In-vivo-und In-vitro-Aufzucht von Nematoden (Steinernematidae und Heterorhabditidae)

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien.

Zusammenfassung

Nematoden (EPN) (Steinernematidae und Heterorhabditidae) haben eine Partnerschaft mit mutualistic Gram-negative Gamma-Proteobakterien in der Familie der Enterobacteriaceae. Xenorhabdus Bakterien mit steinernematids Nematoden assoziiert, während Photorhabdus sind Symbionten heterorhabditids. Zusammen Nematoden und Bakterien bilden eine hohe insektizide Komplex, der eine breite Palette von Insektenarten in einer intimen und besonderen Partnerschaft tötet. Hier zeigen wir, in vivo und in vitro Techniken, die üblicherweise bei der Aufzucht dieser Nematoden unter Laborbedingungen eingesetzt. Darüber hinaus sind diese Techniken stellen wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kulturen und bilden auch die Grundlage für andere Studien, die sich diese Organismen für die Forschung zu nutzen. Die Produktion von aposymbiotic (Symbiont-frei) Nematoden ist oft entscheidend für eine gründliche und vielseitige Herangehensweise an das Studium der Symbiose. DiesProtokoll erfordert nicht die Zugabe von Antibiotika und können in kürzester Zeit mit Standard-Laborausrüstung durchgeführt werden. Nematoden, die in dieser Weise hergestellt werden, sind relativ stabil, obwohl ihr Überleben in Speicher kann je nach den verwendeten Arten variieren. Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschrieben und P. Auf der Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.

Einleitung

Nematoden (EPN) Steinernema und Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) und ihre bakteriellen Symbionten, Xenorhabdus und Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) gelten als eine emergente Modell von Landtier-Mikroben symbiotischen Beziehungen ^2-4,6,10,19. Xenorhabdus und Photorhabdus spp. sind als Symbionten im Darm des einzigen frei lebenden Bühne der Nematoden, die auch als infektiöse juvenile (IJ) oder ^3. Stufe infektiös Jugend ^8,10,13 bekannt hegte. Das Bakterium-Nematoden Paar pathogen ist für eine breite Palette von Insekten und erfolgreich in der biologischen Bekämpfung und des integrierten Pflanzen-Management-Programme weltweit ^6,8 umgesetzt worden.

Wir zeigen hier eine Auswahl von in vivo und in-vitro-Techniken, die häufig für die Aufzucht von EPN unter Laborbedingungen ausgeübt werden. Ichn-vivo-Verfahren betrachten eine Insektenwirts für die Aufzucht der Nematoden. In der Regel werden unreife Stadien der verschiedenen Insektenordnungen (dh Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) Als geeignete Wirte. In-vivo-Verfahren sind in der Regel für die Wartung der Nematodenkulturen im Labor betrachtet. Dieses Verfahren kann nicht geeignet sein, wenn man die Massenproduktion der Nematoden. Zu diesem Zweck fordern mehr Zeit und zusätzliche Kosten für die Insektenzucht beziehen, können große Mengen von Insekten Hosts erforderlich.

Nematoden können auch in vitro an verschiedenen Medien kultiviert werden. Je nach dem Ziel der Studie, in vitro Verfahren können oder betrachten die Einarbeitung der symbiotischen Bakterien in den Medien. In diesem Vortrag beschreiben wir zwei häufig verwendete Methoden für die Verbreitung des EPN. Die Bestandteile der Medien eine Quelle von Nährstoffen für die symbiotischen Bakterium einnd ein Sterin Quelle für die Nematoden. In-vitro-Methoden bieten den Vorteil, die Aufzucht von EPN ohne Insektenwirts.

Ursprünglich viele der entwickelten in vitro-Medien wurden für die Multiplikation verwendet werden, wenn geeignete EPN Insektenwirte sind nicht verfügbar. Doch in den vergangenen Jahren, in vitro Aufzuchtmethoden sind allgemein in der Forschung mit dem Ziel, die Beziehung zwischen mutualistic EPN und ihre symbiontischen Bakterien ^17,19 verstehen beschäftigt.

Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschriebenen und von den Lizenz Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.

