Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Zusammenfassung

Dieses Modell der orthotopen menschlichen Prostatakrebs ermöglicht die Quantifizierung der Tumorgröße, zirkulierenden Tumorzellen und die Bildung von Metastasen in unterschiedlichen Lungen. Wie Zellen müssen das primäre Organ zu entkommen, in die Blutbahn, und implantieren in einem sekundären Standort dieses Modell effektiv rekapituliert das Szenario in den Menschen.

Zusammenfassung

Unser Labor hat eine neuartige orthotopen Implantation Modell der menschlichen Prostatakrebs (Prostatakarzinom) entwickelt. Als PCa Tod nicht auf den Primärtumor, sondern die Bildung von verschiedenen Metastasen, von hohem Wert ist die Fähigkeit, diese Fort effektiv modellieren vorklinisch. In diesem Modell werden die Zellen direkt in die Bauchlappen der Prostata in Balb / c-Mäusen ohne Thymus implantiert, und für 4-6 Wochen fortschreiten. Bei Experiment Beendigung kann mehrere verschiedene Endpunkte gemessen werden, wie z. B. Größe und molekulare Charakterisierung des Primärtumors, dem Vorhandensein und die Quantifizierung von zirkulierenden Tumorzellen in Blut und Knochenmark, und die Bildung von Metastasen in der Lunge. Neben einer Vielzahl von Endpunkten, bietet dieses Modell ein Bild von einer Fähigkeit, Zellen eindringen und die Flucht der Hauptorgel, geben Sie und überleben in das Kreislaufsystem und Implantat und wachsen in einem sekundären Standort. Dieses Modell wurde verwendet, um effektiv zu messen metastasiertemReaktion auf beide Änderungen in der Proteinexpression sowie der Reaktion auf kleine molekularer Therapeutika, in einer kurzen Bearbeitungszeit.

Einleitung

Prostatakrebs (Prostatakarzinom) ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Männern und die zweithäufigste Todesursache durch Krebs in den Vereinigten Staaten ^ein. Tod von PCa ist nicht auf die Bildung der Primärtumor, sondern die Bildung von Metastasen. Daher ist von großer Bedeutung Prävention von Metastasen bei Patienten. Mausmodelle von PCa bieten eine Vielfalt von Optionen, um kritische biologische Informationen über diese Krankheit aufzudecken.

Eine Vielzahl von Mausmodellen der PCa existieren, die jeweils mit inhärenten Vorteile und Einschränkungen. Während die Frequenz des PCa bei Menschen hoch ist, ist natürlich vorkommenden PCa extrem selten in ² Mäusen, trotz gleicher Gesamt Anfälligkeit von Mäusen, Krebs ^3. Ein Nagetier Ausnahme ist die Entwicklung von PCa in Lobund Wistar-Ratten, die Raten von PCa von 90% nach 12 Monaten über die Induktion von Methylnitrosoharnstoff und Testosteron ⁴ erreichen können. Deshalb induziert Modellsystemen, wie dem TRAMP(Transgene Maus Adenokarzinom der Prostata) Modell werden üblicherweise verwendet. Die TRAMP-Modell kann Transgen-Expression spezifisch in der Prostata zu induzieren, und unterliegt den normalen Verlauf der PCa von Hyperplasie zu Prostatahyperplasie intraepitheliale Neoplasie (PIN) zu Lymph-und Lungenmetastasen ^5-6. Diese Modelle bieten die Vorteile der Lage, das gesamte Spektrum der Tumorprogression sowie enthalten ein intaktes Immunsystem zu messen. Jedoch können die molekularen Ereignisse PCa Entwicklungswertes zwischen Mäusen und Menschen unterschiedlich und Korrelationen zwischen Maus und humanen klinischen Studien haben gezeigt Variabilität. Darüber hinaus sind diese beiden Modelle sind zeitaufwendig, als ein Beispiel der TRAMP-Modell benötigt ca. 28 Wochen, um Metastasen zu entwickeln.

Bei der Untersuchung Metastasen, wird häufig ein Schwanz-Vene oder linken Herzkammer Einspritzmodell verwendet. Dieses Modell profitiert von schnellen Turnaround-Zeit, und kann zusätzlich messen die Anwesenheit von Knochen metastasist mit spezifischen Zelllinien und Bedingungen. Yang et al. Haben berichtet, dass subkutane Injektion von GFP-positiven PC3 Zellen weit verbreitet verursachen Knochenmetastasen ⁷ und Schwanzvenen und Interkardial Injektionen sind auch generiert Knochenmetastasen Entwicklung ^9.8. Die Haupteinschränkungen dieser Modelle beziehen sich auf das Fehlen eines Primärtumors, die sich innerhalb der Prostata sich. Ferner für Modelle angewiesen auf Injektion von Krebszellen in den Kreislauf, umgeht dies die gesamte erste Hälfte der metastatischen Kaskade. Es schließt damit erste Schritte der Prüfung, einschließlich der Invasion durch die primäre Organ, das biologisch entscheidende Maßnahmen des metastasierten Transformation sind. Viele Aufsichtsbehörden von metastasierendem Transformation direkt auf frühen Zellinvasion. Frühe Schritte der metastatischen Kaskade bilden hohe Priorität Websites für therapeutische Targeting, wie einst Krebszellen verbreiten, dehnt klonalen Variante stark, wodurch biologische Erhöhungal Vielfalt und abnehm wirksamen therapeutischen Targeting.

