Eine modifizierte Methode zur Heterotope Maus Herz-Transplantation

Zusammenfassung

A technique is demonstrated for the microsurgical procedure for heterotopic transplantation of hearts in mice, including simplified methods for donor harvesting and recipient vessel anastomosis.

Zusammenfassung

Mäuse werden oft als Herztransplantation Spender und Empfänger in Studien der Transplantationsimmunologie aufgrund der Vielzahl von transgenen Mäusen und Reagenzien zur Verfügung eingesetzt. Eine Schwierigkeit ist aufgrund der geringen Größe des Tieres und der erheblichen technischen Herausforderungen der Mikrochirurgie in der Herztransplantation beteiligt vorgestellt. Insbesondere kann eine hohe Rate von technischen Defekt früh nach der Transplantation des Empfängers Tod und postoperative Komplikationen wie Hinterbeinlähmung oder eines nicht-schlagenden Herzens führen. Hier wird die Technik für die vollständige Maus heterotope Herztransplantation demonstriert, mit Ernten des Spenderherzens und die anschließende Implantation in eine Empfängermaus. Das Spenderherz unmittelbar nach der in-situ-Perfusion mit heparinisierter Kochsalzlösung und Kalttrennung der aufsteigenden Aorta und Lungenarterie entnommen. Der Empfänger beinhaltet die Erstellung der abdominalen Aorta und Vena cava inferior (IVC), gefolgt vonEnd-zu-Seit-Anastomose der Aorta Spender zum Empfänger Aorta unter Verwendung einer einzigen Lauf 10-0 Mikronaht und eine ähnliche Anastomose des Spenders Pulmonalarterie mit dem Empfänger IVC. Nach der Operation wird das Tier wird mit 0,6 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan injiziert und man ließ sie auf 37 ° C Heizkissen erholen. Die Ergebnisse aus 227 Maus Herztransplantationen sind mit einer Erfolgsrate bei 48 h 86,8% zusammengefasst. Von den 13,2% Ausfälle innerhalb 48 Stunden, 5 (2,2%) erlebt Hinterbeinlähmung, 10 (4,4%) hatten eine nicht-schlagenden Herzen durch ischämische Verletzungen und / oder Thrombose zu pfropfen, während 15 (6,6%) starben innerhalb von 48 Stunden .

Einleitung

Tiermodelle der Organtransplantation können wertvolle Informationen für die Verbesserung der Behandlung der klinischen Transplantation Patienten. Mausmodelle sind besonders nützlich für die Untersuchung der Immunmechanismus der Organtransplantatabstoßung oder Annahme durch die breite Palette von genetisch veränderten Mäusen und spezifisch für Mäuse, die nicht für andere Tiermodelle ^3.1 verfügbar sind Reagenzien. Eine Herausforderung, mit Maus-Modellen der Transplantation ist die geringe Größe der Spender und Empfänger, die erhebliche technische Fähigkeiten, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erreichen erfordert.

Eine Technik wurde zuerst für heterotope Transplantation von Herzen in ⁴ Ratten, die anschließend für Maus Herztransplantation durch Corry et al ⁵ angepasst wurde beschrieben. Diese Technik involviert Herstellung der Empfänger vor dem Spender Betrieb und keine Perfusion des Spenderherzens, die beide wahrscheinlich das Überleben des transplantierten Herzens oder t kompromittierener Empfänger. Das Verfahren ist weit verbreitet, wie ursprünglich beschrieben, um die Mechanismen der Transplantatabstoßung und Toleranz ^6-8 zu prüfen. Andere haben die ursprünglichen Rattenherztransplantation von Ono und Lindsey für Herztransplantationen bei Mäusen ^9,10 angepasst. In jüngerer Zeit wurde eine Technik für Maus Herztransplantation, die einige der Probleme mit dem Verfahren Corry et al ¹¹ zugeordnet wand veröffentlicht. Das hier beschriebene Protokoll enthält unser Modifikationen, basierend auf der Methode von Mottram et al ^12, die umfassen: in-situ-Perfusion mit heparinisierter Kochsalzlösung Kalt unmittelbar nach Thorakotomie und Durchführen der Spenderoperation vor dem Empfänger die Empfängerbetrieb Betriebszeit zu minimieren. Darüber hinaus verwenden wir kleine atraumatische Gefäßklemmen statt 6-0 Seidenkrawatten. Obwohl Gefäßklemmen haben den Nachteil, nehmen mehr Raum, den sie sind leichter zu kontrollieren als Krawatten, die nicht zu eng oder locker sein sollteund sind weniger einfach, als Klemmen entfernen. Unsere Methode verwendet einen einzigen fortlaufende Naht für Gefäß-Anastomose, obwohl in der ersten Lernstufen eine Alternative ist die Haltefäden an den proximalen und distalen Ecken verwenden, um Gleichmäßigkeit der Nähte zu gewährleisten und so die Durchgängigkeit der Anastomose.

