Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Zusammenfassung

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Zusammenfassung

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

Einleitung

Urinary Exosomen sind kleine interne Bläschen von 100 nm von multivesicular bodies (MVB) von allen Zelltypen unter normalen und pathologischen Bedingungen in Urin-Raum einschließlich der glomerulären Podozyten, Nierentubuluszellen und Zellen entlang der Urindrainage-Systeme, die für die miRNAs ¹ angereichert werden angezeigt abgeleitet ^-2. Viele Forscher haben unterschiedliche Proteine ​​in Exosomen aus dem Urin von gesunden Personen als auch solche mit eingeschränkter Nieren- und / oder systematische Erkrankungen ^3-5 getrennt erfasst. Exosomen kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie zweistufige Differential Ultrazentrifugation mit oder ohne Sucrose ^6-7 isoliert werden, die Kombination Nanofilter mit Ultrazentrifugation ^8-9 oder Präzipitation ^10-11. Vor kurzem haben wir eine einfache, schnelle, skalierbare und effektive Methode zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren und zu erkennen miRNA und Protein-Biomarkern ¹¹ entwickelt. Obwohl Biomarker können in einer Vielzahl von verschiedenen biologischen Flüssigkeiten nachgewiesen werden, urine ist die ideale Wahl für Patienten mit Erkrankungen der Niere und der ableitenden Harnwege, weil es in großen Mengen in einem relativ nicht-invasive Art und Weise erhalten werden.

Obwohl es verschiedene Verfahren zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren ^6-11, hängt die am meisten verwendeten Verfahren auf Differential Ultrazentrifugation mit einer 30% Saccharose-Kissen. Während dieses Verfahren effizient und die Qualität der resultierenden Exosomen mit diesem Verfahren isoliert hoch ist, das Verfahren selbst erfordert geschultes Personal und ist zeitaufwendig und erfordert mehrere Ultrazentrifugationsschritte. Andere Verfahren, wie Filtration und Fällung, wurden für die Isolierung der Exosomen entwickelt worden, einschließlich eine, die einen proprietären Ausfällungsreagenz verwendet (dh ExoQuick-TC: System Biosciences; Mountain View, CA). Obwohl Fällung mit dieser Reagenz schnell und relativ einfach, die Reinheit der Exosomen isoliert ist gering im Vergleich zu der Ultrazentrifugation method. Vor kurzem haben wir sechs Methoden zur Isolierung von Harn Exosomen, einschließlich einer Modifizierung der Fällungsverfahren unter Verwendung ExoQuick-TC, die in unserem Labor entwickelt ¹¹ verglichen. Wir fanden, dass diese modifizierte Präzipitationsverfahren lieferte höhere Mengen an Protein, miRNA, und mRNAs und das Verfahren selbst schneller und einfacher zu implementieren als Ultrazentrifugation war. Hier beschreiben wir die Versuchsprotokoll unserer modifizierten Fällungsverfahren stufenweise, und verfügen über eine Diskussion der Vor- und Nachteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden der Exosom Isolation. Das modifizierte Fällungsverfahren beinhaltet eine anfängliche Ausfällung von Exosom-Partikel, gefolgt von der Entfernung Tamm-Horsfall-Protein, das mit exosomalen Proteine ​​korreliert, und bekanntlich exosome Ausbeute von Urin zu verringern. Wir fanden, dass diese Modifikationen erhöht die Ausbeute und Reinheit des exosomalen Präparat aus Urin.

Protokoll

. Hinweis: Der in der Isolierung der Exosomen Harn unter Verwendung der modifizierten Fällungsverfahren beteiligten Schritte sind in der Figur 1 dargestellten anfänglichen Schritte beinhalten die Entfernung von großen toten Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation. Das endgültige Pellet aus der aus jedem nachfolgenden Schritt gesammelten Überstand erhalten entspricht der Exosomen, die in Isolationslösung für die weitere Gewinnung von Protein, RNA und DNA, gelöst wird.

1. Sammlung von Urin

1. Vor der Urinsammlung, bereiten Protease-Inhibitor-Cocktail nach den Anweisungen des Herstellers und fügen 3,125 ml dieser Cocktail in ein leeres steriles Gefäß. Die Röhrchen mit dem Protease-Inhibitor-Cocktail kann dann Freiwillige für Urinsammlung verteilt werden.
   HINWEIS: Der Grund für das Hinzufügen von Protease-Inhibitor ist, Proteinabbau in der Urinprobe zu minimieren. Obwohl wir speziell verwendet einen Proteaseinhibitor-Cocktail ausSigma, können andere im Handel erhältliche Proteasehemmer ersetzt werden.
2. Sammeln Sie etwa 10 ml der ersten Urin. Verarbeiten Sie die Urin unmittelbar nach der Entnahme ohne Lagerung oder Kühlung. Isolieren Sie die Harnwege Exosomen in zweifacher Ausfertigung mit der modifizierten Fällungsverfahren; einer der beiden Analysen für DNA, Gesamt-RNA und Proteinextraktion, während die andere für die Quantifizierung von Harn Exosom-Partikel.
   HINWEIS: Ein 24-Stunden-Urinprobe für Exosom Isolierung durch Lagerung bei 4 ° C gewonnen werden.