In einem Versuch, um viele der Einschränkungen dieser Modelle zu reagieren, hat unserem Labor eine orthotope Modell der menschlichen PCa in dem der menschliche PCa PC3-M-Zelllinie direkt in die Prostata von Balb / c-Mäusen ohne Thymus implantiert entwickelt. Nach 4-6 Wochen können Tumorgröße, Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) und Metastasen in der Lunge und Lymphknoten alle quantifiziert werden. Wir haben effektiv verwendet dieses Modell, um die Wirksamkeit zu bewerten 4 ',5,7-Trihydroxyisoflavon (Genistein) die menschliche PCa ¹⁰ Metastasen hemmen. Nahrungsverbrauch von Genistein in Verbindung gebracht wurde, um in Prostata-Krebsmetastasen und Tod ^11-12 abnimmt, aber bisher keine Studie hatte festgestellt, ob die Verabreichung von Genistein konnte PCa Metastasen bei Tieren oder Menschen zu verändern. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Behandlung mit Genistein die Anzahl der Lungenmetastasen stark reduziert. Darüber hinaus haben wir festgestellt Genistein alNamen die Aktivierung und Expression von mehreren wichtigen pro-metastatischen Proteine ​​im Primärtumor, einschließlich Focal Adhesion Kinase (FAK), p38 Mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38 MAPK) und Hitzeschockprotein 27 (HSP27).

Diese Ergebnisse entsprachen mit den Beobachtungen in der Klinik. Mit Blut aus den Mäusen erhalten, waren wir in der Lage, die Blutkonzentrationen von Genistein genau zu messen und zu beobachten, um diese ähnlich Spiegel bei Menschen mit regelmäßigen Nahrungsverbrauch von Genistein sein. Zusätzlich wurde eine Phase-II-Studie, die von unserer Gruppe durchgeführt, festgestellt, dass bei der Behandlung mit Genistein, Männer einen Rückgang der Prostatagewebe mRNA-Expression von Genen, die mit Zellinvasion und Metastasierung assoziiert, insbesondere Matrix-Metalloproteinase-Typ-2 (MMP-2) ^13.

Wir haben auch dieses Modell, um die Auswirkungen der veränderten Gen-Produkt-Expression in den Primärtumor auf die menschliche PCa Metastasierung ¹⁴ zu beurteilen. Der Tumor suppressor endoglin ist ein Mitglied der TGF-Superfamilie und unterdrückt menschlichen PCa zelluläre Invasion in vitro über Änderung der Smad Signal ^15. Wir erweitern diese Studien, um die Wirkung auf die menschliche PCa endoglin Metastasen zu bestimmen. Stabile endoglin Knockdown, Vektorregelung oder endoglin Überexpression Zelllinien wurden in Mäuse implantiert. Endoglin Knockdown-Zellen zeigte die höchste Anzahl von Lungenmetastasen sowie CTC in 38% der Mäuse. Mäuse mit implantierten Steuervektor zeigte eine mittlere Antwort mit weniger Lungenmetastasen pro Maus und CTC in nur 18% der Mäuse. Hohe endoglin implantierten Mäuse zeigten fast vollständige Unterdrückung der Lungenmetastasen und vollständige Unterdrückung der CTC.

Dies sind nur zwei Beispiele für die Vielzahl von Anwendungen hat diese Technik. Von der Wirkstoffentwicklung, Modellierung Veränderungen in der Molekularbiologie, bietet dieses Modell eine hohe Durchsatzverfahren zur Bewertung der Auswirkungen der verschiedenen Funktionen auf das Tumorwachstum und Maulwurfsondere Änderungen Gegenwart CTC und die Bildung von Metastasen verschiedene in der Lunge und Lymphknoten.

Protokoll

Für alle Verfahren, die Tiere, sind Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Northwestern Universität genehmigt. Chirurgische Techniken und Tierpflegebedingungen wurden von Veterinärpersonal beobachtet und modifiziert, um Tier Stress oder Mortalität zu minimieren. Einzelne Organe können unterschiedliche Anforderungen haben, und es ist wichtig, mit IACUC und Tier Mitarbeiter arbeiten bei der Entwicklung und Ausführung dieser Operationstechnik.

