Gefäß Gentransfer von metallischen Stent Oberflächen mit Adenovirus-Vektoren durch Tethered Hydrolysierbare Vernetzer

Zusammenfassung

These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.

Zusammenfassung

In-Stent-Restenose stellt eine wesentliche Komplikation der Stentbasis Revaskularisierungsverfahren weithin verwendet, um die Wiederherstellung des Blutflusses durch kritisch verengter Segmente der koronaren und peripheren Arterien. Endovaskulären Stents in der Lage, abstimmbaren Freisetzung von Genen, die mit Anti-Restenose-Aktivität kann eine alternative Strategie präsentieren, um derzeit verwendeten Medikamenten-freisetzenden Stents. Um klinische Umsetzung zu erreichen, müssen Gen-freisetzenden Stents vorhersehbar Kinetik der Stent-immobilisiert Genvektor Mitteilung und ortsspezifische Transduktion von Gefäßsystem aufweisen, während eine übermäßige Entzündungsreaktion in der Regel mit den Polymerbeschichtungen für physikalischen Einschluß des verwendeten Vektors verbunden. Dieser Beitrag beschreibt eine detaillierte Methode, ohne Mantel Tethering adenoviraler Genvektoren, Stents basierend auf einer reversiblen Bindung der adenoviralen Partikel Polyallylamin Bisphosphonat (PABT) modifizierte Edelstahl-Oberfläche über hydrolysierbarer Vernetzer (HC). Eine Familie vonbifunktionelle (Amin-und Thiol-reaktive) HC mit einer durchschnittlichen t _1/2 der in der Kette Esterhydrolyse im Bereich zwischen 5 und 50 Tage waren verwendet, um den Vektor mit dem Stent zu verbinden. Der Vektor Immobilisierungsverfahren wird typischerweise innerhalb von 9 h durchgeführt und besteht aus mehreren Schritten: 1) Inkubation der Metallproben in einer wässrigen Lösung von PABT (4 h); 2) Entschützen von Thiolgruppen in PABT mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin (20 min) installiert ist; 3) Expansion von Thiol reaktiven Leistung von der Metalloberfläche durch Reaktion der Proben mit Polyethylenimin mit pyridyldithio (PDT) Gruppen (2 h) derivatisiert; 4) Umsetzung von PDT Gruppen Thiole mit Dithiothreitol (10 min); 5) Änderung von Adenoviren mit HC (1 Stunde); 6) Reinigung von modifizierten adenoviralen Partikel durch Größenausschluss-Säulenchromatographie (15 min) und 7) Immobilisierung von Thiol-reaktiven adenoviralen Partikel auf dem thiolierten Stahlfläche (1 h). Diese Technik hat breite potentielle Anwendbarkeit über Stents,durch die Erleichterung der Oberflächentechnik bioprothetischer Geräte ihrer Biokompatibilität durch das Substrat-vermittelte Gen-Lieferung an den Zellen Anbindung des implantierten Fremdmaterials zu verbessern.

Einleitung

Die Wirksamkeit der Gentherapie als ein therapeutisches Mittel wird durch die schlechte Zielkapazität von Gentherapievektoren ^1,2 behindert. Der Mangel an geeigneten Ziel Ergebnisse zu sub-therapeutischen Ebenen der Expression des Transgens am Zielort und führt zu einer weiten Verbreitung von Vektoren für Nichtzielorgane ^3, auch die für die Montage Immunantwort sowohl gegen den Vektor und codiert therapeutisches Produkt verantwortlich ^{4, 5.} Eine mögliche Mittel, um die Promiskuität der Transduktion Offset und zur Förderung der Ausrichtung ist es, Gen-Vektoren an der gewünschten Stelle in einer Form, die ihre freie Verbreitung über Blut und Lymphe schließt einzuführen. Typischerweise auf einem lokal injizierbares Abgabesysteme mit entweder viralen oder nicht-viralen Vektoren mit Fibrin, Kollagen oder Hyaluronsäure Hydrogelmatrices ^6-10, die durch physikalisches Einschließen th fähig vorübergehend erhalt Genvektoren an der Injektionsstelle zugemischt verlassen diese Bemühungenem in einem polymeren Netzwerk.

