Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Verfahren wurde mit dem Ziel der Bereitstellung einer stabilen Arzneimittellösung über die Halsschlagader, die Pharmakokinetik von neuen Arzneimitteln in Mausmodellen zu bewerten entwickelt.

Zusammenfassung

Wenn schlägt die Verwendung eines Arzneimittels, der Arzneimittelkombination oder Arzneimittelabgabe in ein neues System, muss man die Pharmakokinetik des Arzneimittels in der Studienmodell zu bewerten. Die Verwendung von Mausmodellen sind häufig ein entscheidender Schritt in der präklinischen Arzneimittelentdeckung und Arzneimittelentwicklung ^1-8, ist es notwendig, ein System zu Drogen in Mäuse in einer einheitlichen, reproduzierbaren Art und Weise präsentieren, zu entwerfen. Idealerweise sollte das System die Entnahme von Blutproben in regelmäßigen Abständen über einen Satz Zeitverlauf ermöglichen. Die Fähigkeit, Wirkstoffkonzentrationen von Massenspektrometrie zu messen, hat Forscher gestattet, die Änderung der Plasmawirkstoffspiegel über die Zeit in den einzelnen Mäusen ^{1, 9, 10} zu folgen. In dieser Studie wurde Paclitaxel in transgenen Mäusen als eine kontinuierliche arterielle Infusion über drei eingeführten Stunden, während Blutproben wurden gleichzeitig durch retro-orbitale Blutentnahmen zu festgelegten Zeitpunkten entnommen. Arteria carotis Infusionen sind eine potenzielle Alternative zu Halsvene Infusionen, wenn Faktoren wieMammatumoren oder andere Hindernisse machen jugular Infusionen unpraktisch. Mit dieser Technik, Paclitaxel-Konzentrationen im Plasma und Gewebe erreicht ähnliche Niveaus im Vergleich zu jugulare Infusion. In diesem Tutorial zeigen wir Ihnen, wie Sie die Halsschlagader erfolgreich catheterize durch Herstellung eines optimierten Katheter für den einzelnen Mausmodell, dann zeigen, wie einzusetzen und zu sichern, den Katheter in die Maus Halsschlagader, fädeln Sie die Ende des Katheters durch die Hinter der Maus um den Hals und haken Sie die Maus auf eine Pumpe, um eine kontrollierte Geschwindigkeit der Arzneimittel Zustrom zu liefern. Mehrere geringer Lautstärke retro-orbitale Blutungen erlauben Analyse von Plasmawirkstoffkonzentrationen im Laufe der Zeit.

Einleitung

Arzneimittelinfusions durch die Carotis durch Optimieren Ausrüstung und Technik zuverlässig und reproduzierbar durchgeführt werden. Das Verfahren ist nicht kompliziert, obwohl es erfordert Feinsteuerung und Liebe zum Detail. Superior-Pflege und Geschicklichkeit erforderlich, um die Halsschlagader zu isolieren und legen Sie die Katheter, die in der Regel durch die Praxis erworben werden kann. Chirurgie von einem erfahrenen Techniker sollte eine Stunde nicht überschreiten. Nach erfolgreicher Operation sollte die Maus normal und gesund erscheinen (wenn die Maus kann die tatsächliche Arzneimittelinfusion zu reagieren) und Arzneimittel (s) in einer kontrollierten, gleichmäßigen kontinuierlichen Dosierung verabreicht werden. Blutproben müssen aus einem anderen Land als der Halsschlagader-Website entnommen werden; retroorbitale Blutentnahmen erwies sich als einfach zu sammeln und zufriedenstellende zur Analyse des Arzneimittelkonzentrationen.