1. Herstellung von Zellen zur Injektion

1. Dieser Schritt sollte so nah wie möglich in die Ausgangsoperationen durchgeführt werden. Trypsinize Zellen für das Experiment verwendet, von der Platte zu entfernen und zu neutralisieren, mit Medien. Die PC3-M menschlichen PCa-Zelllinie, die stabil mit GFP transfiziert wurde erfolgreich für diese Experimente verwendet, aufgrund der schnellen Wachstumsbedingungen der PC3-M-Zellen. GFP wurde für eine weitere Erleichterung der Erfassung der Lungenmetastasen in der Lungengewebeproben und schnelle Bestimmung von MehrKrebszellen gegenüber Immunzellen in Kulturen aus Blut und Knochenmark zu zirkulierenden Tumorzellen zu identifizieren, erhalten. Wenn Modifizieren eines spezifischen Gens von Interesse, dann Erzeugung von stabilen Zelllinien mit dieser Genveränderung zuerst durchgeführt, gefolgt von einer Transfektion mit GFP. GFP wird, wenn die Funktion dieses Gens von Interesse zu verändern, kann es GFP weggelassen. Dadurch wird der Erfassungslungenmetastasen schwieriger, aber immer noch erreichbar. Wenn zusätzlich mit spezifischen Bildverarbeitungstechnologie unter Verwendung von fluoreszierenden Markern, wie Luciferase-Basis IVIS, andere fluoreszierende Proteine ​​können stattdessen verwendet werden.
2. Zentrifuge für 5 min bei 225 x g.
3. Isolieren 2,5 x 10 ⁵ Zellen und Zentrifuge für 5 min bei 225 x g.
4. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in 20 ul steriler Kochsalzlösung.
5. Saugen Zellsuspension in einer 0,5-ml-Spritze mit einer permanenten 28 ½ G-Nadel (empfohlen: Kendall Monojet, wie andere Marken haben Probleme verursacht), sodass keine Luft in die Nadel along mit der Suspension.
6. Wickeln Spritze in sterile Folie und Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch.

2. Orthotopen Implantation von menschlichen Prostatakrebszellen

1. Männlich 6-8 Wochen alte Balb / c Nacktmausmodell verwendet. Das ideale Körpergewicht der Maus für die Operation ist 19-21 g, und Mäusen erlaubt sein sollte, mindestens 18 g vor der Operation wachsen werden. Kleinere Tiere sind technisch schwieriger zu operieren. Größere Tiere dazu neigen, langsamer Kinetik des Tumorwachstums und der Metastasenbildung erfahren. Die Tiere sollten in der Tierhaltung mindestens eine Woche vor der Operation, um Stress zu minimieren Tier untergebracht werden. Je nach Versuchsanordnung kann medikamentöse Behandlung eine Woche vor der Operation zu beginnen.
2. Spritzen Sie vor der Operation Schmerzmittel gemäß den Anweisungen des Tieranlage. 0,1 mg / kg Körpergewicht subkutane Buprenex mit einer 30 ½ G-Nadel in eine 1 ml-Spritze angebracht ist, vorgeschlagen.
3. Zeigen Tiere in die Isofluran-Kammer und warten, bis Tiere sind voll einnesthetized. Kein Fuß-Reflex des Muskeltonus sei an dieser Stelle vorhanden sein. Diese Methode wird empfohlen, aber falls nicht verfügbar, können auch andere Methoden der Anästhesie gemäß den Anweisungen des Tieranlage verwendet werden.
4. Bewegen Tier aus der Isofluran Kammer in eine sterile Verfahren Kapuze. Zeigen Tier in die Nasenkegel Vorrichtung und wieder dafür sorgen, dass Tier ist unter Voll Betäubung bevor Sie fortfahren.
5. Desinfizieren unteren Bauchregion mit Betadine Scrub mit sterilen Wattekugeln, wischen Sie mit Alkohol zu wischen, und letzte Spray mit Betadine Lösung. Trocknen lassen.
6. Entweder mit einem sterilen Skalpell oder geschärft sterilen OP-Schere, eine niedrige Mittellinie Bauchschnitt von ca. 3-4 mm hergestellt wird. Heben Sie die Blase mit einer Pinzette und identifizieren Sie die Bauchlappen der Prostata. Diese beiden Nocken sind direkt unterhalb der Blase befindet. Einige Mäuse haben eine kleine Schicht von Fett für die Prostata, die sich sanft beiseite mit einem sterilen Wattestäbchen bewegt werden kann. Minimize alle Bewegungen von Organen und Muskulatur, wenn möglich.
7. Spritzen Sie 20 ul Volumen Zell-Lösung in die Prostata, die Minimierung Leckage und die Gewährleistung eine kleine Blase beobachtet.
8. Blase ersetzen und schließen Sie die Muskelschicht unter Verwendung von 4,0 resorbierbaren Vicryl Monofilamentnahtmaterialien in einem einfachen Muster unterbrochen.
9. Schließen Sie die Hautschicht mit steriler 9 mm Heftklammern.
10. Entfernen Tier von Isofluran-Narkose und zu überwachen, bis wach und normal bewegt. Legen Sie auf Heizkissen während Erholungsphase.
11. Wenn mehrere Operationen werden durchgeführt, zwischen Operationen, sauber alle Werkzeuge mit 70% Ethanol und sterilisieren mit einem Glasperlen Sterilisator. Lassen Tools vollständig vor dem nächsten Tier zu kühlen. Nähte, Watte oder sterile Tupfer nicht wiederverwenden.