Ein weiteres allgemein akzeptierte Paradigma für lokalisierte Gentherapie verwendet Immobilisierung von Genvektoren auf der Oberfläche der implantierten Prothesen ^11,12. Dauerhafte medizinische Implantate (endovaskuläre, Bronchial-, urologische und Magen-Darm-Stents, Herzschrittmacher, künstliche Gelenke, chirurgische und gynäkologische Maschen, etc.) Werden jährlich in Millionen von Patienten ¹³ verwendet. Während sie im Allgemeinen wirksam sind diese Geräte anfällig für Komplikationen, die unzureichend für die durch Strom Arztpraxen ^14-17 gesteuert werden. Implantierbaren Prothesen bieten eine einzigartige Gelegenheit, als Proxy-Plattformen für die lokale Gentherapie Behandlung dienen. Von der pharmakokinetischen Sicht Oberflächenderivatisierung von medizinischen Implantaten mit relativ niedrigen Eingangs Dosen von Genvektoren Ergebnisse bei der Erreichung sowohl hohe lokale Konzentrationen von Genvektoren auf das Implantat / Gewebe-Grenzfläche und eine Verlangsamung der Kinetik der their Elimination aus diesem Ort. Als Folge längerer Verweilzeit und verbesserte Aufnahme durch die Zielzellpopulation, Immobilisierung Vektor minimiert Ausbreitung der Gen-Vektor. Damit die unbeabsichtigte Inokulation von Nicht-Zielgeweben verringert.

Oberfläche Anbindehaltung von Genvektoren auf implantierbare Biomaterialien (auch als Substrat-vermittelte Gen Lieferung oder Festphasengentransfer bezeichnet) hat in der Zellkultur und Tierversuchen mit implementiert sowohl spezifische (Antigen-Antikörper ^18-20, Avidin-Biotin ^21,22) und nicht-spezifischen ^23-26 (Ladung, van-der-Waals) Wechselwirkungen. Die kovalente Bindung von Vektoren an die Oberfläche der implantierten Vorrichtung zuvor als nicht-funktionell betrachtet worden, da zu starke Bindungen mit der Oberfläche entgegen Vektor Internalisierung durch die Zielzellen. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Begrenzung kann durch die Verwendung von spontan hydrolysierbaren Vernetzer als Tet verwendet überwindenihr zwischen dem modifizierten Metalloberfläche des Stents und Kapsidproteine ​​des adenoviralen Vektors ^27,28. Darüber hinaus kann der Vektor Freisetzungsrate und Zeitverlauf der Expression des Transgens in vitro und in vivo unter Verwendung von hydrolysierbaren Vernetzern, die unterschiedliche Kinetik der Hydrolyse ²⁸ moduliert werden.

Die vorliegende Arbeit stellt ein detailliertes Protokoll für die reversible kovalente Bindung von adenoviralen Vektoren an aktivierte Metalloberfläche und stellt eine nützliche experimentellen Aufbau zur Untersuchung der folgenden Ereignisse Transduktion in vitro kultivierten glatten Muskelzellen und Endothelzellen und in vivo in der Rattenhalsschlagmodell Stentangioplastie .

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Protokoll

1. Herstellung der Cy3-markierten Adenovirus für den Release Experimente

1. Suspend 2 x 10 ¹² Teilchen von Ad _leer (ca. 2 x 10 ¹¹ infektiöse Einheiten) in 650 ul / Bicarbonat-Puffer (CBB, pH 9.3).
2. Den Inhalt des Fläschchens 1 (0,2 mg) der Amin-reaktiven Fluoreszenzfarbstoff (Cy3 (NHS) ₂₎ in 1 ml CBB bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg / ml.
3. 100 ul der Farbstofflösung zu Virussuspension Rührers 5 Sekunden und Inkubation für 1 h bei 28 ° C unter Schütteln (100-200 UpM).
4. Ins Gleichgewicht eine 20 ml Sepharose 6B-Säule mit PBS. Fügen Sie 750 ul von Cy3-markierten Ad Suspension tropfenweise zu der Mitte des Gel-Bett.
5. Nach Virussuspension das Harz durchdringt, mit 5 ml PBS. Entsorgen Sie die Eluat.
6. 0,5 ml PBS und sammeln das Eluat in einem markierten Glas-Container. Wiederholen Sie diesen Schritt 10x in einer Gesamtmenge von zehn 0,5-ml-Fraktionen.
7. Assay the gesammelten Fraktionen durch Spektrophotometrie (260 und 280 nm) für die virale DNA-Gehalt.
8. Bündeln die Fraktionen, die mehr als 10% der gesamten (Summe von F1 bis F10) optische Dichte (OD) bei 260 nm auf. Anmerkung: Typischerweise werden die Fraktionen F3, F4, F5, F6 und werden vereinigt und gemischt.
9. Re-Assay die gemischten vereinigten Fraktionen durch Spektrophotometrie (260 und 280 nm) und Assays durch Fluorometrie (550 _ex / _em 570 nm) für die virale DNA-Gehalt und Cy3 markiert Capsid Protein. Hinweis: Ein Cy3 (NHS) ₂ Kalibrierungskurve abdecken die 10 ^-9 -10 ^-13 mol / L-Bereich vorbereitet und fluorimetrisch auf der gleichen Platte wie die vereinigten Fraktionen untersucht.
10. Berechnen Sie die markierten Virusausbeute und Kennzeichnung Dichte. Es sei angenommen, daß 1,19 x 10 ¹² Viruspartikel / ml entspricht 1 OD-Einheit für eine Weglänge von 1 cm ^29. Verwenden Sie die Formel: Ertrag = [(OD _{260 nm} /1.19)*10 ¹² * V / Eingangs Ad Menge] * 100, wobei, OD _{260 nm} ist die optische density der vereinigten Formulierung bei 260 nm und V das Volumen der vereinigten Formulierung (ml) bis Ad Gewinnungsausbeute (%) zu berechnen. Verwenden Sie die Formel: Beschriftung Dichte = C * 6,02 * 10 ²³ / ​​(OD _{260 nm} /1.19)*10 ^12, wobei C Cy3 Konzentration der gepoolten Formulierung (Mol / ml) und OD _{260 nm} ist die optische Dichte der gepoolten Formulierung bei 260 nm bis mittlere Cy3 Markierungsdichte berechnen. HINWEIS: Eine typische Erholung von markierten Virus ist> 70% des Eingangs Dosis. Die Kennzeichnung Dichte 600-800 Fluorophor-Moleküle pro Einzelviruspartikel.
11. Aliquoten Cy3-markierten Ad _leer in kleinere Teile (in der Regel 5 x 10 ¹¹ Teilchen) geeignet für den einzelnen Freisetzungsversuche. HINWEIS: Aktuelle Protokoll legt die Verwendung von Cy3-markierten Ad ausschließlich in dem Freisetzungsversuch. Alle Transduktionsuntersuchungen werden mit nicht-markierten Vektoren durchgeführt.