Katheter der optimalen Größe und Form sind von unschätzbarem Wert bei der Durchführung einer erfolgreichen Infusion ^11. Wir fanden den Katheter zur Verfügung commercially häufig zu groß und / oder zu flexibel, um für einen bequemen Zugriff auf die Maus Karotis ermöglichen. Es erwies sich als vorteilhaft, Mode Katheter aus der Polyethylen-Schlauch verwendet werden, um die Maus zu der Infusionsspritze verbinden. Somit waren alle Schläuche, Verbinder und Nadeln der konsistenten Dimensionen, die Infusionsanordnung vereinfacht. Mit dieser Technik ist es nicht notwendig, die Spitze des Katheters in die Arterie an der Stelle, wo es immer noch sichtbar ist, und der Blutfluss in der Arteria carotis erfolgt erst, nachdem der Katheter zunächst wieder befestigt zu drücken. Dies verringert die Gefahren der Punktion der Arterie oder des mit dem Katheter herausgeschoben durch den hohen Druck des Blutflusses. Der Katheter Design hierin nicht enthalten eine "bump", um es in Position zu halten, so dass die Sicherung der Katheter auch mit Nähten und chirurgischen Band ist eine Priorität.

Infusionen können vorzuziehen, den gemeinsamen iv Bolus-Injektionen, wie eine bessere Mimik der klinischen Verabreichung vonArzneimittel wie Taxane ^{3, 12, 13} dar. Die hier beschriebene Technik wurde ursprünglich entwickelt, um die Infusion in Mausmodellen ermöglichen, wobei Zugriff auf die Vena femoralis oder durch Mammatumorwachstum und / oder übermäßige Gefäßbildung des Einführungsbereichs ausgeschlossen. Dieses Verfahren kann oft zweckmäßig sein, auch in tumorfreien Mäusen: Obwohl die Isolierung und Katheterisierung der Halsschlag etwas mehr invasive, fanden wir es bevorzugt, die Drosselvene, weil die Neigung der Vena Wand in mehreren ausgefallenen Insertionen und Ausfälle zu vervollständigen Folge rip die 3 Stunden Zeitverlauf.

Während die hier gezeigten Ergebnisse sind von C57BL / 6J (Inhouse-bred) Mäusen, haben wir diese Technik verwendet, um erfolgreich einzuflößen Paclitaxel in mehrere Stämme von Mäusen, einschließlich FVB und Mixed-Stämme, um die Pharmakokinetik in Mausmodellen transgen manipuliert folgen um nach unten zu regulieren zelluläre Transporter Funktionen. Die Blut- und Gewebeproben gesammelt zeigten erwartete Niveau von paclitaxel, im Bereich der Werte nach jugulare Infusionen ¹ ersichtlich. Diese Technik kann voraussichtlich in anderen Mausmodellen und mit anderen Infusionslösungen gleich gut funktionieren.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Fox Chase Cancer Center Institutional Animal Care und Use Committee und von der Versuchstierhaltung genehmigt worden, und die in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts für humane Behandlung von Tieren sein.