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Protokoll

1. In vivo Tierhaltung von Nematoden mit ihren Symboitic Bakterien

1. Invertieren 100 x 15 mm Kunststoff-Petrischale und legen zwei Scheiben aus Filterpapier (90 mm) in den Deckel der Schale.
2. Gleichmäßig zu verteilen 1 ml der IJ (infektiöser Jugend) Wasser-Suspension (bei einer Konzentration von 1.000-2.000 IJ / ml) auf dem Filterpapier.
   HINWEIS: IJ müssen nicht oberflächensterilisiert werden.
3. Fügen Sie 10 letzten Larvenstadium der größeren waxmoth Galleria mellon in die Schale. Das Ziel ist, etwa 100-200 IJs / Larve ist.
4. Decken Sie den Deckel mit dem Boden der Petrischale (Bild 1) und beschriften Sie die Petrischale. Erwähnen Sie die folgenden Informationen: Name Nematodenarten (wenn bekannt); isolieren Code / Bezeichnung; Datum Infektion Falle war gestellt.
5. Die Schale in einem lose verschlossenen Plastikbeutel (um Feuchtigkeit zu erhalten) und halten Sie sie in der Dunkelheit bei Raumtemperatur oder in einem Inkubator zwischen 20-25 ° C. Überprüfen Gerichte täglich
   HINWEIS: Darkness erleichtert Nematodeninfektion, wie es natürliche Infektionsbedingungen im Boden imitiert.
6. Nach 3-5 Tagen, entfernen Leichen mit Zeichen der Nematodeninfektion zu einer veränderten Weiß Falle ^7.
   Hinweis: Wenn die Leichen riechen faulig, kann dies ein Hinweis, dass die Kultivierung nicht erfolgreich war und / oder es gab Verunreinigungen sein. Stellen Sie eine neue Infektion Kammer mit einer neuen Charge von Nematoden und Insekten.

2. In-vitro-Aufzucht von Nematoden mit ihrem symbiotischen Bakterien

1. Leber-Nieren-Agar-Methode ^9,19
   1. Hacken Leber und Niere in kleine Stücke (2 cm ³ oder kleiner) und in einen Mixer mit NaCl, Agar und 300 ml Wasser und mischen, bis das Fleisch wird flüssig Zellstoff, dicke Paste oder Püree. Dann übertragen Mischung in einen 1 l-Erlenmeyerkolben.
   2. Fügen Sie die restlichen 200 ml Wasser in den Mischer Gefäß umfüllen und alle restlichen Medien in derErlenmeyerkolben. Autoklav für 15 Minuten bei 121 ° C aufweist. Nach dem Autoklavieren Agar abkühlen lassen, um vor dem Gießen zu berühren.
      HINWEIS: Pipettieren von Medium wird nicht empfohlen, da dieses Medium dazu neigt, Fleischstücke zu haben.
   3. Gießen ~ 20 ml Agar auf 5 (oder 6) cm Petrischalen während Hand Rühren oder Schütteln des Erlenmeyer-Kolben zwischen gießt für eine homogene Medien. Ermöglichen Agar bei 4 ° C erstarren und zu speichern, bis sie gebraucht Gerichte
      Hinweis: Verwenden Sie eine Flamme sterilisiert Metallspachtel, um jegliche große Stücke Fleisch in der Petrischale gegossen.
2. Lipid-Agar-Methode ^9,19
   1. Vorbereitung Lipid-Agarmedium durch Vermischen Nährbrühe, Agar und Hefeextrakt und gießen mischen in einen 2 l-Erlenmeyerkolben. Destilliert add H ₂ O und MgCl ₂ • 6H ₂ O und Autoklaven für 15 min bei 121 ° C aufweist.
   2. Fügen sterile Mischung aus Maisöl und Maissirup Mischung und rühren oder wirbeln kräftig und oft zu Öltröpfchen gleichmäßig verteilt.
      Hinweis: Sterilisieren Maisöl und Sirup, indem die benötigte Menge in einem UV-Crosslinker. Das Öl wird nicht in der Flüssigkeit auflösen, aber stellen Sie sicher, dass es in winzigen Tröpfchen.
   3. Gießen ~ 20 ml Agar auf eine 5 (oder 6) cm Petrischalen und ermöglichen Agar bei 4 ° C erstarren und zu speichern, bis sie gebraucht Gerichte.
   4. Streak die gewünschte symbiotischen Bakterien auf den Lipid-Agar-Platte und Inkubation Platten bei 28 ° C für 24-48 Stunden.
      HINWEIS: Spread 100-200 ul über Nacht (12-16 h), LB Subkultur.
   5. Der Tag nach, fügen Sie ca. 0,4 ml Oberfläche sterilisiert Nematodensuspension (Eier oder infektiöser Jugend) und Inkubation Platten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit oder in einem Brutschrank bei 22 ± 3 ° C.
      HINWEIS: Nicht mehr als 0,4 ml Suspension Nematoden nicht hinzufügen, da sie eine übermäßig feuchten Umgebung, die ungünstig für Nematoden Wachstum zu schaffen.
   6. Überwachen Kulturen täglich. Kulturen sollte eine neue Generation von IJs in etwa 12 Tage (Abbildung 2) zu produzieren.
   7. Übertragen Bodenschale mit Agar, wenn Nematoden gesehen kriechen die Seiten der Schale (3A) auf eine modifizierte Weiß-Falle (siehe Orozco et al. ¹²⁾ IJs (3B) zu ernten. Führen Sie diesen Schritt unter einer Steril, um eine Kontamination der Medien zu reduzieren.
   8. Sammeln IJs aus dem modifizierten Weiß Falle beim Austritt und spülen IJ Suspension auf jedes Medium Schmutz zu entfernen. Shop IJ in sterilisiertem destilliertem Wasser bei 10 ° C (in einer kalten Temperatur-Inkubator oder Kühlraum) oder sofort verwenden, wenn nötig.
      HINWEIS: Je nach Ziel der Studie, Saatgut die Platten entweder mit Symbionten-kolonisierten oder aposymbiotic Nematoden.