2. Entfernung von Zelltrümmern und Tamm-Horsfall Protein (THP)

1. Übertragen Urinproben auf 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge 10 ml Harn bei 17.000 × g für 10 min bei 37 ° C, um Zellen und Zelltrümmer (Figur 1) zu beseitigen.
2. Mit einer Pipette den Überstand in ein frisches Röhrchen für die weitere Verarbeitung. Das Pellet in 500 ul Isolierungslösung (250 mM Saccharose, 10 mM prüfetAmin, pH 7,6), gefolgt von 10-minütiger Inkubation mit DL-Dithiothreitol (DTT: Endkonzentration 200 mg / ml) bei 37 ° C.
   HINWEIS: DTT wird hinzugefügt, um THP, die Exosomen Fallen abgebaut, was zu einer verminderten Erträge. Achten Sie darauf, um das Pellet während der Übertragung des Überstandes ungestört zu lassen, und bestätigt, dass der Überstand frei von Pellets.
3. Vortex Pelletproben alle 2 min, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist. Dann fügen Sie 500 ul der Isolation Lösung des gelösten Pellets.
4. Unmittelbar nach der Zugabe der Isolierungslösung zu dem Pellet, Zentrifuge bei 17.000 × g für 10 min bei 37 ° C. Pipette die überstehende und sich mit dem früheren Überstand gesammelt.
5. Das Pellet in 50 ul Isolierungslösung für die SDS-PAGE-Analyse.
   HINWEIS: PBS oder TBS kann anstelle Isolierungslösung verwendet, um das Pellet zu resuspendieren.

3. Isolierung Exosom Pellet

1. Bis 11 ml des gesammelten supernatant Fügen 3,3 ml ExoQuick-TC Reagenz und Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 12 Std.
   ANMERKUNG: Das Verhältnis des Volumens des Überstandes, um ExoQuick-TC Reagenz eingestellt werden kann, um zu erhöhen oder zu verringern exosomalen Ausbeute. Wir beobachteten, dass geringere Mengen an Reagens hinzugefügt kleinere Erträge von Exosomen.
2. Nach der Inkubation Zentrifuge wird die Probe / ExoQuick-TC Mischung bei 10.000 × g für 30 min bei 25 ° C.
3. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die SDS-PAGE-Analyse.
4. Die exosome Pellet bei -80 ° C für DNA, RNA und Protein-Extraktion und Quantifizierung von Exosom-Partikel mit CD9 ELISA ¹¹ gespeichert werden.
   HINWEIS: Die exosome Pellet bei -80 ° C für 1 Jahr bei begrenzten Einfrieren und Auftauen gelagert werden.

4. Biomarker-Erkennung und Analyse der Exosom Pellet

1. Für Downstream-Analysen, extrahieren DNA, RNA und Protein aus dem Exosom Pellet unter Verwendung des DNA / RNA / Protein-Extraktions-Kit und eine RNA-Isolierung kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Konzentrationen unter Verwendung eines Nanodrop Spektralphotometer durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm mit 2 ul Probe.
2. Führen quantitative Echtzeit-RT-PCR (qPCR) mit TaqMan MicroRNA Assays (in unserem Fall haben wir menschliche miR-192- und miR-1207-5p spezifische Assays) oder miRNA-spezifischen Primern.
3. Für SDS-PAGE-Analyse, verwendet 4-12% Bis-Tris-Gel und getrennte Proteinproben durch eindimensionale Elektrophorese. Visualisieren Gele unter Verwendung der Silberfärbung Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Führen Western Blot Analyse unter Verwendung von PVDF-Membranen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden polyklonalen Kaninchen-Antikörper, um die Apoptose-verknüpften Gens-2 interagierende Protein X oder ALIX und monoklonalen Maus-Antikörpers an Tumor Suszeptibilitätsgens 101 Protein oder TSG101 in der Western-Blot-Detektion. Quantifizieren Sie die Dichte der Banden von Open-Access-NIH ImageJ Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oderein ähnliches Programm.
5. Quantifizieren Sie die Anzahl der Harnwege mit einem CD9 ELISA-Kit nach Herstellerangaben erhalten Exosom Partikel.

Ergebnisse

Urinary Exosomen tragen Protein, miRNA und mRNA-Biomarker von Nierenepithelzellen abgesondert. Die Isolierung und Detektion dieser Exosomen kann ein nützliches Diagnosewerkzeug zur Früherkennung von Nierenkrankheiten bereitzustellen, wie diabetische Nephropathie. Es gibt verschiedene Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus Urinproben von menschlichen Probanden gesammelt. Wir haben vorher gegen sechs Methoden der Urin Exosom Isolation und untersucht resultierende Protein, mRNA und miRNA Ebenen ^11. Unser Zi...

Diskussion

Die meisten Verfahren, die Ausfällung der Exosomen aus Urin adressieren nicht die Entfernung des polymeren Netzwerks von Tamm-Horsfall-Protein (THP) gebildet. Dieses Protein ist in großen Mengen im Urin, wo sie mutmaßlich Fallen Exosomen während der anfänglichen Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit vorhanden ist. In unserem modifizierten Methode reduzierten wir THP mit DTT vor Exosom Niederschlag. Wie in Figur 2 gezeigt, wurde eine größere Menge von THP in unverändertem Urin und Pellet b...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15 ml Centrifuge Tube	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Centrifuge	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	used at final concentration of 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	NP0321BOX	For SDS-PAGE analysis
ECL Advance Western blotting detection kit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	For western blot detection of biomarkers
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	For exosome isolation
Exosome CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	For exosome quantification
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit	Qiagen	80004	For DNA, RNA, Protein isolation
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific		For Protein Quantification
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	For staining SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Life Technologies		For running the SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays	Life Technologies		For RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software	Biogazelle NV		For analysis of RT-PCR assay data
Rabbit polyclonal antibody to ALIX	Millipore		For western blot detection of biomarkers
Mouse monoclonal antibody to TSG101	Abcam		For western blot detection of biomarkers