2. Aktivierung von Metal Samples

1. Waschen Sie die rost steel Netzplatten oder Edelstahlstents nacheinander in Isopropanol (5 × 2 min) und Chloroform (5 x 2 min) bei 55 ° C unter Schütteln (100 rpm). Entfernen des Lösungsmittels.
2. Erhitzen Sie die Proben für 30 min bei 200 ° C.
3. Auflösen Polyallylamin mit Bisphosphonat installiert latenten Thiolgruppen (PABT ^27,28,30) in Wasser (1-2% w / v) bei 72 ° C unter Schütteln (100 rpm). PH-Wert auf 4,5-5 mit KHCO _3.
4. Metallproben inkubieren im PABT Lösung für 2-4 Stunden bei 72 ° C unter Schütteln (100-200 UpM). HINWEIS: Die Vorgehensweise sei an dieser Stelle angehalten werden. Die Proben werden 3 Tage bei 4 ° C stabil.
5. Dreimal mit doppelt destilliertem Wasser (DDW) Spülen der Proben.
6. Setzen Sie die Proben auf Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, 15 mg / ml in 0,1 M Essigsäure-Puffer) für 15 min bei 28 ° C unter Schütteln (100-200 UpM).
7. Spülen Sie 5x in entgastem DDW.
8. Setzen die Proben bis 2% Polyethylenimin mit installiert pyridyldithio Gruppen (PEI _{PDT ^27,28,30) in entgastem DDW in einer Argonatmosphäre für 2 Stunden bei 28 ° C unter Schütteln (100-200 UpM). HINWEIS: Die Vorgehensweise sei an dieser Stelle angehalten werden. Die Proben werden für 2 Wochen bei 4 ° C stabil.}
9. Dreimal mit DDW spülen den Proben.
10. Expose der Proben auf 10 mg / ml Dithiothreitol / DDW zu pyridyldithio Gruppen zu Thiolen konvertieren.
11. 5x spülen wieder in entgastem DDW.