1. Vorab Vorbereitung

1. Herstellung von Katheter: Vorbereiten eines Katheters aus einer kurzen Länge von Polyethylenschlauch, modifiziert, um eine verdünnte, abgestumpfte Ende (3A) zu bilden. Machen Sie mehrere Katheter im Voraus und sparen auf unbestimmte Zeit.
   1. Zünden Sie eine Bunsenbrenner, und stellen Sie eine niedrige stetige Flamme zu etablieren. Halten Schlauch der Nähe von Flammen zu Polyethylen erweichen. Wenn Schläuche zu schmelzen beginnt, langsam auseinander ziehen die beiden Enden um einen verdünnten Schlauchabschnitt, etwa 0,25 mm OD erstellen.
   2. Schneiden Sie ein abgeschrägtes Ende etwa 0,75 cm entlang Dünnschliff. Dies stellt sicher, genug Schläuche in Arterie befestigt werden, ohne dass eine überlange Katheters.
      HINWEIS: Eine lange dünne Ende auf the Katheter hat eine Neigung zu verstopfen. Eine übermäßig lange Ende kann auch genügend Flüssigkeit zu halten, um Flüssigkeitsvolumenkapazität des Katheters wesentlich ändern.
   3. Blunt die abgeschrägte Ende durch schnelles Durchlaufen der Flamme - wenn sie richtig erhitzt, wird das Ende leicht abgerundet und erweitert. Die Spitze Haken leicht zurück, das hilft zu verankern Sie den Schlauch beim Einführen in die Arterie.
   4. Schneiden Sie den Schlauch 6,0 cm von dem Punkt, wo es um dünne beginnt. Das macht einen sehr überschaubar Katheter, also lange genug, um bis zum Austritt aus dem Hals fädeln und zu halten und arbeiten mit komfortabel, aber kurz genug, um die Maus vom nagt an Schlauchüber oder erfordern zu viel zusätzliche Infusionsvolumen um anfängliche Salz löschen verhindern .
   5. Bereiten Sie eine Spritze von etwa 0,2 ml Heparin-Lösung, gekrönt mit einem stumpfen Nadel. Die Nadel in das breite Ende des Katheters (3B). Füllen Katheter mit Heparin, wobei Sie darauf achten, um sicherzustellen, dass es keine Luftblasen inder Schlauch. Stellen Sie die Heparinspritze und Katheter beiseite auf einem sterilen Bereich. Katheter sterilisiert durch Gamma-Bestrahlung, indem Katheter (s) in einer Petrischale, und Aussetzen an 20 Gy Gammastrahlung. Wenn Sie keinen Zugang zu einer Gammastrahlungsquelle, mit Ihrem Tieranlage, andere Mittel der Sterilisation, wie Gas- oder chemischen Sterilisation zu untersuchen. Nicht autoklavieren, wie Polyethylen kann nicht hitzesterilisiert werden.
2. Schaffung einer Salz Leitung (3B).
   1. Bereiten Sie eine zweite Spritze von etwa 0,5 ml steriler Kochsalzlösung, wobei Sie darauf achten, eine blasenfreie Linie zu gewährleisten.
   2. Schneiden Sie ein zweites Rohrstück, ca. 15 cm, und rutschen auf den abgestumpften Spritzennadel. Bringen Sie einen Steckeranschluss an das freie Ende des Schlauchs.
   3. Testen Sie, dass Strom von Kochsalzlösung ist unbehindert durch reibungslos voran ein kleines Volumen Kochsalzlösung durch die Leitung. Verwenden Sie diese Salz Führung nach Einführen des Katheters, um die Strömung durch überprüfender Katheter und die Leitung von Blut zu spülen. Stellen Sie die Kochsalzspritze beiseite auf einem sterilen Bereich.
3. Vor der Operation, Sterilisieren durch Autoklavieren Maschinen, oder auch durch Gassterilisation oder Sterilisation Glasperle.
4. Bereiten sterilen OP-Bereich.
   1. Wischbank und Mikroskop Oberflächen mit Desinfektionsmittel, wie 70% Ethanol oder Chlordioxid. Bedecken Bank und Mikroskopbasis mit einem sauberen Einweg, saugfähige Unterlage.
   2. Vorbereitung einer chirurgischen Platte durch Abdecken mit zwei Schichten sauberes, saugfähiges Papier, fest mit einem Klebeband befestigt.
5. Legen Sie alle chirurgische Versorgung (wie in Materialliste zugeordnet), so dass sie leicht zugänglich sind.
   1. Cut drei Längen steriles Naht, je 8 cm, und beiseite mit anderen Lieferungen eingestellt. Platzieren Sie einen Hafen, in dem es leicht verfügbar sein (3B).

