Das Kaninchen Blut-Shunt-Modell für die Untersuchung von akuten und Spätfolgen Subarachnoidalblutung: Technische Aspekte

Zusammenfassung

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures — subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

Zusammenfassung

Frühen Hirnverletzung und verzögert zerebralen Vasospasmus beide zur ungünstige Ergebnisse nach Subarachnoidalblutung (SAB). Reproduzierbar und kontrollierbar Tiermodellen, die beide Bedingungen zu simulieren, sind derzeit ungewöhnlich. Daher werden neue Modelle, um die menschliche pathophysiologischen Bedingungen von SAH resultierenden imitieren benötigt.

Dieser Bericht beschreibt die technischen Nuancen eines Kaninchenblut-Shunt-Modell, das SAH Kontrolle der intrazerebralen Druck (ICP) ermöglicht. Ein extrakorporalen Shunt zwischen dem arteriellen System und den Subarachnoidalraum, die Prüfer-unabhängige SAH in einem geschlossenen Schädel ermöglicht platziert. Schritt-für-Schritt-Handlungsanweisungen und notwendige Ausrüstung beschrieben werden, sowie technische Überlegungen, um das Modell mit minimaler Morbidität und Mortalität zu produzieren. Wichtige Details für die erfolgreiche chirurgische Schaffung dieses robuste, einfache und konsistente ICP-gesteuerten SAH Kaninchenmodell erforderlich sind, beschrieben.

Einleitung

Aneurysmatischen Subarachnoidalblutung (SAB) ist einer der am meisten lebensbedrohlichen neuropathologischen Bedingungen, häufig zu bleibenden neurologischen Schäden oder Tod führen ^1. Historische Forschung hat sich auf verzögerte Hirnvasospasmus (DCVS) als primäre Ursache der neurologischen Defizite mit SAH ² zugeordnet konzentriert. Allerdings hat der allgemein schlechten klinischen Ergebnisse von Patienten mit SAB nach der Behandlung von Vasospasmus zu einer Ausweitung der Forschungsschwerpunkt geführt, um die Auswirkungen der frühen Hirnverletzung (EBI) nach SAB ³ gehören. Mehr Verständnis für die Bedeutung der beiden EBI und DCVS Beitrag zur schlechten klinischen Ergebnisse nach SAB ist wesentlich für die Entwicklung von effektiveren Therapiestrategien.

Bis jetzt Einzel-und Doppeleigenblutinjektion in die Cisterna magna ist die Standardmethode für die SAH Induktion für das Studium der DCVS ^2-6. Obwohl häufig in früheren Studien verwendet wird,dieses Modell wahrscheinlich nicht die neuropathologischen wichtigsten Änderungen mit SAH verbunden sind, nicht reproduzieren induzierte EBI ^7. Im Gegensatz dazu ist die endovaskuläre Perforation bekannt, schweren akuten pathophysiologischen Veränderungen, die die Symptome der EBI ⁷ teilweise nachahmen.

Dieser Bericht beschreibt ein neuartiges Kaninchenmodell von SAH zur Untersuchung sowohl EBI und DCVS ermöglichen, wodurch eine genauere Charakterisierung der SAH-induzierten Pathologie _^8-10. Bei dem beschriebenen Verfahren wird die Standard Cisterna magna Modell durch Verbinden des arteriellen Systems angepaßt der A. subclavia und der Cisterna magna über einen extrakorporalen Shunt. Die Durchblutung wird dadurch auf die Physiologie des Kaninchens verbunden und durch das Druckgefälle zwischen dem arteriellen Blut und Hirndruck angetrieben. Die Blutung stoppt, wenn intrazerebrale Druck (ICP) gleich der diastolische Blutdruck und die Blut im Shunt-System koaguliert. Verwendung des Host & #8217; s Physiologie reduziert Prüfer-abhängigen Induktion SAH, was zu einer konsequenteren Modell des SAH, die zuverlässig und produziert sowohl EBI DCVS Phänotypen ^3,8-10.