3. Adenovirus Aktivierung und Metalloberfläche Immobilisierung

1. Suspend 5 x 10 ¹¹ Teilchen entweder Ad _eGFP oder Ad _Luc (ca. 5 x ¹⁰ 10 infektiöse Einheiten) in 487,5 bis 495 ul / Bicarbonat-Puffer (CBB, pH 9.3). Hinweis: Bei den Freisetzungsstudien, verwenden Sie 5 x 10 ¹¹ von Cy3 markierten Ad _leer Teilchen (die Lautstärke auf 487,5 bis 495 ul mit CBB).
2. Auflösen HC mit unterschiedlichen Hydrolyseraten ²⁸ [(schnell (t _1/2 = 5 d), zwischen (t _{1 /}2 = 12 d) und langsam (t _1/2 = 50 d) HC, dh RHC, IHC oder SHC Abbildung 1] oder nicht hydrolysierbaren Vernetzer (NHC), Sulfo-LC-SPDP in CBB bei 20 mM.
3. Sofort im 5-12,5 ul-Vernetzungslösung der Virussuspension mit einem Gesamtvolumen von 500 ul (200-500 uM Endkonzentration von Vernetzer), Vortex und Inkubation für 1 h bei 28 ° C unter Schütteln (100- 200 rpm).
4. Ins Gleichgewicht eine 20 ml Sepharose 6B-Säule mit entgastem 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Tropfenweise 500 ul Vernetzer-modifizierte Ad-Suspension in den Mittelpunkt des Harzbettes.
5. 5 ml entgastem EPBS. Entsorgen Sie die Eluat.
6. 0,5 ml entgastem EPBS und sammeln das Eluat in einem markierten Glas-Container. Wiederholen Sie diesen Schritt 10 Mal in einer Gesamtmenge von zehn 0,5-ml-Fraktionen.
7. Bestimmen OD der gesammelten Fraktionen mit Spektrophotometrie bei 260 und 280 nm und wandeln OD Virustiter (1,19 x 10 ¹² / ml entspricht 1 OD) ^29.
8. Bündeln die Fraktionen, die> 10% der eluierten Virus (Hinweis: In der Regel die Fraktionen F3-F6). Wiederholen Sie den Test zur spektrophotometrischen Titer der gepoolten Suspension.
9. Übertragen Virussuspension in die Ampulle mit der aktivierten Metallproben (nach 2,11). Inkubieren in einer Argonatmosphäre für 1 h bei 28 ° C unter Schütteln (100-200 UpM). Hinweis: Die in diesem Schritt erhalten Ad-gebundenen Metallproben werden in den in den Abschnitten 7.5 beschriebenen Protokoll anschließende Freisetzung und Transduktion Experimente verwendet.

4. Quantifizierung der Oberflächen-assoziierten Ad-Vektor mittels PCR

1. Bereiten Sie kämmt mit oberflächenimmobilisierten Ad _eGFP über NHC, SHC, IHC und RHC (n = 3 für jeden Typ), wie in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben, angebunden formuliert.
2. Verwenden Sie eine QIAamp DNA Micro Kit, um die virale DNA zu isolieren. Zeigen die Maschen einzeln in 1,5-ml-Kunststoffröhrchen, die 200 ul einer Mischung von 180 ul von ATL b zusammenUffer und 20 ul Proteinase K (beide aus dem Kit). Fügen bekannte Menge Ad _eGFP Teilchen (als Standards für die Eichkurve) in die einzelnen Röhrchen mit dem gleichen Gemisch. Inkubation bei 56 ° C über Nacht ohne Schütteln.
3. Fügen Sie 200 ul AL-Puffer (aus dem Kit), durch Vortexen mischen, 200 ul 100% Ethanol, und bei Raumtemperatur für 5 min.
4. Übertragen der Mischung aus jedem Röhrchen auf eine einzelne MinElite Säule (aus dem Kit) und Schleudern bei 8000 UpM 1 min. Mit 180 ml frisches ALT-Puffer spülen Sie die Mesh-enthaltenden Röhrchen, fügen Sie auf die entsprechenden Spalten und drehen sich mit 8.000 Umdrehungen pro Minute für 1 min. Entsorgen Sie die Eluate.
5. Gib 500 ul Puffer AW1 (aus dem Kit) in die Spalten und Schleudern bei 8000 UpM 1 min. Entsorgen Sie die Eluate.
6. Gib 500 ul Puffer AW2 (aus dem Kit) in die Spalten und Schleudern bei 8000 UpM 1 min.
7. Entsorgen Sie die Eluate.
8. Spin bei 14.000 rpm für weitere 3 min until die Spalten vollständig trocken sind. Entsorgen Sie die Eluate.
9. Fügen Sie 50 ul MilliQ-grade Wasser in die Spalten. Spin bei 14.000 rpm für 5 min. Sammle 50 ul Eluat aus jeder Säule in einzelne Sammelrohr (aus dem Kit).
10. Vorbereitung PCR Master Mix Lösung durch Kombination der folgenden multipliziert (12,5 ul Netz SYBR Green PCR Master Mix, 0,63 ul 10 uM eGFP Sense-Primer [5'-ACG ACG GCC TAA ACA AGT TC-3 '], 0,63 ul 10 uM eGFP Anti-Sense-Primer [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG-3 '], 6.3 ul MilliQ-grade Wasser). Multiplizieren Sie diese Volumen durch die Anzahl der geplanten Reaktionen, einschließlich "keine DNA" Kontrollen.
11. Last 5 ul Ad _eGFP DNA (aus Schritt 4.8) und 20 ul PCR Master Mix in drei Vertiefungen einer MicroAmp Optical 96-Well-Platte Reaktion. Verschließen Sie die Platte mit MicroAmp Optical Adhesive Film. Drehen Sie die Platte bei 1000 rpm für 1 min, um Luftblasen zu beseitigen.
12. Die Platte in die Aufnahme eines 7500 Real-Time PCR-Engine. Im Hauptmenü des System-7500 SDS Software (v1.4 oder höher) wählen Sie "neues Experiment". Klicken Sie auf "Weiter". In der "New Experiment Wizard" wählen SYBR Green von einem Scroll-Down-Menü und klicken Sie auf "Hinzufügen". Klicken Sie auf "Weiter", um ein Layout der Platte zu bekommen. Markieren Sie alle Vertiefungen zu analysieren, wählen Sie SYBR Green. Markieren Sie nacheinander keine DNA-Kontrollvertiefungen, Anzeige _eGFP DNA-Standards und Unbekannten, und markieren Sie diese mit entsprechenden Bezeichnungen aus dem Scroll-Down-Menü.
13. Wechseln Sie auf die Registerkarte Gerät. Wählen Sie "Add Dissoziation Phase", ändern Sie die Lautstärke auch von Standard 50 ul 25 ul. Klicken Sie auf Start.
14. Analysieren PCR-Ergebnisse mit nach Überprüfung der Zusammenfassung QC für Ausreißer und Unregelmäßigkeiten.