2. Chirurgie

1. Vorbereitung der Tiere
   1. Anesthetize Maus durch Exposition gegenüber 2-3% Isofluran in der Anästhesie Kammer Präzision Verdampfer verbunden. Zurückzutreten Maus aus der Kammer, und rasieren Haare von der Maus Hals / Oberkörper, und unter dem rechten Ohr (Ort der Katheter Ausfahrt). Verwalten Veterinär Petrolatum Augensalbe die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Stellen Sie sicher, das Tier nicht bei chirurgischen Präparate erwecken, indem Maus genügend Zeit in der Inhalationskammer vor prep (mindestens zwei Minuten), oder durch die Gabe von Isofluran zu Maus mittels einer Nasenkegel während prep. Rück Maus Anästhesie Kammer.
   2. Wenn die Maus ausreichend inert, bewegen, um sterile OP-Bereich, legen Anästhesie Nasenkegel über die Maus die Nase und Mund, und lenken den Fluss von Isofluran zu Nasenkegel. Überprüfen Sie die Betäubung durch Kneifen Pfote mit einer Pinzette; wenn die Maus zeigt keine Reaktion, mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   3. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken, mit dem Kopf zugewandtenErmittler. Sichern Sie sich die Ohren, Vorderpfoten und Hinterpfoten, um chirurgische Bord mit Klebeband oder andere Rückhaltevorrichtung, die Maus ruhig zu halten. Reinigen der Schnittbereich mit Povidon-Jod und 70% Ethanol.
2. Isolierung von der Halsschlagader
   1. Stellen eine 1 cm in Längsrichtung des rechts der Mittellinie des Halses geringfügig abgeschnitten. Verwenden einer Pinzette, um Fett und Muskeln, um die Luftröhre (4A) aussetzen zu trennen. Lokalisieren der Halsschlagader, die parallel zu der Luftröhre (4B).
   2. Vorsichtig verwenden Pinzette separaten Faszie über der Arterie (4C). Leicht ziehen Sie den Vagusnerv abgesehen von der Carotis, und legen Pinzette in den Raum zwischen. Sanft offenen Zange, um eine Lücke in der Faszie so weit wie möglich (mindestens 3 mm) zu erstellen, und ziehen weg den Nerv von der Arterie, von der Gabel in der Arterie in der Nähe des Kehlkopfes (Vorderende), bis (posterior) ( Figur 4D).
   3. Deaktivieren Sie jegliche Wieder entferntRest Faszie bis die Arterie ist gut isoliert (4E). Fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung in die OP-Bereich gelegentlich Gewebe feucht, und somit weniger spröde und weniger anfällig für Reißen zufällig halten.
3. Nahtplatzierung und Arterie Vorbereitung für Kathetereinführung (4, 5).
   1. Verwenden einer Pinzette, um einen Seidenfaden Faden unter der Arterie zu ziehen. Binden Sie einen sicheren Knoten so weit schließen Sie die Arterie in Richtung der vorderen wie möglich (4F).
   2. Zeichnen Sie einen zweiten Faden unter der Arterie. Binden Sie eine versenkbare Knoten vorübergehend schließen Sie die Arterie so weit in Richtung des hinteren wie möglich (4F).
   3. Zeichnen Sie eine dritte Faden unter der Arterie. Binden Sie einen sehr lockeren Knoten zwischen den ersten beiden Nähte, um verwendet werden, um schnell zu sichern, den Katheter nach der Platzierung (4G) werden.
   4. Halten Enden aller Nähte aus dem Weg durch Benetzen sie mit etwas 70% igem Ethanol.
4. Kathetereinführung
   1. Mit der Naht, greifen die unteren Knoten die Arterie leicht gespannt zu ziehen. Nick die Arterie oberhalb, aber sehr nahe an der vorderen Naht (4H). Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief zu schneiden, sondern prüfen Sie den Schlitz, um sicherzustellen, dass die Öffnung frei ist.
   2. Entfernen Heparin gefüllte Katheter aus Spritzennadel, um zu vermeiden, versuchen große Lufttaschen an jedem Ende. Manipulieren des Katheters an Kegel in einem bequemen Winkel positionieren, in der Regel nach unten und leicht nach rechts (für Rechtshänder).
   3. Während das Festhalten an der Naht, um die Arterie zu halten verbleibenden leicht gespannt, schieben Sie Katheter in Schlitz (4I). Verwenden Sie die Pinzette, um die vordere Naht zu halten und ziehen Sie die Arterie nach unten über Katheter (Hochschieben mäßig mit dem Katheter kann die abgeschrägte Ende führen, um die Arterie zu punktieren). Vorsichtig lösen, den Katheter und vorderen Naht.
5. Sicherung des Katheters und die Einleitung des Blutflusses (Figuren 4J, 5B).
   1. Sichern Sie den Katheter durch Anziehen der Knoten der Mittelnaht, in der Nähe zum Eingang des Katheters in die Arterie. Einen engen Dreifach Knoten, aber sicher sein, so eng, nicht zu ziehen, um die Strömung durch den Katheter zu behindern. Weiter zu sichern, den Katheter durch das Binden ihn mit der vorderen Naht, unterhalb des Eingangs der Arterie.
   2. Befestigen Sie die Kochsalzlösung führen zu den Katheter mittels der Anschlussstecker, wieder versuchen zu vermeiden, die Einführung von Luftblasen in der Leitung.
   3. Fassen Sie die Enden der hinteren Naht und ziehen, um den Knoten zu lösen. Manövrieren des Fadens auf der Arterie, über das Ende des Katheters (nicht den Faden zu entfernen). Blut sollte in den Katheter zu fließen; wenn es keinen Blutfluss sanft wackeln Katheters zu versuchen, die Verengung zu beseitigen.
   4. Wenn die Strömung scheint offen, verwenden Sie den letzten Faden (von der hinteren Naht), eine zusätzliche Knoten zu binden, etwas oberhalb der Mitte Naht.
6. Temporary Abdichtung Katheters. Spülen Sie den Katheter von Blut, dann verwenden Sie eine Gefäßklemme, um das Ende des Katheters in der Nähe der Anschlussstecker klemmen. Ziehen Sie den Stecker und ersetzen Sie es mit dem Anschluss-Stecker zur Abdichtung des Endes des Katheters, und entfernen Sie die Gefäßklemme.
7. Neupositionierung Katheter von Nacken zu verlassen.
   1. Mit einer Pinzette in jeder Hand, verwenden Sie eine Pinzette, um mit dem Katheter gerade unterhalb der vorderen Naht zu halten, und mit der anderen, und drücken Sie einen Knick in den Katheter, so dass es leicht zur Seite biegen. Wiederholen, um einen zweiten Knick erstellen. Dies ermöglicht das freie Ende des Katheters in Richtung der Rückseite des Kopfes des Maus gezogen werden, ohne dass die Spitze des Katheters, um seitlich gegen die Wand der Arterie zu machen.
   2. Drehen Sie die Maus auf seiner Seite (links), halten die Nasenkegel über den Mund und die Nase positioniert, und reinigen Sie den Schnittbereich mit 70% Ethanol und PVP-Jod. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 4 mm) unter und hinter dem rechten Ohr.
   3. Verwenden einer Pinzette, um die offene Klappe der Haut zu halten, während der Arbeit das stumpfe Hohlsonde unter die Haut, um einen Kanal durch die Wange zu erstellen, um den Hohlraum am Hals. Es ist ratsam, die Sonde um die Speicheldrüsen, anstatt zu versuchen, zwischen der Verschraubung und der Haut gehen bringen. Verwenden einer Pinzette, einen Raum für die Sonde zu verlassen sorgfältig zu befreien.
   4. Fädeln Port Stecker / Katheter durch Sonde in den Hals zu verlassen. Zu hart Ziehen Sie nicht; sicher sein, wird der Katheter nicht Zerkleinern oder Verengung der Blutgefäße oder Organe.
8. Schließung und Wiederherstellung. Verwalten topische Schmerzmittel (zB Bupivacain) an der Schulter Einschnitt, und bedecken Sie die Wunde mit wasserdicht, chirurgischen Klebeband. Tragen Sie eine zweite Stück Klebeband, um den Katheter weiter zu sichern.
   1. Verwalten aktuelles Analgetikum zur Brust Einschnitt und nahen Wunde mit Seide oder Heftklammern.
   2. Entfernen der Maus aus der Narkose und ermöglichen Tier in einem sauberen erholen, erwärmt Raum (Ort Käfig auf einem Heizkissenoder unter einer Wärmelampe), für mindestens 30 min.