3. In vitro Aufzucht von Aposymbiotic (Symbiont-frei) Nematoden

1. Infizieren 10-20 G. mellon Larven mit IJs der gewünschten Nematodenarten (siehe Abschnitt 1). Nach 3 oder 4 Tage (zu dieser Zeit IJs sollte gereiftzu Generation Erwachsenen zuerst) sammeln Leichen.
   HINWEIS: Restlaufzeit und die Anzahl der Frauen benötigt, um eine ausreichende Anzahl von Eiern zu erhalten wird nach Arten variieren. Mehr infizieren G. mellon Larven wenn nötig und starten Dissektionen so früh wie die 48 Stunden nach der Infektion zu beurteilen, ob sie in der richtigen Entwicklungsstadium sind.
2. Platzieren Sie jede kadaver individuell in einer Petrischale mit Kochsalzlösung (M9 Puffer ^18). Sezieren einen kadaver, indem sein Kopf mit einer feinen Spitze Pinzette.
3. Sammeln Sie mindestens 20 trächtige (mit Eiern innen) Frauen mit einer feinen Nadel (L-Form bevorzugt) und legen Sie sie in einem Uhrglas mit 10 ml M9-Puffer (4A).
4. Bereiten Sie eine Lösung axenizing unter Berücksichtigung der folgenden Bestandteile: 6,75 ml destilliertem Wasser, 1,25 ml 5 N NaOH und 2,25 ml im Handel erhältlich Bleichlösung zu 3% Hypochlorit verdünnt.
   HINWEIS: NaOH ist eine Basislösung-Handschuhe, Schutzbrille und andere geeignete SchutzKleidung sollte getragen werden.
   HINWEIS: Bereiten Sie frischen axenizing Lösung jedes Mal, als Bleich abbaut im Licht. Bereiten Sie mehrere Chargen axenizing Lösung und führen Sie die Oberflächensterilisation und die Ernte von Eiern in mehreren Uhrengläser.
5. Spülen Weibchen mindestens dreimal mit M9-Puffer füllt Uhrglas mit Pufferlösung und Ansaugen Puffer mit einer Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Frauen in der Uhrenglas bleiben. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
6. Sofort fügen Sie die axenizing Lösung und lassen die Weibchen in dieser Lösung nicht mehr als 10-15 Minuten bleiben. Beachten Sie die Nematoden-Gewebe beginnt zu zerfallen, während die Eier (die gegen den axenizing Lösung sind) intakt bleiben.
7. Manuell stören weibliche Körper, um den Prozess zu beschleunigen, indem sie mit einer Nadel oder einem Skalpell (4B, C). Eier entfernen durch Pipettieren sie in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die Vermeidung Zugabe von ungelösten Gewebe.
   HINWEIS: Die Verwendung als malle Reaktionsgefäße wie nötig, um Eier zu sammeln und arbeiten schnell, da die Lebensfähigkeit der Eier werden über einen längeren Zeitraum der Exposition gegen axenizing Lösung zu verringern.
8. Wirbelrohre für 15 Sekunden mit dem "High-Speed-Einstellung", um weiter zu entfernen Nematoden Gewebe zu den Eiern befestigt. Alternativ, wenn ein Wirbel nicht verfügbar ist, pipettieren oben und unten die Lösung mehrmals.
9. Pellet Eier durch Zentrifugation bei ca. 18.000 g für 2 min. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit, wenn Eier nicht ausreichend Pellets. Entfernen axenizing und spülen zweimal durch Füllen des Mikrorohrs mit sterilem destilliertem Wasser und Zentrifuge ein weiteres Mal bei 900 × g für 1 min.
10. Nach dem letzten Wasch resuspendieren Eier in 300-500 ul sterilem destilliertem Wasser und legen Sie sie in einer sterilen Petrischale 3 cm oder sterilisiert Uhrglas. Denken Sie daran, dass Eier sind jetzt oberflächensterilisiert, so verwenden sterilen Pipetten und / oder pippetter Tipps und Wasser auf die Sauberkeit der Eier zu erhalten.
11. Untersuchen Eier unter einem Binokular (30-50X Vergrößerung) zu bestätigen, dass sie intakt (4D) sind und sie auf einem 5 cm Teller mit Leber-Nieren-Agar (siehe Abschnitt 2.1)
    HINWEIS: Nicht mehr als 400 ul der Eisuspension hinzufügen nicht auf den Platten, wie es der Agar übermäßig nass zu machen.
12. Kennzeichenschilder mit entsprechenden Informationen und speichern sie aufrecht im Dunkeln bei 28 ° C. Schlüpfen der Eier sollte offensichtlich über Nacht sein.
    HINWEIS: Das Wasser kann auf den Deckel der Schüssel zu verdichten, aber es wird nach 1 bis 2 Tagen verdampfen. Zu dieser Zeit, so wird die Schale in einem Plastikbeutel, um Feuchtigkeit von der Agar-halten und zu vermeiden, dessen Trocknung.
13. Beachten Gerichte regelmäßig und werfen Sie alle Gerichte, die Anzeichen von Pilz-oder bakterielle Verunreinigung zu zeigen. Sobald IJs gesehen Migration an der Wand der Petrischale, den Deckel entfernen und den Boden zu übertragen Schale mit Agar zu einem modifizierten Weiß Falle ^12. Betrachten sterilen Bedingungen bei der Übertragung die Schale in die ModifieD weiß abzufangen, um eine Kontamination der freigelegten Medien zu vermeiden.
14. Weiterhin die Überwachung der Weiß-Fallen und Ernte IJ, wie gebraucht.
    HINWEIS: Aposymbiotic Nematoden wird auch weiterhin in das Wasser der Weißen Falle für viele Tage und sogar Wochen zu migrieren.