5. Lassen Kinetik der Hydrolysierbare Kreuz-Linker-bunden Vector Teilchen aus dem Modell Stahlgitter

1. Unter Schütteln (100-200 rpm) Waschen Sie die Mesh-Proben mit Cy3-markierten Ad über RHC, IHC, SHC und NHC derivatisiert (nach 3.9) in 1% BSA / PBS (1 Std x 3).
2. Mit sterilen feinen Pinzette, legen die Maschen in einzelne Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 200 ul Elutionspuffer vorgefüllt (0,1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
3. Nehmen Fluoreszenzbilder von einem mittleren Teil jeder Masche. Erfassen die Einstellungen des Mikroskops und der CCD-Kamera zur Bildaufnahme verwendet.
4. Assay die Platte fluorimetrisch (550 _ex / 570 _em) in gut-Scan-Modus mit maximaler Reduktion. Verwenden Sie die Vertiefungen mit nicht-derivatisierten Maschen als Hintergrundkontrolle.
5. Inkubieren der Platte bei 37 ° C unter Schütteln (50 rpm).
6. Zu vorbestimmten Zeiten (1-30 Tage Bereich) absaugen Elutionspuffer ohne die Maschen zu stören und mit 200 ml frisches Elutionspuffer. Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.5 nach dem Austausch der Puffer.

6. Transduktion von Cultured Cells von Mesh-immobilisiert Ad Vektoren

1. Waschen Sie die Anzeige _eGFP - oder Ad _Luc -derivatized Maschen dreimal mit sterilem PBS für 5 min unter Schütteln (100 UpM).
2. Mit feinen sterilen Pinzette entfernen die Maschenplatten eine nach der anderen und legen Sie sie einzeln in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit dem Zelltyp von Interesse in der log-Phase des Wachstums.
3. Die Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C in 5% CO _2.
4. Verwenden Sie den entsprechenden Nicht-Terminal-Endpunkt-Assays (Fluoreszenz-Mikroskopie, Fluorometrie für eGFP oder Biolumineszenz-Bildgebung für Luciferase), um das Ausmaß und die räumliche Verteilung der Genexpression in den Brunnen zu bestimmen.
5. Optional Ersatzmedium für PBS, um die Empfindlichkeit der Fluorometrie Test (485/535 nm), wenn geringe eGFP-Expression wird erwartet, zu erhöhen. Hinweis: Wenn ein Fluorometer wird mit gut Scan-Fähigkeit ausgestattet ist, lesen Sie die Platte in einem gut-Scan-Modus, um die räumliche Verteilung von eGFP-exprimierenden Zellen in den Vertiefungen zu bewerten. Austausch PBS für mittel nach Abschluss Fluorometrie.
6. Bild die transduzierten Zellen in den Vertiefungen mit Ad _eGFP -eluting Maschen (beide zugrunde liegende und in abgelegenen das Netz) mit dem FITC-Filtersatz. Nehmen sie repräsentative Bilder bei 40-200X Vergrößerung. Erfassen die genauen Einstellungen des Fluoreszenzmikroskops und der CCD-Kamera für die Aufnahme von Bildern verwendet wird.
7. Werden 5 ul Luciferin Lager in PBS (10 mg / ml), die direkt in die Vertiefungen mit Ad _Luc -eluting Maschen zu einer Endkonzentration von 500 ug / ml und bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 10 min vor der Biolumineszenz-Bildgebung . Absaugen Medien und ersetzen mit Luciferin-freien Medien nach der Bebilderung.
8. Wiederholen Endpunkt-Assays zu vorbestimmten Zeiten (bis zu 2 Wochen), um die Kinetik der Reportergenexpression folgende Substrat-vermittelter Gentransfer zu studieren.

