrophile mit Radioaktivität oder Fluoreszenzverbindungen voretikettiert werden.

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Ergebnisse

Mehrere Studien haben gezeigt, dass pathogeninfizierte Epithelschichten die neutrophile transepitheliale Migration erleichtern^{3,8,19,24-28,31,32}. Dies geschieht über eine pathogen-spezifische Induktion eines epitheliaalzellabgeleiteten neutrophilen chemotaktischen Gradienten^3,23. Zum Beispiel bewirkt die pathogene P. aeruginosa, die mit der apikalen Oberfläche von Lungenepithelzellen interagiert, dass eine beträchtliche Anzahl von Neutrophilen über die Epithelschicht^{18,22,25,26,33,...}

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Diskussion

Neutrophile Migration über Schleimhautepitheloberflächen ist ein häufiges Merkmal in der Krankheitspathologie nach einer Infektion mit bakteriellen Krankheitserregern³. Die hier beschriebene Methode bietet einen schnellen, einfachen Ansatz, um dieses diskrete Ereignis experimentell zu isolieren, indem ein menschliches In-vitro-Kokultur-Assay-System verwendet wird, das ein Merkmal des entzündlichen Prozesses modelliert, der durch bakterielle Infektionen ausgelöst wird. Dieses System wurde ursprü...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCl-H292 cells	ATCC	CRL-1848
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1	ATCC	#47085
Escherichia coli MC1000	ATCC	#39531
D-PBS (1x) liquid	Invitrogen	14190-144	without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-147	10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%)	Invitrogen	25300-062	50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-)	Invitrogen	14175-079	Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution	Invitrogen	15250-061.	Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail	Invitrogen	A10483-01	Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid	Sigma-Aldrich	C1909-500G	Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	S4641-500G	Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous	Sigma-Aldrich	D8066-250G	Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride	Sigma-Aldrich	213330-500G	Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G	Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	ED-100G	Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder	Sigma-Aldrich	H1387-10L	Key component of HBSS+
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G	Component of HBSS+
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)	Sigma-Aldrich	A9941-50TAB	Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	H1009-100ML	Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF)	Sigma-Aldrich	F-3506	A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B	Fisher Scientific	M-12026
Pseudomonas isolation agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-749	Optional, can improve neutrophil purity
24-well migration plate	Corning Incorporated	#3524
24-well wash plate	Falcon	35-1147	Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate	Fisher Scientific	#12565501
Transwell Permeable Supports	Corning Incorporated	#3415	Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish	Falcon	35-1013	Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.
500 ml 0.2 μm filter / flask	Fisher Scientific	09-740-25A	To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat	Fisher Scientific	13-812-14	Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope	Zeiss	#342222
Versa-Max Microplate Reader	Molecular Devices	#432789