3. Überwachung Tiere

1. Verwalten Schmerzmittel auf Basis von Anweisungen des Tieranlage. 4 Stunden nach der Operation Verabreichung einer Dosis von subkutanen Meloxicam bei 1 mg / kg Körpergewicht usingen 30 ½ G-Nadel in eine 1 ml Spritze angebracht wird vorgeschlagen, gefolgt von einer zusätzlichen Dosis alle 12-24 Stunden für die nächsten 48 Stunden.
2. Staples kann von Tieren, 7-10 Tage nach der Operation entfernt werden, sobald die Wunde verheilt ist.
3. Überwachung der Tiergewicht, Nahrungsaufnahme, und tasten Mäusen Tumoren zweimal pro Woche bis zum Ende des Experiments. Frequenz erhöhen bis zu jeden zweiten Tag, wenn die Tumore sichtbar für Tiere unter erheblichem Tumorlast oder Zwang prüfen zu werden. Früher Tod von diesem Modell ist aufgrund der großen Primärtumorlast als primäre Tumoren können Harnfluss blockiert, so dass alle Tiere, die mit einem Verlust von mehr als 15% des Körpergewichts oder eines primären Tumors erreichen einen Durchmesser von 1,5 cm sollte sofort seziert werden verhindern Harnstauung und Tier Tod.
4. Monitor für zusätzliche Bereicherung der Tierumgebung. Der Stress der Operation erhöht Tierkämpfe. Die Zugabe von zwei Kunststoff-Hütten pro Käfig anstelle von einem und zusätzliches Verhaltenal-Anreicherung kann diese Vorfälle zu verringern. Diskutieren Sie mit Tierärzten Möglichkeiten an der Anlage werden die Tiere bei untergebracht. Angesichts der fehlenden Wimpern auf dieser Stamm von Mäusen, sind Hütten und Bereicherung aus Papier nicht zu empfehlen, da sie die Augen reizen.

4. Necropsy Verfahren

1. Nach 4-6 Wochen sind Tumoren völlig offensichtlich und Tieren anfangen, Gewicht wegen der erhöhten Tumorlast zu verlieren. Die Tumoren können in der Regel ertastet werden und / oder offensichtlich sind. Nekropsie sei an dieser Stelle durchgeführt werden. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Nembutal bei 260 mg / kg Körpergewicht mit einer 30-Gauge-Nadel ½ zu einer 1-ml-Spritze befestigt ist, und damit sich die Tiere völlig bewusstlos zu werden, ohne Zehenreflex oder Gegenwart Muskeltonus.
2. Sobald das Tier anästhesiert unter Verwendung von sterilen chirurgischen Schere oder einem Skalpell geschnitten horizontal über den Rumpf des Tieres direkt unter dem Brustkorb, dann senkrecht zu der Achselhöhle entlang der Seite des Tieres, Setzen das Herz. Führen einer terminalen Herzpunktion mit einer 30 ½ G-Nadel in eine 1 ml Spritze mit 4% Natriumcitrat in DPBS gespült, um die Gerinnung zu verhindern, erhalten wird, wie viel Blut wie möglich aus dem Tier befestigt.
3. Entfernen Sie die Lunge aus dem Tier, indem die Luftröhre mit chirurgischer Schere oder einem Skalpell und sofort in einer Gewebekultur Kassette und in 10% Formalin zu platzieren.
4. Entfernen Sie den primären Prostatatumor aus dem Tier durch individuelle Schneid keine Blutgefäße in den Tumor angebracht und die Gewährleistung keine zusätzlichen Organe wie die Samenleiter oder Samenblasen sind beigefügt.
5. Das Gewicht und die Größe des Tumors. Messen des Gewichts des Tumors in Gramm im Labormaßstab. Mit Sättel, messen Sie die Länge des längsten Durchmesser des Tumors in Zentimetern und die entsprechende senkrechte Achse. Multiplizieren Sie diese Werte, um die Tumorgröße zu erhalten. Je nach den geplanten Einsatz sofort schnappen Einfrieren in flüssigem Stickstoff, und / oder inan einer Gewebekassette in 10% Formalin.
6. Expose die Hüft-und Kniegelenke mit chirurgischer Schere oder einem Skalpell, und trennen Beingelenke, wobei darauf geachtet, den Oberschenkelknochen intakt zu halten. Entfernen Sie die Oberschenkelknochen aus dem Tier aufnehmen und in steriler Kochsalzlösung.
7. Erhalten Sie alle anderen Organen oder Materialien von Interesse, und entsorgen Tier nach Anweisungen Ihres Instituts. Insbesondere regionalen Lymphknoten-Metastasen neigen zu haben, neigen dazu, vergrößert werden, wenn sie zu beherbergen, und kann geerntet werden. Allerdings sollte darauf geachtet werden, wie dies durch Änderungen des hydrostatischen Drucks durch den chirurgischen Eingriff verursacht betroffen sein werden.

5. Verarbeitung und Immunfärbung von Lungengewebeproben

1. Innerhalb von 24-48 Stunden der Platzierung Gewebe in 10% Formalin in PBS, betten die Lunge in Paraffin.
2. Abschnitt der Lunge bei 45 um Schritt Abschnitte unter 3.2 benachbarten 4 um Lungengewebeschnitten.
3. Wenn GFP-positive Zellen verwendet (empfohlen), Immunfärbung durchzuführenfür GFP. Wenn nicht, führen Sie Standard Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung.

HINWEIS: Die Dako Envision + Kit in Kombination mit dem GFP-Antikörper von Invitrogen erfolgreich nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde, aber dies kann zu jeder Immunhistochemie Verfahren geändert werden.

4. Ergebnis Metastasierung verblindet. Wenn GFP-positive Tumorzellen werden zusätzlich zu den mit großen und unverwechselbaren Kerne braun färben. Beim ersten Wertungs Metastasierung, konsultieren Sie einen Pathologen richtige Scoring zu gewährleisten, und verwenden Sie H & E-gefärbten Lungengewebe, die Präsenz von Tumorzellen zu bestätigen, und nicht infiltriert Immunzellen.