7. Überprüfung der Einge Transduktionsfähigkeit bei Verzögerungszeit Punkte

1. Bereiten Sie die _Ad-eGFP derivatized Maschen mit RHC, IHC, SHC und NHC für Vektor Tethering (nach 2,1 bis 2,11 und 3,1 bis 3,9) und individuell platzieren Sie die Maschen in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 60-80% konfluenten Endothelzellen der Rinderaorta (BAEC ).
2. Analysieren Übertragung von kultivierten BAEC mit Mesh-immobilisiert Ad _eGFP bei 1 und 2 Tage nach der Maschen Platzierung mittels Fluoreszenzmikroskopie und Fluorometrie (nach 6,4 bis 6,5).
3. 48 Stunden nach Beginn der Transduktion waschen die Mesh-enthaltenden Vertiefungen mit PBS zweimal.
4. Geben Sie 200 ul von 0,25% Trypsin / EDTA in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei 37 ° C unter Schütteln (100 rpm). Wasch 3x mit PBS.
5. Verwenden Fluoreszenzmikroskopie und Fluorometrie zur vollständigen Entfernung aller eGFP-positive Zellen mit den Maschen zugeordnet ermitteln.
6. Saatgut frisch agiert BAEC in die Vertiefungen mit teilweise freigegeben Maschen bei einer 60-80% anfängliche Aussaatdichte (2-2,7 x 10 ⁴ Zellen / well).
7. Inkubieren der Platte bei 37 ° C und 5% CO _{2 für vorbestimmte Zeit (1-10 Tage) vor Bewertung der "neuen" Transduktion Ereignisse durch Fluoreszenzmikroskopie und Fluorometrie.}

8. Ad-Eluting Stent Deployment in der Rattenhals Modell der Stent-Angioplastie

1. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierverfahren entsprechen der Bundesvorschriften auf Labortiernutzung und wurden von der IACUC von der Kinderklinik in Philadelphia genehmigt. Um zum aseptischen chirurgischen Bedingungen alle Instrumente Autoklaven sterilisiert halten. Um sicherzustellen, kontinuierliche Sterilität eine Perle Sterilisator zwischen Einsatz der Instrumente in bis zu fünf aufeinander folgenden Tieren beschäftigt.
2. Bereiten Ad _Luc -eluting Stents nach 2,1 bis 2,11 und 3,1 bis 3,9. Speichern der Virus-derivatisierten Stents in sterilem PBS bei 4 ° C für nicht länger als 24 Stunden vor der Verwendung.
3. Betäuben männliche Sprague-Dawley-Ratten (400-450 g) mit IP-Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg). Determine der Narkosetiefe durch Pfote Prise Antwort und Muskeltonus. Bewerben Augen Tierarzt Salbe auf Trockenheit der Hornhaut und Lederhaut zu verhindern. Hinweis: Das Inhalationsanästhesie mit 4% und 2% Isofluran (1 l / min) zur Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose, jeweils möglich, aber behindert den freien Zugang zum Halsbereich des Tieres und ist somit nicht für einen unerfahrenen Benutzer empfohlen.
4. Neubewertung der Narkosetiefe durch toe Prise. Rasur und aseptisch prep Hals und oberen Brustbereich. Antibiotikum zu verabreichen (Cefazolin, 20 mg / kg, IM), analgetische (Meloxicam, 0,5 mg / kg, SC) und Salzlösung (10 ml / kg, SC). Katheterisierung der Schwanzvene mit einer 24 G-Katheter und verwalten Heparin (200 IE / kg; IV). Hinweis: Eine Dosis von 10 mg / kg (IM) Enrofloxacin (Baytril) kann anstelle von Cefazolin verwendet werden. Zu vermeiden Verwendung von Antibiotika ohne signifikante Aktivität gegen Gram-positive Bakterien. 10-15 mg / kg Carprofen (Rimadyl) anstelle von Meloxicam als Bezugs Analgetikum verwendet werden. Analgetika (e.B. sollte Morphin, Buprenorphin) aufgrund ihrer atem Drücken Eigenschaften vermieden werden.
5. Führen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut und Halsbinde. Verwenden stumpf Techniken, um die linke A. carotis externa zu isolieren. Tie-off der A. carotis externa am meisten distalen ansprechbar Ort. Tragen Sie einen Schiebe temporäre Ligatur der Herkunft der inneren Halsschlagader.
6. Einen 2-mm-Einschnitt Arteriotomie in die linke Arteria carotis externa.
7. Legen Sie eine 2-Französisch Fogarty Katheter in die Halsschlagader durch den Einschnitt in der A. carotis externa. Pumpen Sie die Spitze des Katheters mit Kochsalzlösung und übergeben 3x aus dem Aortenbogen in die Karotisbifurkation um die Endothel entblößen.
8. Schieben Sie ein Stück Schlauch (1,04 mm Außendurchmesser, 0,99 mm ID) über den Fogarty Katheter in der Arteria carotis communis. Ziehen Sie den Fogarty-Katheter.
9. Berg-und Crimp eines _Ad-Luc -derivatized Stent über dem Ballon von einem 1,5mm-Angioplastie-Katheter. Legen Sie den Stent durch den Teflonschlauch und voran es in den mittleren Teil der Arteria carotis communis. Reiben Sie den Stent gegen das Rohr oder Behälterwand.
10. Den Stent bei 12 atm für 30 Sekunden und zieht die Angioplastie-Katheter.
11. Tie-off der A. carotis externa proximal der Arteriotomiestelle und lassen Sie die temporäre Ligatur auf der inneren Halsschlagader.
12. Reparatur der Operationswunde in Schichten mit fließendem 4.0 Vicrylnaht und heften die Haut.
13. Recover das Tier auf eine wärmende Unterlage, bis die ambulante und zu seiner isolierten Käfig. Obwohl es keine Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden werden typischerweise durch die post-operative Tiere über die ersten 12 Stunden nach der Behandlung zeigte, sollten Verlängerungs Meloxicam Therapie (0,5 mg / kg, sc täglich) für 72 Stunden.