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Protokoll

Drei Monate alten weiblichen Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,5 kg wurden für dieses Verfahren verwendet. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit der Genehmigung des Animal Care Committee des Kantons Bern, Schweiz (# 105 der Zulassung / 13) durchgeführt. Alle chirurgischen Verfahren wurden unter sterilen Bedingungen an der Experimental Surgical Institute der Fakultät für Klinische Forschung an der Universität Bern Krankenhaus in Bern, Schweiz durchgeführt. Ein Anästhesist überwacht Tier die Tiere während der Operation und während Genesung.

1. Vorbereitung der Tiere, Positionierung und Schlüsselbein-Arterie Kanülierung

1. Induzieren Narkose bei Kaninchen mit intramuskulären Injektion von Ketamin (30 mg / kg; Ketalar, 50 mg / ml) und Xylazin (6 mg / kg; Xylapan 20 mg / ml) und die Steuerung der Narkosetiefe, indem die Reaktion des Kaninchens auf schädliche stimulatIonen (zB Zeh Prise). Siehe 1.7 im Falle einer positiven Antwort.
2. Ziehen Sie die Unterlider beider Augen und eine kleine Menge Salbe auf die Augenlider zu Trockenheit und weitere Reizung zu vermeiden.
3. Catheterize die laterale Ohrvene mit einer 20 Gbutterfly Venflon (20 G Gefäßkatheter), mit Klebeband fixieren, und eine Verbindung zu einer Schwerkraft-Beutel mit 0,9% Natriumchlorid (500 ml / 24 h) und Ketamin (40 mg / kg / h) / Xylazin (4 mg / kg / h) für die kontinuierliche intravenöse (iv) Anästhesie. Verwalten Sie zusätzliche Analgetika alle 15 min iv (Fentanyl, 1 mcg / kg). Hinweis: Vermeiden Sie flüchtige Gas Anästhetika, die mit einer verminderten CPP verbunden ist, die Erhöhung CBF, und abnehmender Hirnstoffwechselrate für Sauerstoff ¹¹ intravenöse Anästhetika bieten mehr idealen Eigenschaften für NEUROANESTHESIA durch die Erhaltung CBF und zerebrale Vasokonstriktion, ^12, die von obersten Bedeutung ist, wenn das Studium Hirn. Vasospasmus. Zusätzlich ist, obwohl die Mortalität in SPONT erhöhtaneously Atem Tieren kann es besser imitieren die menschliche Situation der akuten SAH.
4. Liefern Sauerstoff (1 - 2 L / min) über eine Atemmaske, die endexspiratorischen Kohlendioxid erlaubt (EtCO ₂₎ Überwachung.
5. Installieren Sie ein 3-Kanal-Elektrokardiogramm (EKG) .Den drei subkutane Elektroden in einer dreieckigen Anordnung auf der Bauchseite des Kaninchens; Insbesondere legen eine Elektrode über dem rechten midthoracic Region (mit Abstand zu den sterilen rasiert Feld für die Schlüsselbeinarterie Kanülierung) und zwei Elektroden in den Unterleib über beide Glieder verteilt.
6. Überwachung der Narkosetiefe alle 15 Minuten während der Operation durch folgende Atemfrequenz, Herzfrequenz (HR) aus dem EKG-Signal überwacht, und die Reaktion auf schädliche Stimulation.
7. Im Falle einer positiven Reaktion auf schädliche Stimulation (toe Prise), Anpassung der Narkosetiefe durch Ketamin Bolus (6 mg / kg) und Xylazin iv Bolus (0,05 mg / kg) iv und / oder eine zusätzliche Analgesie mit Fentanyl-Bolus (1 mcg / kg) iv
8. Befestigen Sie die Kaninchen in Rückenlage auf einem Körper Wärmeplatte, Kippen den Kopf 20 ° nach unten und leichtes Drehen kontralateral zu der Seite, auf der die Schlüsselbeinarterie freigelegt werden.
9. Augensalbe anwenden und bereiten die Fläche für die Chirurgie durch Rasieren der Haare über der rechten Brustmuskel um das mittlere Drittel des Schlüsselbeins, und über die Frontal-, parietal- und Hinterhaupt Schädel, Hals, und über der rechten A. femoralis communis.
10. Desinfizieren Sie die Haut für 3 Minuten mit einem breiten Spektrum antiseptischen, zB., PVP-Jod.
11. Decken Sie die Kaninchen mit sterilen Tüchern. Führen Sie alle weiteren Verfahren unter sterilen Bedingungen und häufig gelten 4% Papaverin HCl und Antibiotika-Lösung (Neomycinsulfat 5 mg / ml) topisch auf arteriellen Vasospasmus nach Schiffs Manipulation und lokale Infektionen zu verhindern.
12. Infiltrieren die Brustmuskel mit Lokalanästhetika (Lidocain 1% maximal 6 mg / kg). Machen Sie eine parasternalen Hautschnitt und bereiten dieBrustmuskel. Mit dem Mikroskop, sezieren die Schlüsselbeinarterie und mit einem proximalen und distalen Ligatur (4-0 polyfilen Nähte) um das freiliegende Ende. Halten Sie eine Ligatur nahe dem proximalen Kontrolle an Ort und Stelle, um den Katheter zu sichern und zu ligieren das Gefäß distal.
13. Führen Sie eine Arteriotomie in der Wand der A. subclavia durch Einschneiden der Arterie mit einem gekrümmten microscissor und kanülieren die Schlüsselbeinarterie retrograd mit einem kleinen intravasale 3-Wege-Hahn. Sichern Sie den Katheter durch Doppelknoten Ligatur zum distalen Ligatur, um arterielle Verdrehen oder Biegen des proximalen Teils der Arterie zu verhindern und um ein Verrutschen oder massive Blutungen zu vermeiden.