6. Identifizierung von zirkulierenden Tumorzellen aus Blut und Knochenmark

1. In allen von der Obduktion in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt Blut. Zentrifuge 5 min bei 800 x g.
2. Entfernen Sie die Plasma-und 1 ml ACK-Lysepuffer (154,95 mM Ammoniumchlorid, 9,99 mM Kalium Bicarbonate, 0,0995 mM EDTA). Das Blut bei Raumtemperatur 3-5 min zu sitzen.
3. Zentrifuge 5 min bei 800 x g.
4. Entfernen Sie den Überstand und 1 ml Zellkulturmedien, die Antibiotika. Hinzufügen von Zellen zu einem T75-Kolben mit 9 ml Zellkulturmedium.
5. Kulturzellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO ₂ für 10 Tage, Prüfen auf das Vorhandensein von CTC alle 2-3 Tage.
6. Für Knochenmark, entfernen Sie alle Muskelgewebe aus Oberschenkelknochen mit einer Schere, einer Rasierklinge oder Skalpell. Entfernen der Enden der Knochen, möglichst nahe an den Enden wie möglich.
7. Verwendung einer 23 G-Nadel ¾ sanft ausgeworfen das Knochenmark aus den Oberschenkelknochen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
8. In den 1 ml Zellkulturmedien und vorsichtig pipettieren, gut mischen.
9. Hinzufügen von Zellen zu einem T75-Kolben mit 9 ml Zellkulturmedium.

7. Molekulare Charakterisierung von Tumoren

1. Für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assays, Tumorproben, die Schnapp waren in flüssigem Stickstoff eingefroren werden zuerst auf Trockeneis pulverisiert und dann homogenisiert mit einem Gewebe-Homogenisator für 3-5 min mit 1 ml TRIzol. TRIzol Extraktion wird den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Reinige RNA mit dem RNeasy RNA Isolation Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Darstellende cDNA-Synthese und quantitative Echtzeit-PCR (qRT / PCR) unter Verwendung von TaqMan-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers wird empfohlen, aber kann für jede derzeit eingesetzten PCR-Verfahren modifiziert werden.
2. Für die Western-Blot-Assays, homogenisieren Gewebe mit einem Gewebe-Homogenisator für 3-5 min mit 1 ml Lyse-Puffer: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-Phosphat, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, unter Zusatz von Protease-Inhibitor-Cocktail, Phosphat-Inhibitor-Cocktails 2 und 3, 10 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat. Das Zelllysat Gemisch wird in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
3. Centrifuge Zelllysat Mischung für 10 min bei 13.000 x g.
4. Überstand entfernen und in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenrohr und erneut 10 min bei 13.000 x g zentrifugiert. Wenn die Zelltrümmer noch vorhanden ist, kann eine zusätzliche Zentrifugationsschritt durchgeführt werden.
5. Überstand entfernen und führen Sie eine Western-Blot nach normalen Laborbedingungen.

Ergebnisse

Für dieses Experiment zeigen wir eine repräsentative Gruppe von Mäusen während dieser chirurgischen Verfahren erhalten. Fünf Mäuse wurden mit GFP-positive M PC3-Zellen, die ein Steuervektor implantiert. Tumoren ließ man sechs Wochen lang wachsen, und dann wurden mehrere Parameter ausgewertet. In Fig. 1A und 1B zeigen wir die Änderung des Körpergewichts und der Nahrungsaufnahme bei Mäusen auf. Es gibt ein kleines Bad im Körpergewicht und Nahrungsaufnahme um das Datum der Operation wegen der Narkose. Im Verlauf des Experiments, Körpergewicht langsam zu postoperativen und beginnt gegen Ende des Experiments zurück als Tumorlast eine kritische Höhe erreicht, dann. Dies wird durch die Nahrungsaufnahme in diesen Mäusen abgestimmt.

In den Fig. 2A und 2B sind Vertreter bezogen Tumorgrößen dargestellt. Einzelne Tumorgrößen variieren, aber im Durchschnitt wir Tumoren von etwa 1 Gramm zu erreichen, mitnormale Abweichung zwischen 0,5-1,5 g, und einer Tumorgröße von 1 cm ^2, mit einem normalen Varianz von 0,5-1,5 cm ^2. Obwohl die Größe der Tumoren variiert, diese nicht mit der Anzahl der resultierenden Metastasierung, beide in diesem Papier und unserer früher veröffentlichten Arbeiten ¹⁰ gezeigt korreliert. Jedoch von diesem Modell, kann die Wirkung der Arzneimittelbehandlung oder molekularen Veränderungen im Tumorgewicht und Größe zu bestimmen. Ein wichtiger Gesichtspunkt bei diesem Modell ist, wenn der entsprechende Endpunkt für das Experiment ist. In den Fig. 2C und 2D zeigen wir Veränderungen in Tumorgewicht und Tumorgrösse in einer bestimmten PC-3-M-Zelllinie, die stabil mit GFP und einer Steuervektor transfiziert 4 Wochen und 6 Wochen. In den letzten zwei Wochen stieg die durchschnittliche Tumorgewicht 2,7 fach, und die Tumorgröße 1,9 fache. Dies zeigt der Zusatz von 1-2 Zusatz Wochen auf das Experiment kann dramatisch beeinflussen Ergebnisse. Eine Vielzahl von Faktoren können das Wachstum der Tumoren, einschließlich alterdas Alter und die Größe von Mäusen, die Anzahl der Durchgänge der Zellen etc. empfehlen wir, nicht beendet, bis Experimenten sichtbar Tumoren werden in der Mehrzahl der Mäuse beobachtet.