9. Biolumineszenz-Imaging von Arterielle Gene Expression

1. Zu vorbestimmten Zeitpunkten (1 Tag - 3Wochen-Bereich) nach Gen-eluting Stent Einsatz in der A. carotis communis, betäuben die Ratte mit Isofluran Inhalationsnarkose (2-4% Isofluran in Sauerstoff).
2. Entfernen Sie die chirurgische Klammern, aseptisch vorbereiten die Website und öffnen Sie die Operationswunde. Mit stumpf, re-gain Zugriff auf der linken Arteria carotis communis und trennen sie vom Nervus vagus und den angrenzenden Bindegewebe.
3. Ein Gemisch von 50 mg / ml in PBS Luciferin und 25% Pluronic F-127 in PBS (1: 4 v / v) und speichert sie auf Eis. Anmerkung: Diese Formulierung stellt eine viskose Lösung bei 4 ° C und dreht sich sofort bei Kontakt mit dem Gewebe bei 37 ° C gelieren.
4. Gelten 200 ul einer gekühlten Luciferin / Pluronic Mischung direkt auf die freiliegende Segment der A. carotis communis und überprüfen Gel Solidität.
5. Legen Sie das Tier in Rückenlage in der bildgebenden Kammer des IVIS Spectrum-Gerät und pflegen Isofluran-Narkose mit einer Gesichtsmaske.
6. In der acquisitiauf Steuerfenster (Wohnzimmer Bild, Version 4.2 oder höher) wählen Sie die Position "B" (6.6 cm Kamera auf Abstand Objekt) und Binning-Faktor "Medium" aus dem Dropdown-Menüs mit dem Titel "Sichtfeld" und "Binning" bezeichnet. Geben Sie "2,5 cm" in der Betrefffeld Höhe. Wählen Sie "min" als Einheit der Zeit in der "Belichtungszeit" ein, und wählen Sie einen Zahlenwert von "2".
7. Drei Minuten nach der Anwendung des Luciferin / Pluronic Gel, starten Sie die Bildaufnahme durch Klicken auf die Schaltfläche "Aufnahme" auf dem Bildschirm. HINWEIS: Die Bildaufnahmezeit kann von 1 bis 6 min je nach der zu erwartenden Signalstärke.
8. Nach dem Erwerb des Bildes, waschen das Gel mit Kochsalzlösung und tupfen Sie den periarterielle Raum mit steriler Gaze und Baumwolle Applikatoren.
9. Schließen Sie die Wunde mit Vicrylnaht und heften die Haut.
10. Recover das Tier und zurück in seinen Käfig. Wiederholen Sie die Bildgebung bei später time Punkte auf den Zeitverlauf von arteriellen Expression durch den Stent immobilisiert Ad Vektoren gebracht studieren.
11. Alternativ führen Bildgebung nach einer systemischen Verabreichung von Luciferin. Betäuben und prep das Tier als pro 9.1-9.2. Katheterisierung der Schwanzvene mit einer 24 G-Katheter und sichere Katheter mit chirurgischen Band.
12. Es wird eine Lösung von Luciferin in PBS (50 mg / ml) und Injizieren von 1 ml der Lösung durch den Katheter über eine 10 Sekunden-Intervall. Eine Minute nach der Injektion beginnen Bildaufnahme nach 9,7 bis 9,8. Hinweis: Ein schneller Injektionsrate (<10 sec) kann die Anfallsaktivität und Atemstillstand zu provozieren. Das Tier muss eingeschläfert werden, wenn während der Bildgebung Anfällen oder Atemstillstand auftreten.
13. Folgen Sie Schritt 9.10.