2. Blutdruck und arterielle Blutgasüberwachung

1. Schließen Sie das 3-Wege-Hahn, um i) die intravasale Kanüle für die arterielle Blutgas (ABG) analysiert, pH, _{PaCO2, PaO2,} Bicarbonat, Basenüberschuss, und SO _2, ii) die invasive arterielle BlutDruckmessvorrichtung, und iii) die Shunt-Vorrichtung.
2. Sammeln Blutproben für die ABG-Status _{(PaCO2, PaO2)} und Standard-Herz-Kreislauf und Atmungsparameter (Blutdruck, HR, EKG, Atemfrequenz und endexspiratorischen CO ₂₎ und Übertragung von Daten über das analoge Ausgangsschnittstelle zu einem Analog- kontinuierlich zu überwachen Digital-Wandler / Datenlogger und Speicher.
   HINWEIS: Der Druck wird im Grunde Pegel vor und nach jeder Sitzung auf Null gesetzt werden, und der Druck Kalibrierung der Analog / Digital-Wandler und die Datenprotokollierungssystem wird einmal durchgeführt werden, bevor die Reihe beginnt.

3. Baseline digitale Subtraktionsangiographie

1. Ein externer Meßsteuereinrichtung (kleine Kugel) über beide Unterkiefer Winkel, um die Angiographie zu kalibrieren.
   HINWEIS: Diese ermöglicht die exakte Vergleich der Post-hoc-Messungen der Baseline und Follow-up-Gefäßdurchmesser.
2. Digitale Subtraktionsangiographie (DSA) durch retrograde inner einrterial Bolusinjektion von nichtionischen Iopamidol (0,6 ml / kg, 5 ml / s für 2 s) durch die Kanüle eingeführt Arterie und bündig die Kanüle unmittelbar nach Bolus-Injektion von Salzlösung, um die Okklusion des letzteren zu verhindern.
3. Erhalten Bilder (7 Bilder in 14 sec) der vertebrobasilären System mit einem schnellen sequentiellen Angiographie Aufnahme in einem 5 ° linken vorderen Schräglage.
4. Infiltrieren den Bereich um den rechten A. femoralis communis mit Lokalanästhetika (Lidocain 1%, maximal 6 mg / kg). Machen Sie eine kleine Leistenhautschnitt. Mit dem Mikroskop zur Visualisierung, sezieren die A. femoralis communis und mit einem proximalen und distalen Ligatur (4-0 polyfilen Nähte) um das freiliegende Ende.
5. Nach Arteriotomie, kanülieren die Oberschenkelarterie mit einem 5-F Hülle. Spülen Sie die Seitenöffnung des Mantels mit Kochsalzlösung.
6. Advance A 5-F-Katheter in die Brachiozephalarterie durch die Hülle unter Durchleuchtung. Erstellen Sie eine Straßenkarte, dann voran einen Führungsdraht zu thE vertebrobasiläre System. Injizieren eines Bolus von nicht-ionischen Iopamidol (0,6 ml / kg, 5 ml / s in 2 sec) für DSA, wie in Schritt 3.2 beschrieben.

4. Rotation um Bauchlage

1. Nach Baseline DSA, die Position des Kaninchen von der Rückenlage in die Bauchlage. Seien Sie vorsichtig, nicht zu manipulieren oder den Standort der Position der intra-arteriellen Katheter.