Protokoll

Vor Beginn der Experimente, die Zustimmung ihrer Animal Care Ethik-Kommission des betreffenden Institution für die geplanten Experimente. Pflegen Mäuse im Einklang mit den Anforderungen Ihrer Einrichtung. Das folgende Protokoll wurde von der Universität Sydney und Royal Prince Alfred Hospital Gremien genehmigt worden.

Vor Beginn der Operation sollten alle Geräte sorgfältig gereinigt und durch Eintauchen in 80% Ethanol sterilisiert werden. Einige Institute sehen vor dem Autoklavieren dies kann jedoch feinen mikrochirurgischen Instrumente langfristig beschädigen. Wenn möglich Verwendung sterilen Einweg-Geräte.

1. Anästhesie

1. Anesthetize Maus mit Isofluran in einem verschlossenen Behälter dann legen Sie sie in Rückenlage auf einer Betriebspension, schnell Anschluss Betäubung Nasenkegel. Test-Angemessenheit der Narkose durch Einklemmen des Hinterfußes, um sicherzustellen, gibt es keinen Reflex.
2. Rasur die Haut mit einem Skalpell undSterilisation mit 80% Ethanol. Zusätzlich können 2% Chlorhexidin in 70% Isopropylalkohol für Haut Sterilisation verwendet werden. Während der Einleitung der Narkose die Isofluran-Konzentration von 3%, aber diese zu reduzieren, um 1-1,5% für die Wartung. Machen Sie Anpassung dieser Konzentration, regelmäßige Atmung und Herzfrequenz zu halten. Haltetemperatur des Tieres auf einem Heizkissen.

2. Donor Betrieb

1. Machen Sie eine Thorakotomie, um das Herz und die Gefäße, indem die Brust durch beide Seiten des Brustkorbs von der Rippenrand bis zur Achselhöhle, gefolgt von einem Querschnitt auf der Ebene der xiphisternum, eine Brustwandklappe bilden aus. Heben Sie diese Klappe oben neben dem Kopf und stecken es in die Arbeitsplatte. Reißen Sie Herzbeutel, die Herz und Gefäße aus.
2. Heben Sie die untere Hohlvene mit einer Pinzette in der einen Hand und mit der anderen spritzen 1 ml kalter Kochsalzlösung Heparin proximal zu Herzen durch die IVC, dann einen kleinen Arterienklemme auf der IVC zur Präventiont Fluss Perfusionslösung zurück durch das Nadelloch.
3. Mit Gaze und einem Wattestäbchen, zurückziehen das Herz nach unten, um den aufsteigenden Aorta und Lungenschlagader freizulegen. Passieren eine Klinge aus einem Paar von Mikroschere durch den Kanal (Quer Sinus) hinter dem Bündel von Aorta und Lungenarterie und die Aorta schneiden und Lungenarterie zusammen so weit distal wie möglich, um eine ausreichende Länge für die Anastomose zu gewährleisten.
4. Krawatte und teilen die IVC rechten oberen Hohlvene (SVC), links SVC und Lungenvenen mit 6-0 Seidenfaden. Binden Sie die IVC und rechts separat SVC dann einen einzigen Faden hinter dem Herzen, um das linke SVC zusammen mit Lungenvenen umkreisen und binden Sie es. Ernten Sie das Herz aus der Entnahmestelle, indem die Gefäße distal der Krawatten, dann speichern Sie es in kaltes steriler Kochsalzlösung bei 4 ° C bis zur Transplantation. Dies führt zu dem Tod des Spenders durch Ausbluten.