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Ergebnisse

Vektor-Freisetzungsversuche

Anbinden von adenoviralen Vektoren in der Oberfläche von Implantaten, einschließlich interventionelle Vorrichtungen wie endovaskulären Stents, etwa der Vektor an die erkrankte Stelle, die teilweise Beseitigung der mangelnden physikalischen Zielvektoren. Jedoch um therapeutische Wirkungen über die Transduktion der Zielgewebe zu erreichen, muss der Vektor von der Oberfläche (2) freigegeben werden. Der Einsatz von hydrolysierbar...

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Diskussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine operative Methode zur Substrat vermittelt durch reversible Bindung von Adenovirus-Vektoren erreicht werden, um Oberflächen aus Edelstahl ohne Mantel Gen Lieferung. Während für den spezifischen Zweck der Stent-basierten Gentherapie von vaskulärer Restenose entwickelt hat diese Technik viel breitere Anwendungen auf den Gebieten der Biomaterialien, biomedizinische Implantate und Gentherapie.

Obwohl vorgestellten Studien wurden nur verwendet E...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
316 stainless steel mesh disks	Electon Microscopy Sciences	E200-SS
Generic 304-grade stainless steel stents	Laserage	custom order
AdeGFP	University of Pennsylvania Vector Core	AD-5-PV0504
AdLuc	University of Pennsylvania Vector Core	AD-5-PV1028
AdEMPTY	University of Pennsylvania Vector Core	A858
Cy3(NHS)2	GE Healthcare	PA23000
Sepharose 6B	Sigma-Aldrich	6B100-500ML
UV 96-well plates	Costar	3635
Fluorometry 96-well plates	Costar	3915
Cell culture 96-well plates	Falcon	353072
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Pierce Thermo Scientific	20490
Dithiothreitol (DTT)	Pierce Thermo Scientific	20290
sulfo-LC-SPDP	Pierce Thermo Scientific	21650
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax 190
Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM
Orbital shaker incubator	VWR	1575R
Horizontal airflow oven	Shel Lab	1350 FM
Centra-CL2 centrifuge	International Equipment Company	426
Digital vortex mixerer	Fisher Thermo Scientific	02-215-370
Eclipse TE300 fluorescence microscope	Nikon	TE300
DC 500 CCD camera	Leica	DC-500
7500 Real-Time PCR system	Applied Biosystems	not available
IVIS Spectrum bioluminescence station	Perkins-Elmer	not available
EDTA dipotassium salt	Sigma-Aldrich	ED2P
Bovine serum albumin fraction V (BSA)	Fisher Thermo Scientific	BP1600-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Dumont forceps	Fine Science Tools	11255-20
A10 cell line	ATCC	CRL-1476
Bovine aortic endothelial cells	Lonza	BW-6002
Luciferin, potassium salt	Gold Biotechnology	LUCK-1Ge
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
PBS without calcium and magnesium	Gibco	14190-136
Fetal bovine serum	Gemini Bio-Products	100-106
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	11540-122
DMEM, high glucose	Corning cellgro	10-013-CV
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco	25200-056
QIAamp DNA micro kit	Qiagen	56304
Power Sybr Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4360954
Cephazolin	Apotex	not available
Loxicom (Meloxicam)	Norbrook	not available
Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	not available
Ketavet (Ketamine)	VEDCO	not available
Anased (Xylazine)	Lloid	not available
Forane (Isoflurane)	Baxter	not available
Curved Moria iris forceps	Fine Science tools	11370-31
Curved extra-fine Graefe forceps	Fine Science Tools	11152-10
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Fine scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Vicryl suture (5-0)	Ethicon	J385
Suture thread (4/0 silk)	Fine Science Tools	18020-40
Michel suture clips	Fine Science Tools	12040-02
Wound dilator (Lancaster eye specula)	KLS Martin	34-149-07
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Michel suture clip applicator	Fine Science Tools	112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV catheter	Beckton-Dickinson	381412
2F Fogarty catheter	Edwards Lifesciences	120602F
Teflon tubing	Vention	041100BST
PTA catheter	NuMed	custom order
Gauze pads	Kendall Healthcare	9024
Cotton applicators	Solon Manufacturing	WOD1003
Saline	Baxter	281321
10 ml syringe (Luer-Lok)	Beckton-Dickinson	309604
1 ml syringe (Luer-Lok)	Beckton-Dickinson	309628
Clippers with #40 blade	Oster	78005-314
Transpore surgical tape	3M	MM 15271
Puralube vet ointment	Pharmaderm	not available