Bodenproben und Isolierung von Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Zusammenfassung

Nematoden sind Bodenbewohner-Rundwürmer, die eine Vielzahl von Insekten parasitieren. Wir zeigen, Stichprobenverfahren zur Isolierung dieser Nematoden aus dem Boden mit zwei Techniken: das Insekt Hetze und die modifizierte Weiß Falle, für die Gewinnung von Nematoden aus Bodenproben und infizierten Insektenkadaver auf.

Zusammenfassung

Nematoden (aka EPN) stellen eine Gruppe von Bodenbewohner-Nematoden, die eine Vielzahl von Insekten parasitieren. Diese Nematoden gehören zu zwei Familien: Steinernematidae und Heterorhabditidae. Bisher wurden mehr als 70 Arten in der Steinernematidae beschrieben worden, und es sind etwa 20 Spezies in der Heterorhabditidae. Die Nematoden haben eine Partnerschaft mit mutualistic Enterobacteriaceae Bakterien und zusammen sind sie als starke insektizide Komplex, der eine Vielzahl von Insektenarten tötet handeln.

Hierbei konzentrieren wir uns auf die am häufigsten verwendeten Techniken zum Sammeln von EPN Boden betrachtet. Der zweite Teil dieser Präsentation konzentriert sich auf die Insekten-Hetze Technik, einer weit verbreiteten Ansatz für die Isolierung von EPN aus Bodenproben, und die modifizierte Weiß-Trap-Technik, die für die Wiederherstellung dieser Nematoden aus infizierten Insekten verwendet wird. Diese Methoden und Techniken sind wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kultnahmen im Labor und auch die Grundlage für andere Biotests, die diese Nematoden als Modellorganismen für die Forschung in anderen biologischen Disziplinen zu betrachten. Die in dieser Präsentation gezeigten Techniken entsprechen denen, durchgeführt und / oder entworfen von Mitgliedern der SP Auf Labor sowie diejenigen, die von verschiedenen Autoren beschrieben.

Einleitung

Viele Nematoden mit Insekten verbunden, und ihre Wirt-Interaktionen reichen von Vorteil für schädlich. Hierbei konzentrieren wir uns auf eine Gruppe von Nematoden, die Krankheitserreger von Insekten sind, die auch als Nematoden (oder EPN) bekannt. Zwei Familien Nematoden gehören zu dieser Gruppe von Nematoden: Steinernematidae und Heterorhabditidae ^11,13. Die pathogene Wirkung ist in der Tat durch ihre Interaktion mit fakultativ anaeroben Darmbakterien (Bakterien Xenorhabdus assoziieren mit steinernematids und Bakterien Photorhabdus assoziieren mit heterorhabditids) ^{2 erlassen.} Die Bakterien werden von einem Host zu einem anderen Insekt von der einzigen frei lebenden Nematoden-Bühne, der dritten Stufe infektiöse juvenile (auch als dauer jugendlich, Jugend-oder Infektions IJ bekannt), die in der Erde lebt vektorisiert. Einmal in der Insekten, die Nematoden lösen die Bakterien in die Hämolymphe der Insekten, die die Insekten-Wirts durch massive Blutvergiftung zu töten. Die Bakterien auchdes Insekts Gewebe abbauen und sich der Nematoden Nahrungsquelle, so dass sie, um zu reifen und sich zu vermehren. Üblicherweise werden eine oder zwei Generationen wachsenen Nematoden im Insekten kadaver hergestellt. Die Nachkommen der letzten Erwachsenengeneration reassoziiert mit ein paar Bakterienzellen in eine Art und Weise zu spezialisieren, als ihre bisherigen Ernährungs Beziehung, und pflegen diese Zellen im Darm, als sie aus bewegen sich von der Insekten-Kadaver in den Boden, wo sie andere Insekten parasitieren zu erwarten ^6,11,14 (Abbildung 1).

Seit ihrer Entdeckung im Jahre 1927, EPN wurden als wertvolle Alternativen zu chemischen Pflanzenschutzmitteln, da sie eine Vielzahl von Insekten, die landwirtschaftliche Schädlinge ^3,4,5 sind parasitieren. Doch in den letzten zwei Jahrzehnten, diese Nematoden und ihre symbiontischen Bakterien wurden als formbar Modellsystem zur Untersuchung der biologischen, ökologischen und evolutionären Aspekte der Wirt-Mikroben-interactio anerkannt¹⁴ ns.

Das Ziel dieser Präsentation ist es, die Methoden und Techniken, die am häufigsten für Bodenproben und die Isolierung von EPN eingesetzt zu zeigen. Eine Vielzahl von Werkzeugen zur Verfügung und kann für das Sammeln von Bodenproben verwendet werden, einschließlich: Boden Loten, Spachtel, post-Erdbohrer, Schnecken, Probenahmerohre, Handschaufeln, unter anderem (Abbildung 2).