3. Empfänger Betrieb

1. Anesthetize dieEmpfänger wie oben beschrieben (Abschnitt 1). Sorgfältig rasieren Bauch, um Irritationen zu vermeiden, dann machen Sie einen Bauchschnitt durch Mittellinienschnitt von Schambein bis xiphisternum und Einfahren mit Büroklammern gebogen, um Wundhaken bilden. Wickeln Sie den Darm in warmen steriler Kochsalzlösung getränkte Gaze und zurückziehen, um der oberen rechten Seite des Bauches.
2. Um die Infrarot-renalen Aorta und IVC aussetzen, geben sie die gebündelten Segmente der Aorta und IVC von der linken Nierenarterie und Vene in die Iliakalbifurkation, indem sie sie aus den Lenden-Schiffe mit einem Kauterisierungsvorrichtung. Achten Sie darauf, dass das Brenneisen ist bei der richtigen Temperatur und für eine ausreichende Zeit verwendet, um die Gefäßenden zu teilen und zu versiegeln.
3. Bewerben kleinen atraumatische Gefäßklemmen an der Aorta und IVC Segmenten distal und proximal. Einen Einschnitt in der vorderen Wand der Aorta, indem zuerst ein Loch mit einer 30 G Nadel Punktieren; schneiden Sie dann einen Einschnitt vertikal mit Mikroschere, um die Größe des Spenders Aorta entsprechen. Spülen Sie die Aorta Lumen mit Heparin-Kochsalzlösung, um jede bl entfernenood Klumpen.
4. Bringen Sie das Spenderherz auf die Empfängerstelle mit Gaze in kalten Kochsalzlösung getränkt bedeckt und legen Sie sie mit der rechten Seite des Bauches. Sicherzustellen, dass der Spender Aorta neben dem Einschnitt auf der Empfänger Aorta und der Lungenschlagader positioniert Spender neben dem Empfänger IVC angeordnet.
5. Anastomosieren den Spender Aorta Ende-zu-Seite zu dem Empfänger unter Verwendung von Aorta ausgeführt 10-0 Nylonnaht ausgehend von der proximalen Ecke und Nähen entlang der linken Seite bis zum Erreichen der ersten distalen Ecke, in welcher Phase sich das Tier um 180 ° gedreht. Das Spenderherz bewegen sanft auf die linke Seite des Bauches, die rechte Seite der Aorta freizulegen, und weiter durch Vernähen der rechten Seite der Aortawand von dem distalen Ende zu dem proximalen Ende. Vor dem Schließen der Aorten-Anastomose, sanft spülen Sie das Lumen mit Heparin-Kochsalzlösung, um jede Gerinnsel und Luft zu entfernen.
6. Anastomosieren den Spender Lungenarterie (PA) Ende-zu-Seite mit dem Empfänger IVC. Einen Einschnitt vertisch mit Mikroschere in der Vorderwand der IVC an einer Stelle in Übereinstimmung mit der Arterie Anastomose. Anastomosieren die PA-Donor an Empfänger IVC mit fließendem 10-0 Nylonnaht ausgehend von dem distalen Ende des linken Wand innerhalb des Lumens der IVC. Nach Erreichen des proximalen Endes, weiterhin Nähte entlang der vorderen rechten Seitenwand bis zu dem distalen Ende, um die Anastomose abzuschließen. Vor dem Schließen der Anastomose, sanft spülen Sie das Lumen zu Blutgerinnseln und keine Luft zu entfernen.
7. Vor der Freigabe der Gefäßklemmen, Ort Stücke Gelfoam um die Anastomose Websites und sanften Druck mit einem Watte bis Hämostase erreicht. Zum Zeitpunkt der Revaskularisierung, lassen Sie die distale Klammer, gefolgt von der proximalen Klemme.
8. Nach Revaskularisierung gelten warmen Kochsalzlösung bei 37 ° C auf das Transplantat von außen auf seine Genesung zu unterstützen. Das Transplantat beginnt in der Regel sofort und kehrt Flimmern spontan in den Sinusrhythmus innerhalb von ein paar Minuten. Spritzen Sie 0,6 ml warmenKochsalzlösung subkutan Hydratation des Empfängers zu erhalten. Subkutan injizieren Buprenorphin zur Analgesie vor der Beendigung der Operation
9. Schließen Sie die Bauchwunde mit einem 5:0-resorbierbaren Nahtmaterial für beide Lauf den Schichten. Beginnen Sie, indem Sie das Innenschicht und weiter auf der Haut.