3. Infusion

1. Vorbereitung Aliquots von 5 mg / ml Lösung von Paclitaxel / Methanol.
   1. Messung 50 mg Paclitaxel in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. 10 ml sterile Methanol. Röhrchen verschließen. Drehen von Hand oder auf einem Rotationsschüttler bei Raumtemperatur, bis das Pulver aufgelöst ist.
   2. Aliquoten 500 ul Lösung in 20 kleinen, gefrierfest Rohre, und bei -20 ° C.
   3. Thaw einzelnen Aliquot bei Raumtemperatur oder in 37 ° C Wasserbad, unmittelbar vor der Infusion.
2. Bereiten Sie die Infusionspumpe (Abbildung 6).
   1. Schneiden Sie eine große Länge des Polyethylenschlauch von ca. 40 cm. Bringen Sie einen abgestumpften Nadel an einem Ende und einem Steckeranschluss auf der anderen Seite.
   2. Auszuarbeiten Medikament in eine Spritze mit einem bekannten Innendurchmesser (die meisten programmierbare Pumpen wird der Durchmesser des Spritzenzylinders erforderlich, um die Geschwindigkeit zu berechnen the Pumpen Arm). Bringen Sie die Nadel auf die Spritze und laden Sie das Medikament durch die Nadel und Schläuche.
   3. Ordnen die Spritze in die Pumpe nach den Anweisungen des Herstellers. Prime die Pumpe, so dass das Medikament glatt aus dem Anschlussstecker fließt, und es ist bereit für die Infusion ist.
3. Befestigen Sie Maus, um zu pumpen.
   1. Halten Sie die Maus stetige und nutzen die Gefäßklemme an Katheter, nahe dem Hafen Steckklemme. Ziehen Sie den Stecker und ersetzen mit dem Anschluss an die Spritze und Schlauch angebracht.
      HINWEIS: Blut kann beginnen, wieder durch das Rohr fließen.
   2. Schnell zu verwalten eine schnelle Pumpe, um das Volumen des Katheters zu löschen (empirisch durch Beobachtung der Volumen von 6 cm Schlauch berechnet) und unmittelbar danach auf die gewünschte Infusionsgeschwindigkeit zu schalten.
4. Weiter Paclitaxel-Infusion für 3 Stunden Zeitverlauf.
   1. Überwachen Schlauch gelegentlich Undichtigkeiten an Verbindungsstellen zu überprüfen, wie dies oft ein Zeichen einer Verstopfung in Strömungs an der Maus.Beobachten Sie die Maus für die erwartete oder unerwartete Reaktionen auf Infusion (Lethargie oder Hyperaktivität, Anzeichen von Unwohlsein).
   2. Je nach Länge und Art der Infusion, könnte die Maus nicht essen und trinken, aber sicher sein, um den Zugang zu Nahrung und Wasser nach etablierten Politik der Institution zu schaffen. Seien Sie sich der potentiellen zur Dehydratisierung der Maus durch die Sammlung großer Mengen von Blut.
   3. Fahren Sie mit dem Käfig warm mit einem Heizkissen oder Lampen halten, es sei denn, die Maus scheint wünschen, weg von der Hitze bleiben. Wenn Tier nicht innerhalb weniger Stunden nach der Operation getötet, umsetzen Plan zur postoperativen Behandlung von tierischen, einschließlich sterile Wohnbedingungen und Behandlung für postoperative Schmerzen.
   4. Halten Sie ein wachsames Auge auf die Maus, vor allem in den ersten paar Minuten, um es zu gewährleisten, nicht herausziehen, den Schlauch durch Hyperaktivität, oder Reizung von Schlauch (was ein Zeichen für eine schlechte Insertion sein kann). Wenn die Maus nicht über-aktiv, konstante monitoRing nicht notwendig sein, aber überprüfen Sie die Maus routine sicher sein, das Tier nicht in den Schläuchen verheddern. Gurt und Haltegurt-System sind im Handel erhältlich, aber ihre Verwendung ist nicht Gegenstand dieses Protokolls.
5. Entnahme von Proben.
   1. Sammeln Sie Blutproben in regelmäßigen Abständen durch submandibular oder retro-orbitale Blutungen (Wenn Ihr Protokoll nicht nutzen Mammatumormodelle, betrachten Gewinnung von Blut über eine Jugularkatheter zugleich als der Halsschlag Katheter eingeführt). Achten Sie darauf, auf der Infusionsleitung zu ziehen. Wenn das Sammeln durch retroorbitale Blutungen, leicht betäuben die Maus mit einem Inhalationsnarkosemittel (zB Methoxyfluran) so braucht man sich nicht durch das Genick zu packen, um die Maus zu sichern.
   2. Spin Blut in hemocrit Zentrifuge Blutkörperchen aus dem Plasma zu trennen. Verwenden Sie eine Datei oder einen diamant Filzstift auf Rohr an Gesicht der Phasentrennung zu erzielen. Brechen Rohr und sammeln Plasma nur in kleine, Gefrierschrank Tresorrohr. Lagern bei -80 ° C bis zur Analyse.
      HINWEIS: Wenn ein hemocrit Zentrifuge nicht verfügbar ist, übertragen Blutprobe in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin in einer Mikrozentrifuge bei hoher Geschwindigkeit, um Blutzellen von Plasma zu trennen. Sammeln Plasma in einem zweiten Rohr, und bei -80 ° C.
   3. Euthanize Maus durch CO ₂ Ersticken. Sammeln Gewebe (etwa 20 bis 50 mg) aus Organen von Interesse und Blitzeis in flüssigem Stickstoff. Bei -80 ° C bis zur Analyse.