2. Positionieren Sie den Kopf in einem Kopfhalter in einem 30 ° Winkel, Kopf nach unten orientiert.

5. Cisterna Magna Pannen

1. Desinfizieren Sie die Haut über den Kopf und Hals mit PVP-Jod-3-mal für jeweils 1 min, und decken das Operationsgebiet mit sterilen Tüchern.
2. Legen Sie eine 22 G x 40 mm Kinderrücken Zugang Nadel transkutan in die Cisterna magna ohne vorherige Hautschnitt oder Muskel Verschiebung.
3. Bestätigen, dass das Tier vollständig durch die Gewährleistung eines fehlenden Zehen Prise Antwort, bevor entlang der knöchernen externen Hinterhaupthöcker Schiebe die Nadel betäubtbis eine Lücke festgestellt wird; drücken Sie nicht die Nadel weiter.
4. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung der Nadel durch Beobachtung spontanen tropft von Liquor mit dem Kopf des Kaninchens sich an einen 20 ° Winkel für ein paar Minuten gekippt.

6. Installation des intrakraniellen Drucks und des zerebralen Blutflussüberwachung

1. Nach der Mittellinie und der Haut Galea Einschnitt, legen Sie eine kleine Wund-Spreizer.
2. Stellen drei runden Osteotomien (2 mm Durchmesser) mit einem Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrers im frontalen Teil des Schädels nach den äußeren Schädellandmarken (1) ^9, das heißt, über den Riechkolben und bilaterale frontale zur Platzierung eines Neuro Gerät, wenn notwendig. Verwenden Sie ein Lineal Millimeter-Skala, um die Koordinaten für Bohrloch Platzierung wie folgt zu bestimmen: Hirndrucksteigerung (ICP) Überwachung in der midpupillary Linie 1-2 mm von der Medialeitung; intraparenchymalen Laser-Doppler-Sondenvier vor fünf mm vor und seitlich der Bregma (Abbildung 1).
3. Visualisieren Sie die Dura, und führen Sie sorgfältige Blutstillung: Verwenden Knochenwachs für die Knochenblutstillung durch seine Tamponade Aktion und führen Sie lokale Blutstillung mit bipolarer Koagulation der Dura.
4. Legen Sie die intraparenchymalen Hirndruck (ICP)-Monitor Spitze in der rechten Riechkolben bis zu einer Tiefe von 2 mm und dann kalibrieren.
5. Legen Sie die beiden Laser-Doppler-Flussmessung feinen Nadelsonden mit einem externen Klemmsystem und fügen Sie sie in die entsprechenden Bohrlöcher in der rechten und linken Stirn Hemisphären lateral der ventrikulären System, dh in der Mittellinie, um Interferenzen mit Rückenmarksflüssigkeit zu vermeiden. Platzieren Nadelsonden zu einer Tiefe von 2,5 mm.
6. Nach Platzierung der Sonden Neuromonitoring, Dichtung alle Bohrlöcher mit einem dicken Stecker des Knochenwachs, um den Schädel flüssigkeitsdicht zu halten.
7. Messen Basislinienparameter des mittleren arteriellen Blutdrucks (MAP), ICP und des zerebralen Blutflusses (CBF) mit einem Multimonitor und Vierkanal-Laser-Doppler-Gewebedurchblutung Monitor.

7. Shunt Induktions

1. Schließen Sie die Rücken Zugang Nadel in der Cisterna magna zu dem zuvor katheterisiert subclavia über mit Blut gefüllte Drucküberwachung Schläuche. Verwenden Sie die 3-Wege-Hahn für die Blutdruckmessung und Blutabnahme als Hafen.
   HINWEIS: Die Schwere der SAH hängt von der Menge an Blut und kann grob durch die Reichhaltigkeit des subarachnoidalen Gerinnsel bei der Ernte Gehirn ^5,11 geschätzt werden.
2. MAP, HR, EKG, Atemfrequenz und endexspiratorischen CO ₂ bei einer Abtastrate von 1 Hz von 6 min vor kontinuierlich zu überwachen, bis mindestens 20 min nach SAB.
3. Bestätigen, dass das Tier vollständig durch die Gewährleistung eines fehlenden Zehe Prise Antwort vor dem Öffnen des Shunt-Verbindung zwischen der A. subclavia und der Cisterna magna zu SAH durch den Druck Gradie induzieren betäubtnt.
   Hinweis: (. ZB auf einem gewünschten Niveau von ICP) Eine kontrollierte SAH durch Schließen des Shunt zu jedem Zeitpunkt erfolgen.
4. Aufzeichnen Beharrungswerte während eines Zeitraums von etwa 15 min.
5. Nach ICP erreicht ihren Höhepunkt, halten Sie die Rücken Zugang Nadel an Ort und Stelle, bis ICP wieder auf einem stabilen Zustand in der Nähe zu den Ausgangswerten. Wenn der ICP Plateau ist für mehr als 10 Sekunden lang aufrechterhalten oder wenn ICP nimmt spontan, schließen Sie den Shunt.
6. Entfernen CBF feinen Nadel-Sonden und ICP-Sonde, stecken Bohrlöcher mit Knochenwachs, entfernen Sie alle Katheter (einschließlich subclavia Katheter, da Katheter Manipulation mit konsekutiver Blutung mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden, und erhöht die Infektionsrate), führen strenge Wundspülung mit Neomycin-Sulfat und Naht der Haut.

8. Postoperative Behandlung

1. Der Eingriff dauert etwa 2 Stunden. Aufgrund der Halbwertszeiten von Ketamin und Xylazin, die Erholungszeit der animal ist recht kurz - etwa 1 Stunde. Die Tiere werden unter einer Wärmelampe während der Wiederherstellung gehalten. Zusätzliche Flüssigkeiten sind nicht vorgesehen. Während dieser ersten postoperativen Erholungsphase gelten Buprenorphin 0,02 mg / kg sc alle 8 Stunden für 24 Stunden.
2. Gelten transdermales Fentanyl Matrixpflaster frei 12,5 ug / h in die rasierte Nackenbereich der Tiere für eine effektive Analgesie in den nächsten 72 Stunden.
3. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichend Brustlage zu halten.
4. Sie ein Tier, dass eine Operation in der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.

9. Folgen Sie digitale Subtraktionsangiographie zu DCVS an Tag 3 bewerten

1. Führen Sie die Schritte 1,1-3,6, wie oben beschrieben.
2. Euthanize die Tiere durch intraarterielle Bolusinjektion von Natrium thiopenthal (40 mg / kg) (Pentothal, Ospedalia AG, Hünenberg, Schweiz). In Fällen, bei denen die Histologie und immunohistochemistry benötigt wird, führen Sie eine intra Perfusionsfixierung bei RT in einem Perfusionsdruck von 100 cm H ₂ O.

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Ergebnisse

Die Kaninchenblut Shunt-Modell SAH in diesem Bericht beschriebenen produziert EBI im Hippocampus (Abbildung 2a, b), basale Kortex (Abbildung 2a, b), und zerebrale Gefäßsystem (Abbildung 2C) bereits 24 Stunden nach der Verletzung und zeigt eine charakteristische Blutverteilung (2D) ^8. Außerdem löst das Modell moderaten bis schweren Grad der DCVS am dritten Tag nach der SAH Induktion (Figur 3) ^10. Die Morta...

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Diskussion

Der Shunt-Modell produziert Pathologie ähnlich wie beim Menschen nach akuter SAH ^3,8,10 beobachtet. Es wurde vorgeschlagen, dass EBI kann verschärfen, zu pflegen und sogar auslösen DCVS ^12, und als solche kann dieses Modell bei der Untersuchung sowohl die frühen und späten Phasen DCVS, einschließlich EBI und DCVS Wechselwirkungen folgenden SAH unterstützen. Insbesondere, wiederholbare in vivo DCVS Überwachungstechniken einschließlich DSA ^13, Computertomographie-Angiogra...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Operation microscope	Zeiss, Jena, Germany		Zeiss, OPMI-MD surgical microscope
Surgical equipment	B. Braun, Germany		Forceps medical no. 5; vessel scissors 8 cm; microclip 4 mm
Respirator	Hugo Sachs
Hair clipper	3M Surgical Clipper		Starter Kit 9667A
Body warm plate	FHC
Blood gas analyzer	Radiometer, Copenhagen, Denmark	ABL 725
Cardiac monitoring	Camino Multi-Parameter Monitor, Integra, Plainsboro, NJ, US	AP-05
Software analysis	BIOPAC Systems, Inc., Goleta, CA, USA		Biopac MP100 and acqKnowledge software,version 3.8.1
Software analysis	ImagePro Discovery, MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USA		Image-Pro Plus version
Angiography apparatus	DFP 2000 A-Toshiba	MIIXR0001EAA
ICP monitor	Camino Laboratories, San Diego, CA, USA		ICP monitor, Model 110-4B
Blood flow monitor	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		CAL KIT microsphere solution
Laser-Doppler flowmetry fine needle probes	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		MNP110XP, 0.48 mm diameter
Pressure tube	B. Braun, Germay		PE 1.0 mm × 2.0 mm
Anesthesia monitor	GE Medical Systems, Switzerland		Datex S5 Monitor
Material
20 G vascular catheter	Smiths Medical		Jelco i.v. catheter, REF 4057
5.5 F three-lumen central venous catheter	Connectors, Tagelswangen, Switzerland		Silicone catheter STH-C040
22 G x 40 mm needle	Emergo Group Inc., Netherlands
High-speed microdrill	Stryker, Solothurn, Switzerland	5400-15
Bone wax	Ethicon, Johnson & Johnson,NJ, USA	ETHW31G
Bipolar forceps	Aesculap, Inc., PA, US	US349SP
Ketamin			Any generic product
Xylazine			Any generic product
Buprenorphine			Any generic product
Fentanyl			Any generic product
Transdermal fentanyl matrix patches			Any generic product
Lidocaine 1%			Any generic product
4% papaverin HCl			Any generic product
Neomycin sulfate	Research Organics Inc., OH, USA		Any generic product
Povidone-iodine			Any generic product
0.9% sodium chloride			Any generic product
Iopamidol	Abott Laboratories, IL, USA		Any generic product
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
4-0 polyfilament sutures	Ethicon Inc., USA	VCP284G