Je nach Zweck der Untersuchung können zwei Verfahren für die Probenahme berücksichtigt werden: a) geschichtet, b) Zufallsauswahl (Fig. 3). Die geschichtete Stichprobe wird üblicherweise als Teil einer intensiven Studie in einem bestimmten Bereich oder abgegrenzt über einen bestimmten Zeitraum verwendet wird. Im allgemeinen wird ein transect abgegrenzt und Bodenproben werden in festgelegten Abständen in der transect über einen Zeitraum (3A) ¹⁵ genommen. Die Zufallsstichprobe wird in der Regel eingesetzt, wenn die sich auf ein weites Gebiet. Dieses Probenahmestrategie ist für die Untersuchung der Vielfalt der EPN f verwendetrom einen großen geographischen Bereich oder die Region (3B) ^12. Je nach Schwerpunkt der Studie, die eine breite Palette von Höhen-, Boden-Texturen und Lebensräumen (z. B.., Feldern, Wäldern, Wiesen, Parks, Stränden, Uferbereiche, etc.) kann eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden.

Wir zeigen die Insekten-Hetze Technik, die ursprünglich von Bettwäsche und Akhurst ¹ beschrieben wurde, und stellt eine einfache und selektive Alternative für die Wiederherstellung EPN von Bodenproben. Dies ist ein selektives Verfahren, das auf der Prämisse, dass die Nematoden (IJ-Stufe) wird zu einem Insektenwirtszogen werden und parasitieren sie basiert. Diese Technik kann auch zur Isolierung von anderen Insektenpathogene wie Pilze, Bakterien und ^8,10 zu berücksichtigen.

Wir haben auch die modifizierte Weiß-Trap-Technik, die für das Abrufen von Nematoden Nachkommen von infizierten Insekten ^7,14 Hosts verwendet wird, zu demonstrieren. Dies ist eine mühe erfüllthod, die den Vorteil von Abrufen einer "sauberen" Nematoden Nachkommen frei von Schmutz von den erniedrigenden Insektenkadaver bietet.

Schließlich sind die beschriebenen und in diesem Artikel gezeigt Techniken entsprechen denen konzipiert und / oder im Labor als auch solche mit verschiedenen Kollegen und Mitarbeitern beschrieben.

Protokoll

1. Bodenprobenentnahme

1. Betrachten Sie die eine Mindestfläche von 2 - 4 m ² für jede Probennahmestelle.
2. Sammeln von Bodenproben in einer Tiefe von mindestens 15 cm (Fig. 4).
3. Nehmen Sie sich mindestens fünf Stichproben in diesem Bereich.
4. Nehmen Sie 3 Teilproben pro Probe. Je nach Ziel der Studie entweder kombinieren die Teilstichproben oder bewahren Sie diese getrennt.
5. Platzieren Sie jede Probe in einem Plastikbeutel. Betrachten Doppel Absacken zu Austreten von Proben (Abbildung 4) zu vermeiden.
6. Label-Proben mit einem wasserfesten Filzstift. Fügen Sie die folgenden Informationen von jeder Probenahmestelle: Site-Informationen (einschließlich Ort / Raum / Site-Namen und GPS-Koordinaten-Informationen), Datum, Lebensraum, verbunden Vegetation, Temperatur, Höhe, usw.
   HINWEIS: Falls zutreffend, sammeln und / oder aufzeichnen die Anwesenheit von Insekten oder anderen Wirbellosen mit der Probe zur späteren Identifizierung gesammelt. Sie können potenzielle natur stellenal EPN Gastgeber.
7. Saubere Sammel Werkzeuge zwischen den Proben durch gründliches Waschen mit Wasser und / oder Desinfektions sie mit 70% Ethanol oder 0,5% Bleichmittel-Lösung.
8. Halten Proben in einem Kühler (8-15 ° C) während des Transports zum Labor.
9. Nehmen Sie einen Teil der Bodenprobe für die Analyse von Informationen über Bodenbeschaffenheit, Beschaffenheit, Feuchtigkeit, elektrische Leitfähigkeit oder andere gewünschte Bodenparameter zu erhalten.

. 2 Nematode Isolierung aus Bodenproben: Insect-Hetze Technik

1. Entfernen Sie alle Fremdkörper (dh., Steine, Holzstücke oder Rinde, Blätter, etc.) Mit Ihren Proben gesammelt, um eine Kontamination mit Mikroorganismen saprobischen vermeiden.
2. Fügen Sie Wasser, um den Boden zu befeuchten und die Bewegung der Nematoden zu erleichtern.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Sprühflasche, um die Feuchtigkeit der Erde langsam zu erhöhen.
3. Es werden ca. 200 bis 250 ml feuchten Boden an einem sauberen Kunststoffbehälter mit einem Deckel.
4. In Insektenköder. Betrachten 5 bis 10 Insekten an der Bodenoberfläche jeder Probe (Abbildung 5).
5. Bedecken Sie den Behälter mit einem Deckel und schalten Behälter auf den Kopf.
6. Aufrechterhaltung Behälter im Dunkeln bei RT (es mindestens 22 - 25 ° C).
7. Prüfen Behälter alle 2 - 3 Tage und entfernen abgestorbene Insekten.
   HINWEIS: fügen Sie zusätzliche gesunde Insekten zu jedem Behälter zur weiteren Hetze der Bodenprobe.
8. Entfernen tote Insekten aus den Behältern. HINWEIS: Cadavers mit einem braunen oder ockerfarbenen Färbung in der Regel durch steinernematids parasitiert, während ziegelrot bis dunkelviolett Leichen werden von heterorhabditids parasitiert.
9. Spülen Leichen in sterilem Wasser.
10. Zeigen Leichen in einem modifizierten Weiß Falle zur Rückgewinnung von Nematoden Nachkommen (siehe Verfahren unten).