4. Probenanalyse

Anmerkung: Alle Proben wurden für dieses Protokoll durch eine Außen Labor durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC - MS / MS), der berechnet die Paclitaxel-Konzentrationen wie folgt:

1. Extrahieren von Paclitaxel aus Proben. Homogenisierung Gewebeprobe in 0,1% Essigsäure, 50% Methanol vor der Extraktion. Extrahieren von Paclitaxel durch Flüssig / Flüssig-Extraktion mit Methyl-tert-butylether (MTBE) mit einem internen analogen (Docetaxel) Standard angereichert. Entfernen MTBE und trockenen Proben. Resuspendieren in 50% Acetonitril, 0,1% Essigsäure-Lösung.
2. Bereiten Kalibrierungsstandards. Hinzufügen einer bekannten Konzentration von Paclitaxel an C57BL / 6-Matrix angebracht, eine abschließende Reihe von Standards (von 1 bis 20.000 ng / ml für die Plasmaproben für Gewebeproben, von 0,1 bis 5000 ng / ml) zu erhalten. Auszug Standards in zweifacher Ausfertigung, mit der gleichen Methode wie für die Studie Proben oben. Messen Paclitaxel Peak in Proben durch HPLC / MS / MS unter Verwendung von Elektrospray-Ionisierung.
3. Berechnen Konzentration unter Verwendung des Flächenverhältnisses von Paclitaxel an interner Standard. Verwenden Kalibrierungsstandards, um eine Standardkurve interpoliert und Lernmuster durch Passung auf der Kurve zu erstellen. Normalisieren Konzentration Studie Proben durch das Ausgangsgewicht der Probe vor der Homogenisierung.

Ergebnisse

Paclitaxel Verteilung folgt vorhersagbaren Muster während 3 h Dosierung einer 15 min Hochgeschwindigkeits-Infusion, gefolgt von einer 165 min niedriger Geschwindigkeit Infusion.

Abbildung 1 zeigt einen Vergleich der Jugularvene Infusion Plasmakonzentrationen von Paclitaxel und Karotis-Infusionen. Die Paclitaxel-Konzentrationen fallen schnell in den ersten 15 min nach einer anfänglichen hohen Volumen Infusion, und dann einpendeln in den nächsten 150 min. Zum Vergleic...

Diskussion

Arteria carotis Infusion ist eine bedeutende Technik in dieser Studie von Paclitaxel Pharmakokinetik. Arteria carotis Infusion ist eine Methode, um schnell Droge verteilen im ganzen Kreislaufsystem ^14. Die 3 h Infusion ist eine engere Mimetikum der klinischen Verabreichung von Arzneimitteln, wie Taxane als Bolusinjektionen. Die Operation kann zuverlässig von einer einzelnen Person durchgeführt werden, ist eine Operation Zeit relativ kurz und Erfolgsraten> 75%. Nachdem die Proben gesammelt werden, müssen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID	Braintree Scientific, Inc.	PE10
3 Blunted needles (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	NB-30
Stainless steel port plug (28 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	PP-28	Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.
2 Stainless steel connector plugs (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	C-30
Three 1 cc syringes	Becton, Dickinson and Co.	309659
Sterile 0.9% Saline solution	Hospira	0409-7984-37
Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution	Braintree Scientific, Inc.	HGS
Silk suture	Braintree Scientific, Inc.	SUT-S 113
Vanna Scissors (micro-scissors)	World Precision Instruments	14122	This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.
Hartman Mesquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	501705
Betadine Swabsticks	Perdue Products L.P.	BSWS1S
Bupivacaine	Hospira	0409-1160-01	May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.
Paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized	Fisher Scientific	22-362-566
Micro Capillary Tube Sealant	Fisher Scientific	02-678
C57BL/6J mice	Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred
API 4000 Q-Trap mass spetrometer	Applied Biosystems