In den Figuren 3A-3C wird die Anzahl der Metastasen drei verschiedene Arten quantifiziert. In Fig. 3A ist die Gesamtzahl GFP-positiver Zellen menschlichen PCa dargestellt. In Fig. 3B ist die Anzahl der Zellorte oder Orte, an denen metastatische Ablagerungen vorhanden sind, gezeigt. Schließlich ist in Fig. 3C, die Anzahl der verschiedenen Metastasen, wie durch einen deutlich gebundene Gruppe von Zellen, die 5 oder mehr GFP-positive menschliche PCa Zellen definiert ist, angezeigt. Repräsentative Bilder von diesen verschiedenen Bedingungen sind in den Figuren 4A-4D gezeigt. In Fig. 4A ist eine einzelne Zelle bei 40-facher Größe mit einem Pfeil markiert. Beachten Sie die braune Färbung und große deutlichen Kernen. Eine benachbarte Lungen Abschnitt gefärbt mit H & E-Färbungist in Fig. 4B gezeigt, was bestätigt, dass ohne GFP, ist die Detektion von Krebszellen noch gut erreichbar ist. Dieses Foto wird bei 40-facher Grße genommen, und die Zelle ist mit einem Pfeil markiert. In Figur 4C sind mehrere Loci unterschiedlicher Zellzahl bei 10-facher Grße angezeigt und jeder Locus mit einem Pfeil markiert. . Schließlich, in 4D, eine Anzahlung von 10 metastatischen Zellen gezeigt. Wie diese Methoden beeinflussen die Daten durch Unterschiede in der Maus 1 und Maus 3 dargestellt. Maus 1 hat eine niedrigere Gesamtzahl von Zellen in der Lunge, mit einem Durchschnitt von 21,5 Zellen pro Lungenabschnitt, im Vergleich zu Maus-3, die einen Durchschnitt von 700 Zellen pro Lungenschnitt hat. Hat Maus 3 jedoch weniger Loci, oder Orte, an denen Zellen vorhanden als Maus 1 sind. Maus 3 relativ wenigen Stellen von Metastasen, aber die Anzahl von Zellen pro Flächeneinheit sehr hoch bei 82 Zellen pro Loci durch mehrere sehr große Anzahl von Zellen Metastasen. Im Gegensatz Maus 1 hat mehr einzigartige Loci, aber deutlich fEwer Zellen pro Lage nur durchschnittlich zwei Zellen pro Lage. Diese verschiedenen Parameter können Licht auf die Kinetik der Zellen Handel in die Lunge und ihre Fähigkeit, zu wachsen beginnen und sich vermehren zu vergießen.

Zusätzlich in 3D, zeigen wir Veränderungen in Gesamt metastatischen Zellen pro Lunge bei Mäusen an vier gegen 6 Wochen seziert. Wie in den 2C und 2D beschrieben wurde, sind wesentliche Änderungen im Tumorgewicht und-größe in der letzten zwei Wochen des Experiments beobachtet. Dies ist in Fig. 3D rekapituliert. Mäuse vier Wochen seziert zeigten keine Metastasen Entwicklung, während Mäuse, 6 Wochen zeigte metastatischen Zellen in allen Mäusen bewertet. Dies zeigt weiter die Bedeutung der Gewährleistung Nekropsien Mäuse sind in einem späten Stadium Endpunkt durchgeführt, um sicherzustellen, Bildung von Metastasen aufgetreten ist.

Eine zusätzliche Messung in diesem Modell ist molekularen Veränderungen innerhalb der auftretende Primärtumor. In Fig. 5A-5C zeigen wir beispielsweise drei qRT / PCR-Experimente Messung von drei Gene von Interesse in metastatischen Progression, Matrix-Metalloproteinase-Typ-2 (MMP-2), Matrix-Metalloproteinase-Typ 9 (MMP-9) und Hitzeschockprotein 27 (HSP27) jeweils. Jedes Gen von Interesse über qRT / PCR gemessen wird, kann mit dieser Technik nachgewiesen werden. Zusätzlich können Protein-Ebene unter Verwendung von Western-Blot-Verfahren quantifiziert werden.

Fig. 1 ist. Beobachtete Körpergewicht und Nahrungsaufnahme bei Tieren. AB) Körpergewicht in Gramm oder durchschnittliche Lebensmittelverbrauch pro Maus pro Tag in Gramm, wird während des Experiments aufgezeichnet und in A gezeigt) und B) auf.

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2. Tumorgröße und Tumorgewicht in Einzel-und Gruppen von Mäusen. AB) Tumorgewicht in Gramm und die Tumorgröße in Zentimetern von fünf repräsentativen Kontrollmäuse und der Durchschnitt der fünf Mäuse am Ende von sechs Wochen quadriert in A gezeigt) und B) sind. CD) Ein Vergleich der Tumorgewicht in Gramm und Tumorgröße in Zentimetern zwischen Gruppen von Mäusen seziert Quadrat in vier bis sechs Wochen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

3. Metastasierung in Einzel-und Gruppen von Mäusen. AC) Die durchschnittliche metastasierendem spread pro Lunge Abschnitt fünf einzelnen Mäusen und der Durchschnitt der fünf Mäuse am Ende von sechs Wochen entweder als Gesamtzahl der Zellen (A), des Orts von metastatischen Zellen (B), oder als getrennte Metastasierung von 5 + Zellen definiert sind eine klar definierte Cluster (C). D) Ein Vergleich der durchschnittlichen Anzahl der metastatischen Zellen pro Lunge Schnitt pro Maus zwischen Mäusen seziert an vier und sechs Wochen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

4. Repräsentative Bilder der Lungenmetastasen. A) Ein einzelner GFP-positive Lungenzell bei 40X-Objektiv ist mit einem Pfeil. B markiert) Eine benachbarte LungenSchnitt von A), welches die gleiche Zelle unter H & E-Färbung. c) ein Lungenabschnitt zu 10X-Objektiv mit sieben einzelnen Loci, die unterschiedliche Zahlen von Zellen. D) Eine deutliche Metastasierung bei 10X-Objektiv mit 10 Krebszellen eindeutig als eine Gruppe definiert.

5. PCR-Analyse der drei metastasierendem Gene von Interesse. QRT / PCR wurde auf einzelnen Tumorproben von Mäusen nach sechs Wochen gesammelt durchgeführt. Relative mRNA-Transkript Konzentrationen von MMP-2 (A), MMP-9 (B) und HSP27 (C) gemessen, normiert auf GAPDH. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Diskussion

In diesem Beitrag stellen wir eine neue Maus-Modell der menschlichen PCa Metastasierung. In diesem Modell, das menschliche Prostatakarzinom-Zelllinien PC-3-M orthotop direkt in die Prostata von Balb / c-Mäusen ohne Thymus und Tumoren ließ 4-6 Wochen entwickeln implantiert. In der repräsentativen Ergebnisse Abschnitt zeigen wir Beispiele für Daten, die gesammelt werden können, einschließlich Mausgewicht und Nahrungsaufnahme, Tumorgröße und Gewicht, der molekularen Eigenschaften des Tumors und die Bildung von Metastasen in verschiedene Lunge. Zusätzlich kann eine Vielzahl von zusätzlichen Ausgangssignale in Abhängigkeit von bestimmten Forschungsinteressen untersucht werden. Ein Beispiel ist die Anwesenheit von CTC zum Blut und Knochenmark. Als CTC sind ein relativ seltenes Ereignis (wir beobachten, CTC in etwa 5-20% der Kontrolltiere), waren wir nicht überrascht, dass keiner der fünf Mäuse in diesen Experimenten entwickelt CTC. Unser Labor hat auch dieses Modell, um Veränderungen in der zellulären Adhäsion durch Messung der Zellkernmorphologie in der BestimmungProstatagewebe ^10. Wir haben auch dieses Modell verwendet, um primäre Tumorproliferation und Apoptose Status auswerten mit Ki67 und TUNEL-Färbung des Prostatatumors ^14.

Zusätzlich zu der Vielzahl von Datenausgängen, die erhalten werden kann, kann dieses Modell verwendet, um die Auswirkungen der beiden Veränderungen in der Proteinexpression sowie niedermolekularer Therapeutika zu bestimmen. Im Vergleich zu vielen spontanen und induzierten Modelle des menschlichen Prostatakarzinom Metastasen, gibt es eine höhere Durchlaufzeit von 4-6 Wochen. Andere Modelle mit einer hohen Laufzeiten, wie Schwanzvene oder Interkardial Injektion Modelle, haben ihre Grenzen ohne Primärtumor, also nicht vollständig rekapituliert die Klinik metastatischen Kaskade. In unserem Modell sind Tumorzellen, die primäre Ort der Herkunft zu entkommen, geben und zu überleben, das Kreislaufsystem und implantieren in einem sekundären Standort. Dies bietet zusätzliche Schritte, bei denen eine therapeutische Intervention oder Änderung in der Proteinexpression konnte eine Wirkung zu liefern. Additional sollte das Vorhandensein des Primärtumors für die einfache Anwendung dieses Modells auf neue Imaging-Technologien wie Luciferase-basierte IVIS ^16-17 ermöglichen.

Trotz der Vielfalt der Vorteile dieses Modells gibt es auch einige Einschränkungen zu berücksichtigen. Eine wachsende Zahl von Studien zeigen die Bedeutung des Immunsystems in der Tumor-Mikroumgebung und der Entwicklung von Metastasen ^18. In diesem Modell wird durch die Verwendung einer athymischen Nager, ist die Fähigkeit, die Wirkungen des Immunsystems Beurteilung nicht möglich. Eine zweite Einschränkung ist das Fehlen von Androgen Reaktions in PC3-M-Zellen. Bei der ersten Diagnose von PCa-Patienten häufig Androgen-Therapie wird als First-Line Behandlung zu unterziehen. Allerdings werden Patienten schließlich werden Androgen-resistenten Tumoren und beginnt wieder zu wachsen. Wie PC3-M-Zellen fehlt der Androgen-Rezeptor, dieses Modell misst nur die Effekte der medikamentösen Behandlung oder Protein-Modulation auf Post-Androgen resistent cancer. Das ist zwar eine Einschränkung, ist Androgen-responsive PCa derzeit gut überschaubar und hat eine Vielzahl von wirksamen Behandlungsmöglichkeiten und damit Androgen-resistenten Krebs geworden prominent sucht. Dieses Modell auch speziell verwendet einen Inzuchtstamm von Mäusen, die Maus zu Maus Variabilität minimiert. Allerdings kann dieser Stamm besonders die auf bestimmte Proteine ​​oder kleine Moleküle, so kümmern sollte bei der Extrapolation dieser Daten in die Klinik aufgenommen werden.