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Ergebnisse

Die In-vivo-Methode verwendet Aufzucht lebenden Insekten als Wirte für die Nematoden-Wachstum und Fortpflanzung. Infektionskammern sind ein effizientes Verfahren zum Aussetzen von Insekten IJs. Dies ist die einzige Phase im Lebenszyklus des Nematoden, die die bakteriellen Symbionten von einem Host zu einem anderen Insektenvektoren. Abbildung 1 zeigt für eine Infektion Kammer sowie der benötigt wird, um diese Kammer bauen die Materialien eingerichtet. In-vitro-Methoden ermöglichen d...

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Diskussion

Mit einem geeigneten Wirt ist ein Schlüsselfaktor für die erfolgreiche Aufzucht von in vivo EPN. In der Regel können beide steinernematids und heterorhabditids vervielfältigen und zu ihren Lebenszyklus in Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae) erfolgreich abgeschlossen. Jedoch können auch andere Insektenarten aus verschiedenen Familien und / oder Bestellungen berücksichtigt werden. Einige der derzeit beschriebenen Nematodenarten sind bekannt, um die Spezifität f?...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
For In vivo Infections
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose	Whatman/VWR	28450-081	Grade 1 filter paper recommended
Insect hosts	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Galleria mellonella are recommended
For Liver-kidney Agar (for 500 ml)
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092
Beef liver, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Beef kidney, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)	Acros/VWR	200002-434	any research grade NaCl can be used
Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
500 ml distilled H2O
For Lipid Agar (for 1 L)
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Nutrient broth, 8 g	BD/VWR	90002-660
Yeast extract, 5 g	EMD/VWR	EM1.03753.0500
Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)	EMD/VWR	EM-MX0045-1
Corn oil, 4 ml	Any brand	Locally source; supermarket	Any brand of corn oil can be used
Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity	Karo	Locally sourced; supermarket
Agar, 15 g	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
Distilled H2O, 890 ml