4. Wiederherstellung und Überwachung Graft

1. Spritzen Sie Ampicillin zur Prophylaxe von Infektionen und platzieren Sie den Empfänger auf einem Heizkissen bei 37 ° C für die Verwertung. Die meisten Tiere erholen sich schnell und werden in der Regel trinken und oft innerhalb von 3 Stunden zu essen. Wenn die Maus zeigt Anzeichen von Leiden, genau prüfen, um Ursache zu ermitteln. Wenn keine offensichtliche Ursache, Behandlung mit Buprenorphin und genau beobachten. Konsultieren Sie einen Tierarzt, wenn die Symptome sind schwere oder anhaltenden mehr als 8 Stunden und betrachten Euthanasie. Wenn nötig, geben weiterhin 12 Stunden Injektionen von Buprenorphin, bis die Symptome zu beheben. Wenn die Maus zeigt Anzeichen von Leiden nach 8 Stunden, 12 geben weiterStunden Injektionen von Buprenorphin, bis sie zu lösen. Wenden Sie den Tierarzt, wenn die Symptome weiterhin für mehr als 48 h und einschläfern, wenn nötig.
2. Überwachung Transplantat Herzschlag durch direkte Abtasten des Bauches und notieren Sie die Stärke der Beat als + + + + für eine gesunde Transplantat + für schwachen Beat aufgrund fortgeschrittener Ablehnung und - als nicht zu schlagen durch Abstoßung des Transplantats zu vervollständigen. Überwachung der Mäuse täglich für die ersten 10 Tage, dann 3x pro Woche für die Dauer des Experiments.

Ergebnisse

Nach einer ersten Trainingszeitraum wurden 227 Fälle von Maus heterotopen Herztransplantation in unserer Gruppe analysiert. Die Erfolgsrate innerhalb der ersten 24 Stunden war 90,3% und nach 48 Stunden war 86,8%. Von den 30 (13,2%) Ausfälle innerhalb 48 Stunden, 5 (2,2%) erlebt Hinterbeinlähmung und musste eingeschläfert werden, 10 (4,4%) hatten eine nicht-schlagenden Herzen durch Transplantat Ischämie Verletzungen und / oder Thrombose, während 15 (6,6%) starben innerhalb von 48 Stunden. Einige experimentelle Tran...

Diskussion

Maus Herztransplantation ist eine anspruchsvolle mikrochirurgische Verfahren, die erhebliche chirurgische Geschick zu meistern erfordert. Der schwierigste Aspekt ist der kleine Durchmesser der Gefäße. Darüber hinaus ist es notwendig, den Empfängerbetriebszeit und Blutung zu begrenzen. Die Technik für Herztransplantations-Maus wurde zuerst von Corry et al. im Jahr 1973 und anschließend von Mottram et al ^12. Unsere Modifikationen umfassen die folgenden Punkte. Zum einen unmittelbaren Dur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating microscope	Leica, Heerbrugg, Switzerland	M651	10-25X magnification
Anesthetic machine	Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia	Vett3	Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air
Operating board	Hardware store or office supplier		Dense cork or synthetic capable of taking pins
Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C)	Pfizer, USA	FW25	In 1 ml syringe with 23 G needle on ice
Normal saline (37 °C)	AstraZeneca Pty Ltd, Australia	4538	In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad
Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl	Ethicon, Inc. NJ, USA	2870G/J421H
Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline)	Reckitt Benckiser, Sydney, Australia		In 1 ml syringe with 23 G needle on ice
Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline)	Aspen, Sydney, Australia		In 1 ml syringe with 23 G needle on ice
Gel Foam	Pharmacia & Upjohn Co. USA	801289304	Cut into small pieces
High temperature cautery device	Medtronic, USA	8444000
Heating Pad/Right Temp	Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790
Microsurgery instruments:	Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,
Microneedleholders	Shanghai, China	WT2020
Microscissors	"          "	WT1020
Microforceps (straight tip)	"          "	WA3010
Microforceps (curved tip)	"          "	WA3020
Micromosquito clamps (1 pair)	"          "	W40350
Microvessel atraumatic clamps (1 pair)	"          "	W40130/W40150