Obwohl dieses Modell bietet eine effektive Messung der Wirksamkeit von Medikamenten in einer schnellen Lieferzeit von 4-6 Wochen, kann dies nicht berücksichtigen langfristige Medikamentendosierungseffekte. Nach längerer Exposition gegenüber vielen derzeit verfügbaren Behandlungen können Patienten mit medikamentenresistenter Krebs viele Jahre nach der Behandlung zurückkehren. Die schnelle Durchsätze dieser Technik nicht wirksam für die Modellierung der Fähigkeit eines Tumors gegen eine Behandlung zu ermöglichen. Jedoch mit der Modulation dieser ExExperiment kann behandlungsresistenten menschlichen Prostatakrebszellen implantiert werden, und die Wirksamkeit der zweiten Generation therapeutische Verhinderung PCa Tumorwachstum und Metastasierung kann modelliert werden. Außerdem, wenn eine Gruppe wurde versucht, die molekularen Veränderungen in einem Primärtumor über die Zeit zu untersuchen, wurde ein längerfristiges Modell wie der TRAMP-Modell wird wahrscheinlich effektiver für diesen Studien sein.

Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist die Verbreitung von verschiedenen Metastasen nur in Lymphknoten und Lunge der Tiere. Beide Seiten sind häufige und klinisch relevanten Websites der Metastasierung, wie von warmen menschlichen Autopsiestudien ¹⁹ demonstriert. Stellt jedoch klinisch Knochenmetastasen eine herausragende Merkmal des menschlichen PCa und damit Modelle rekapituliert dies von Interesse. Leider sind diese nur schwer in einem Maus-Modell zu rekapitulieren, mit sehr wenigen Modelle, die Knochenmetastasen ohne Schwanzvenen, intercardial Injektion oder direkte Implantation in²⁰ bis auf die Knochen. Wenn somit gezielt auf den Knochen von entscheidender Bedeutung Versuchs kann ein anderes Modell effektiver. Allerdings ist dieses Modell auf den Knochen bieten ein gewisses Maß an Verkehr in der Form von Knochenmark zirkulierenden Tumorzellen.

Trotz dieser Einschränkungen ist diese Technik ein leistungsfähiges Modell der menschlichen PCa. Die Möglichkeit, Effekte auf den Primärtumor als auch Metastasen-Bildung in einem kurzen Durchlaufzeit zu messen bietet eine Vielzahl von Anwendungen. Bei diesem Modell müssen die Zellen der primären Organ entkommen, geben Sie und überleben in den Blutkreislauf und Implantat in einem sekundären Standort, rekapituliert den Prozess beim Menschen. Die zusätzliche Messung der molekularen Eigenschaften des Primärtumors, Veränderungen der Zellmorphologie und das Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen eine große Atem von Informationen aus einem Modell. Dieses Verfahren kann sowohl im Rahmen der Wirkstoffsuche, sowie Änderungen in der Tumorbiologie Studie verwendet werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip	Becton Dickinson	309659
23 G 3/4 Precison Glide Needle	Becton Dickinson	305143
30 G 1/2 Precision Glide Needle	Becton Dickinson	305106
Alcohol Wipes	Triad	10-3001
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel	Becton Dickinson	427630
Clips, 9mm	VWR	15431-673
Convertors Polyline Towel (Sterile)	Cardinal Health	3520
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft	Fisher	23-400-125
Curad Sterile Cotton Balls	VWR	500043-544
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4")	VWR	95039-192
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves	Cardinal Health	2D72PN70
Germinator 500	Cell Point Scientific	SN 7030
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle	Tyco	1180528012
Medium Heating Pad	VWR	100229-094
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2")	VWR	94000-000
Metric/English Vernier Caliper	VWR	19155-057
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27"	Ethicon	Z304H
VetEquip Inhalation Anesthesia System			Contact Your Animal Facility for Availability
VWR Premium Tissue Cassettes	VWR	18000-010
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2")	VWR	82027-440
Reagents
Betadine Surgical Scrub	Fisher Healthcare	19-027132
Buprenex			Controlled Substance - Obtain from Animal Facility
Dako DAB + Chromagen	Dako	K3468
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit	Dako	K4003
Dako Envision Kit Protein Block	Dako	X0909
Formalin	VWR	95042-908
GFP Antibody	Invitrogen	A11122
Hematoxylin	Mayer	MH580-2.5L
Meloxican			Obtain from Animal Facility
Nembutal			Controlled Substance - Obtain from Animal Facility
Rneasy RNA Isolation Kit	Qiagen	74104
Sterile Saline			Obtain from Animal Facility
Taqman Reverse Transcription Reagents	Life Technologies	N8080234
TaqMan Universal PCR Master Mix	Life Technologies	4304437
Trizol	Invitrogen	10296