. 3 Nematode Erholung von Infected Cadavers: Modifizierte Weiß-Falle

1. Setzen Sie die Spitze einer 50 (oder 60) mm Durchm. Petrischale in eine größere Schale (100 mm).
2. Stellen Sie eine SündeGLE kreisförmigen Filterpapier (Whatman Nr. 1) in der kleineren Schale.
3. Platz Leichen auf dem Filterpapier des kleineren Gericht dafür, dass Leichen nicht gegenseitig berühren, um Verunreinigungen zu vermeiden.
4. Füllen Sie den äußeren (größeren) Petrischale mit ca. 20 ml steriles destilliertes Wasser. Kein Wasser in der Schale, die die Leichen hält nicht hinzu.
5. Decken Sie die große Petrischale und seinen Inhalt mit dem Deckel (Abbildung 6).
6. Beschriften Sie Gerichte entsprechend. Fügen Sie die folgenden Informationen: Name Nematode (Art / Isolat), Infektion (Datum Infektion wurde gesetzt) ​​und Trap-Datum (das ist das Datum, die Falle aufgestellt).
7. Halten Falle bei RT bis Entstehung von Infektionsjugendstadien (IJ) auftritt. 25 Tage abhängig von der Nematodenarten und / oder Belastung betrachtet - Dieser Prozess kann zwischen 10 nehmen.
8. Ernte mit Wasser IJs durch Entfernen des größeren Spiegel der Falle und gießt Wasser mit Nematoden in ein Becherglas.
9. Nematoden ermöglichen, um den Boden der Dekantier-bEaker. Dieser Vorgang kann einige Minuten dauern.
10. Gießen Sie Wasser sorgfältig darauf achten, Nematoden im Boden des Bechers zu bleiben.
11. Nematoden spülen, indem mehr Wasser und ermöglicht Nematoden zu dekantieren. 3-mal, bis das Wasser ist sauber - Dieser Schritt kann 2 wiederholt werden.
12. Platzieren Nematodensuspension in einer Gewebekulturflasche (250 ml). Halten Konzentration der Suspension auf 1000 - 3000 Nematoden / ml.
13. Speicher Kolben mit Nematodensuspension in einem Kühlraum oder Brutschrank zwischen 10 - 20 ° C.
    Hinweis: Überprüfen Sie gespeichert Kolben periodisch Haltbarkeit von EPN ist variabel. Normalerweise steinernematids kann für 6 gespeichert werden - 12 Monate ohne die Notwendigkeit von Subkultur, während heterorhabditids kann mehr regelmäßige Kontrolluntersuchungen erforderlich.

Ergebnisse

Bodenprobenentnahme

Dritten Stufe infektiösen jungen EPN sind die einzigen frei lebenden Stadien in diesen Nematoden-Lebenszyklus, die im Boden (Abbildung 1) befinden. Daher sammeln Bodenproben ist eine sehr effiziente Methode, um diesen Nematoden erholen. 4 zeigt ein Bodenprofil, der die Tiefe an dem Proben zu entnehmen. Erhaltung der Feuchtigkeit einer Probe ist ein Schlüsselfaktor für das Überleben der Nematoden. Folglich ist es wichtig, Bodenproben i...

Diskussion

Dieser Nachweis ist der erste von zwei Darstellungen, die eine Reihe von Techniken, die häufig zur Untersuchung EPN und ihrer symbiotischen Bakterien verwendet werden, zu beschreiben. Diese Techniken stellen wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kulturen im Labor und bilden auch die Grundlage für andere Biotests, die EPN als Modellorganismen für die Forschung zu verwenden.

Verschiedene Bodenuntersuchungen von EPN haben gezeigt, dass die Größe und Verteilung können...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	For insect baiting technique
Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	Infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092	Infection chamber and White trap assembly
100 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-088	Infection chamber and White trap assembly
ZIPloc plastic bags	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Mechanical pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	Infection chamber and White trap assembly
Pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	Infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling , disinfecting
Sodium hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling , disinfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	Soil sampling , disinfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	Soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts		Soil sampling
Soil probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	Soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
Wash bottles, polyethylene, wide mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN