Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren

Zusammenfassung

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Zusammenfassung

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

Einleitung

Glioblastoma multiforme (GBM) ist die häufigste (60%) primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, mit einer medianen Überlebenszeit von 15 bis 21 Monaten, wenn sie mit Operation, Bestrahlung und Chemotherapie ¹ behandelt. Neuartige Therapien für GBM sind unerlässlich. Experimentelle Therapien erfordern Tests an Tiermodellen, die die wesentlichen Merkmale der menschlichen Krankheit angemessen zu reproduzieren. Strategien zur GBM induzieren bei Nagetieren sind chemische Mutagenese mit alkylierenden Substanzen, Keimbahn oder somatischen genetischen Veränderungen, oder Transplantation mit Gliomzelllinien ^2. Die am häufigsten verwendeten Modelle verwenden die Implantation Gliomzelllinien entweder orthotopisch, in das Gehirn oder subkutan mit syngenen Zellen in Tieren, die mit identischen Genotyp; oder xenogene Zellen, am häufigsten menschlichen GBM-Zelllinien, in Immun implantiert beeinträchtigt Mäusen ^3. Xenografts bieten viele Vorteile für die Untersuchung der intrakraniellen Tumoren: Bequemlichkeit der Reproduzierbarkeit, standardized Wachstumsraten, Zeit des Todes und der Tumorlokalisation. Allerdings haben diese Modelle Einschränkungen auf Grund der künstlichen, invasive chirurgische Ansatz für Implantationen und begrenzte Fähigkeit, histologische genau zu reproduzieren verwendet charakteristischen Merkmale der menschlichen GBM (WHO Grad IV): Pseudo pallisading Nekrose, Kern Atypien, diffuse Invasion, Mikrogefäßproliferations und die Bildung von glomeruloid Gefäßveränderungen ^4-7. Induktion der GBM durch Verändern des Genoms von somatischen Zellen mit onkogener DNA, entweder mit viralen Vektoren ^8-12 oder mit Transposon-vermittelte Integration ¹³ reproduziert enger die Ätiologie der Krankheit beim Menschen und rekapituliert histopathologischen Merkmale der menschlichen GBM.

Historisch gesehen, Tumoren des ZNS wurden klassifiziert, basierend auf der wahrgenommenen Ursprungszelle, die beobachtet wurde, würde ein prädiktiver Faktor für das Überleben ¹⁴ sein. GBM sind in primäre und sekundäre eingestuft. Anzeichen dafür, today weist auf die sehr heterogenen Natur der primären Glioblastomen ^15. Sekundäre GBM (15%), das Ergebnis der malignen Transformation von Astrozytomen niedrig (WHO Grad I) und anaplasic Astrozytome (WHO Grad II) werden mit früheren Ausbruch der Krankheit, bessere Prognose und einem "proneurale" Muster der Genexpression assoziiert , während primäre GBM (85%) zeigen einen späten Beginn, schlechte Prognose und Gliazellen (klassisch), neuronale oder mesenchymalen Expressionsmuster. Ob diese Muster der Genexpression korrelieren mit der eigentlichen Ursprungszelle des Tumors noch intensiv erforscht. Sammeln von Daten zeigt, dass die Kombination von genetischen Mutationen, die mit GBMs zugehörige prädiktive Überleben sind. Beispielsweise werden Verlust Heterozygotie (LOH) der Chromosomen 1p / 19q, IDH1 Mutationen, PDGFRα Amplifikationen mit sekundären GBMs, proneurale Expressionsmuster und bessere Prognose assoziiert, während EGFR-Überexpression, Notch und Sonic Hedgehog-Pfad aktiviert, Nf1 und PTEN Verlust und Mutationen von p53 mit neuronalen, Klassik, oder mesenchymale primären GBM und schlechtere Prognose ^16,17 korreliert. Das Aufkommen der Großsequenzierungsprojekte und die Ansammlung von zahlreichen Patientenproben zum Testen zur Verfügung bringt eine Fülle von neuen Informationen in Bezug auf genetische Mutationen und Wege in GBM Pathogenese und Progression und die Möglichkeit der individualisierten Medizin, wo Therapien gezielt auf zugeschnitten werden verwickelt die genetische Anomalien des Patienten. Letztlich, um die Aussagekraft dieser Mutationen und Wege in systematischer Weise zu bewerten und mögliche Behandlungen jeweils zu testen, benötigt Tiermodellen der GBM mit vorgegebenen genetischen Veränderungen. Transposon-vermittelte Integration genomischer DNA bietet ein gangbarer Weg.

Das Transposon Sleeping Beauty Systems, Mitglied des Tc1 / mariner Klasse von Transposons, wurde "erwacht" (gebaut) in einem mehrstufigen Verfahss von ortsspezifische Mutagenese von einer Lachs Transposasegen, die vor mehr als ruhend 10.000.000 Jahre ^18,19 wurde. Im Wesentlichen DNA Transposons durch spezifische Sequenzen (inverted repeats / direkte Wiederholungen: IR / DR) flankiert kann in das Genom in einem "cut and paste" Weise durch die Aktivität des Dornröschen Transposase integriert werden. Die Transposase erkennt die Enden der IR Sites, schneidet das Transposon und integriert sie zufällig in einem anderen DNA-Region zwischen den Basen T und A, Basen, die an jedem Ende des Transposons während der Umsetzung (Abbildung 1a) dupliziert werden. Dornröschen Transposase wird aus drei Domänen, ein Transposon-bindende Domäne, eine Kernlokalisationssequenz und eine katalytische Domäne umfasst. Vier Transposase Moleküle sind erforderlich, um die beiden Enden des Transposons zusammen zu bringen und lassen für die Umsetzung ist jedoch, wenn zu viele Moleküle des Transposase vorhanden sind, sie dimerisieren können und tetramerize zu hemmendie Umsetzung Reaktions ^20. Eine effiziente Transpositionsreaktion benötigt eine optimale Verhältnis von Transposase Transposons. Die DNA, die Transposase kodiert, kann auf demselben Plasmid mit dem Transposon (in cis) oder auf einem anderen Plasmid (in trans) geliefert werden. Um das optimale Verhältnis zwischen der Transposase und Transposons zu gewährleisten, kann ein Promotor mit ausreichender Aktivität für die Expression der Transposase (für die "cis" Modell) oder das Verhältnis der Plasmide in der Injektionslösung kann optimiert werden, gewählt werden (für den "trans" Modell). Das Transposon Sleeping Beauty Systems erfolgreich der funktionellen Genomik, Insertionsmutagenese, Transgenese und somatische Gentherapie ²¹ verwendet werden. Als synthetisches Konstrukt zu einem funktionellen Molekül aus einem ruhenden Lachs Variante überarbeitet, wird die Dornröschen Transposase nicht auf andere Transposons in Menschen oder anderen Säugetieren ²⁰ zu binden. Seit seiner Entdeckung hat Molekulartechnik enhanced die Umsetzung Wirksamkeit des SB Transposonsystem durch Veränderungen in der IR-Sequenzen und die Zugabe von TATA Dinukleotide flankierenden Transposon, was zu den pT2 Transposons. Diese Transposons haben an den IR-Website Bindung des SB optimiert und erhöht die Wirksamkeit der Exzision. Die SB Transposase unterzog auch signifikante Verbesserung; die Transposase in Experimenten hierin dargestellt verwendet wird, ist die SB100X, ein hyperaktives Transposase von einer DNA shuffling Strategie gefolgt von einer großen genetischen Screen in Säugetierzellen ²² erzeugt.

In diesem Bericht zeigen wir eine schnelle, flexible und reproduzierbares Verfahren zur intrinsischen GBM in Mäusen, die mit nicht-viralen, Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in Zellen der Unter ventrikulären Zone des neugeborenen Mäusen ²³ induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine einfache Möglichkeit, Transposons mit neuer Gene zugänglich für genomische Integration mit dem Dornröschen Transposase zu schaffen und zeigen, wie man das Plasmid Aufnahme zu überwachen undFortschreiten der Krankheit mit Biolumineszenz. Wir charakterisieren auch histologischen und immunhistochemischen Eigenschaften der GBM mit diesem Modell wiedergegeben. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen eine schnelle Methode, um primäre GBM Zelllinien aus diesen Tumoren zu erzeugen. Dornröschen Modell, bei denen Tumore aus Zellen Original dem Tier induziert werden, erlaubt das funktionale Bewertung der Rolle von Kandidaten GBM Gene bei der Induktion und Progression von Tumoren. Dieses System ist auch für das Testen von neuen GBM Behandlungen, einschließlich Immuntherapien in immunkompetenten Mäusen geeignet, ohne die Notwendigkeit invasiver entzündlichen chirurgischer Prozeduren, die die lokale Mikroumgebung verändern können.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tier Protokolle wurden von der University of Michigan Ausschuss für die Benutzung und Pflege der Tiere (UCUCA) genehmigt worden.

1. Klonierung der Sequenz von Interesse in New Dornröschen Transposons

HINWEIS: Um die Gene oder hemmenden Elemente (wie shRNA) mit dem Dornröschen-Transposase-System einzufügen, zu klonen die Sequenz von Interesse in das Rückgrat eines pKT oder pT2 Plasmid. Richten Sie den Klonen, dass die regulatorischen Elemente, Gen von Interesse und Marker bleiben von den invertierten Wiederholungen (IR / DR) flankiert. Ein Beispiel für die Klonierung in einen PDGFβ pKT Rückgrat ist nachfolgend aufgeführt (siehe auch Figur 1b).

1. Digest 5 ug Plasmidvektor pKT-IRES-Katushka für 4 Stunden bei 37 ° C mit 5-10 Einheiten XbaI / XhoI-Restriktionsenzymen in einem 50 ul Reaktionsvolumen.
2. Verdauen mPDGFβ cDNA von 5 ug des pGEM-T mPDGFβ Plasmid für 4 Stunden bei 37 ° C mit 5-10 Einheits von NcoI / SacI-Restriktionsenzymen.
3. Ausfällung der gesamten DNA durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Na-Acetat, pH 5,8, und Inkubation über Nacht bei -20 ° C.
4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.800 · g für 15 min.
5. Waschen Sie die DNA-Pellet mit 500 ul 70% Ethanol, Zentrifuge bei 13.800 · g für 1 min, wiederhole noch einmal, und resuspendieren in 19 ul sterilem DNase freies Wasser.
6. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers in der Schnell Blunting Kit, um die Enden der beiden Vektor (PKT-IRES-Katushka) stumpf und setzen (mPDGFβ).
7. Laden Sie die abgestumpft Vektor und Insert auf einem 1,2% Ethidiumbromid gefärbten Agarose-Gel und führen bei 80 V für 40 Minuten. Visualisieren Sie die Bands, Verbrauchsteuern mit einem sauberen Rasierklinge und Gel reinigt die DNA unter Verwendung eines Gelreinigen Kit nach Herstellerprotokoll.
8. Ligieren der in Schritt 1.7 gereinigt Insert und Vektor-DNA durch Zugabe in einem Rohr in einem Molverhältnis von 4: 1 (Insert: Vektor). In dieses Rohr, pipette 1 ul T4-Ligase und 2 ul T4 Ligase-Puffer (mit ATP), und stellen Sie die Lautstärke auf 20 ul mit sterilem Wasser. Inkubieren der Ligationsreaktion 18 Stunden bei 16 ° C.
9. Transformieren chemisch kompetente DH5a Bakterienzellen mit den ligierten Produkten.
   1. Tauen die zuständigen Zellen auf Eis.
   2. Fügen Sie das gesamte Volumen des Ligationsreaktion zu 50 ul kompetenter Zellen, schütteln Sie den Schlauch und Inkubation die Mischung auf Eis für 30 min. Hitzeschock die Bakterien für 45 Sekunden bei 42 ° C und kehren sofort auf Eis legen; Inkubieren auf Eis für weitere 2 min.
   3. Hinzufügen 950 ul Luria Broth mit der Kultur und Inkubieren unter Schütteln bei 37 ° C für 1 Stunde. Zentrifuge Bakterien bei 2.400 × g für 3 min und resuspendieren das Pellet in 200 ul LB
   4. Verbreiten der transformierten Bakterien auf einer Petri-Schale mit LB-Agarose und dem entsprechenden Antibiotikum beschichtet. Inkubieren der Platte über Nacht bei 37 ° C.
   5. Schließlich sammeln 5-10 bacterial Kolonien und die Kultur über Nacht bei 37 ° C in 5 ml LB-Medium mit Antibiotikum.
   6. Reinige Plasmid DNA mit einer Plasmid-DNA Mini Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie ein Diagnose Restriktionsverdau, um die ordnungsgemäße Einbeziehung des Einsatzes in den Vektor zu bestätigen und positive Klone für die DNA-Sequenzierung, um die richtige Orientierung des Inserts zu gewährleisten.
10. Wählen Sie die richtige Kolonien und Scale-up der DNA-Produktion mit einem hochwertigen, Endotoxin frei Plasmid Vorbereitung Kit.
11. Eluieren der DNA in sterilem Wasser oder in 1 mM Tris-HCl. DNA bei -20 ° C bis zum Gebrauch in Neugeborenen zu injizieren.

2. Inner ventrikuläre Neonatal Injektionen

1. Drei bis vier Wochen vor dem Versuch, die Einrichtung eines Maus-Zuchtkäfig mit einer männlichen und einer weiblichen Maus, und einem Kunststoff farbigen Iglu. Dies bietet eine angereicherte Umgebung und unterstützt die Paarung.
2. Wird eine Schwangerschaft bestätigt wird, entfernen Sie die mALE wird zu einem neuen Käfig. Achtzehn Tage nach der Paarung, überwachen Käfig täglich für die Lieferung. Führen intraventrikuläre Injektion am postnatalen Tag 1 (P1).
3. Zubereitung der Injektionslösung
   HINWEIS: Die Injektionslösung wird durch Mischen der Plasmid-DNA mit dem Transfektionsreagenz um die Teilchen für die Transfektion zu schaffen. Unten ist ein Beispiel für die Herstellung einer Injektionslösung mit einem Plasmid, das Dornröschen Transposase und Luciferase codiert: pT2 / SB100x-Luc und zwei Transposon-Plasmiden: pT / CAGGS-NRASV12 und pT / CMV-SV40-LgT, bei einem Verhältnis von 1: 2: 2. Alle Plasmide haben eine Konzentration von 2 ug / ul. Wichtige Einzelheiten zur Herstellung der Injektionslösung werden in der Diskussion vorgestellt.
   1. Bereiten Sie die DNA-Lösung durch Zugabe: 4 ug (2 ul) von pT2 / SB100x-Luc, 8 & mgr; g (4 ul) von Pt / CAGGS-NRASV12 und 8 & mgr; g (4 ul) von Pt / CMV-SV40-LgT und 10 & mgr; von 10% Glucose bis zu einem Endvolumen von 20 ul bei einer Konzentration von 1 & mgr; g / mlDNA und 5% Glucose.
   2. Bereiten Sie die PEI-Lösung durch Zugabe von 2,8 & mgr; l in vivo Strahl PEI, 7,2 ul sterilem Wasser und 10 ul 10% Glucose bis zu einer Endkonzentration von 5% Glucose.
   3. Fügen Sie die PEI-Lösung zu der DNA-Lösung, mischen und Wirbel und lassen Sie sich bei Raumtemperatur (RT) für 20 min. Die Lösung ist nun bereit für die Injektion. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur, halten Sie die Lösung auf Eis.
   4. Setzen Sie einen 10 & mgr; saubere Spritze mit einer 30-Gauge-Injektionsnadel ausgestattet mit 12,5 ° Kegel in die Mikropumpe (Abbildung 2 # 1).
4. Um die korrekte Funktion des Einspritzsystems zu überprüfen, verwenden Sie die automatische Injektor (2 # 1) zu 10 ul Wasser in die Spritze zurückziehen und dann entleeren Sie die Spritze vollständig
5. Kühle das neonatale stereotaxische Stufe (2 # 3) mit einer Aufschlämmung aus Trockeneis und Alkohol auf eine Temperatur von 2-8 ° C.
6. Induzieren Anästhesie, indem die Welpen auf nassem Eisfür 2 min. Narkose wird auf der gekühlten stereotaktischen Rahmen für den Rest des Verfahrens fortzusetzen. Die Temperatur des Rahmens über dem Gefrierpunkt, zwischen 2-8 ° C wird thermische Verbrennungen zu vermeiden. Als besondere Vorsicht Welpen können in Gaze, bevor Sie auf nassem Eis verpackt werden.
7. Füllen Sie die Spritze mit der DNA / PEI Lösung.
8. Immobilisierung von den Welpen in der stereotaktischen Rahmen, indem Sie den Kopf zwischen den Gaze abgedeckt Ohr Bars (Abbildung 2b). Sicherzustellen, daß die Rückenseite des Schädels ist horizontal, parallel zu der Oberfläche des Rahmens und die Schädelnähte sind deutlich sichtbar. Wischen Sie den Kopf mit 70% Ethanol.
9. Senken Sie die Nadel der Spritze und stellen stereotaktischen Koordinaten mit Zifferblättern der stereotaktischen Rahmen, bis die Nadel des Lambda (der Mittellinie Schnittpunkt der Scheitel- und Hinterhauptknochen) (Abbildung 2b) berührt.
10. Heben Sie die Nadel und stellen stereotaktischen Koordinaten bis 0,8 mm lateral und 1,5 mm rostral des Lambda (Abbildung 2b).
11. Senken Sie die Nadel bis sie berührt und leicht Vertiefungen der Haut. Messen Sie die Koordinaten. Senken Sie die Nadel weitere 1,5 mm. Die Nadel wird die Haut und Schädel durchbohren, und durch die Rinde, die lateralen Ventrikel (Abbildung 2c) eingeben.
12. Verwendung des automatischen Injektors einzuspritzen 0,75 ul der DNA / PEI-Lösung mit einer Rate von 0,5 ul / min
13. Halten Sie den Welpen auf den Rahmen für eine weitere Minute, damit für die Lösung in die Ventrikel zu zerstreuen. Inzwischen betäuben andere Pup, auf Eis für 2 min in Vorbereitung für die nächste Injektion.
14. Langsam und vorsichtig heben Sie die Nadel, und setzen Sie den Welpen unter einer Wärmelampe. Überwachen der Atmung und Aktivität. Bei Bedarf bieten sanfte Stimulation der Gliedmaßen, bis erste Atmung erfolgt.
15. Bringen Sie den Welpen zu seiner Mutter, nachdem sie sich aufgewärmt hat, hat eine rosige Farbe erreicht ist, wird regelmäßig zu atmen und aktiv ist, normalerweise 5-7 min. Wenn moRe als einen Welpen zu einem Zeitpunkt eingespritzt wird, halten alle Jungtiere zusammen, bis alle Injektionen fertig sind. Wenn Injektionen länger als 30 Minuten, zurück Hälfte der Jungtiere nach der ersten 30 Minuten und den Rest am Ende des Verfahrens.
16. Überwachen Sie, dass der Damm reagiert und Pflege, um ihre Welpen. Falls erforderlich, fügen Sie ein Surrogat Mutter in den Käfig.
17. Sicherstellen, dass das Intervall zwischen Anordnen der Pup auf Eis und Platzieren unter der Wärmelampe weniger als 10 min. Je schneller Sie den Vorgang, desto besser die Überlebenszeit. Normalerweise ist die Zeit, die zu betäuben und injizieren ein Welpe ist 4 min.

3. Biolumineszenz Überwachung der Tumor Entstehung und Progression

3.1) Überwachung Plasmid Aufnahme nach der Injektion

1. 24-72 Stunden nach der Injektion, ziehen Sie alle Welpen aus Käfig und Ort der Mutter in einer 6-Well-Gewebekulturschale sauber, ein Junges pro Vertiefung.
2. Vorbereiten einer 30 mg / ml Lösung von Luciferin in normaler Kochsalzlösung oder Phosphat gelöste Puffer. Diese Lösung im Voraus und halten in kleinen Aliquots bei -20 ° C.
3. Mit einer 1 ml-Spritze mit einer 30-Gauge-Injektionsnadel ausgestattet injizieren 30 ul Luciferin subkutan zwischen den Schulterblättern des Welpen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel keine Organe zu durchdringen, durch Kneifen der Haut und heben Sie es leicht, bevor Sie die Nadel.
4. Bild sofort, mit einem In-vivo-Biolumineszenz-Imaging-System. Für die IVIS Spectrum, verwenden Sie die folgenden Einstellungen für Akquisitionen: Automatische Belichtung, große Binning und Blende f = 1.

3.2) Die Überwachung der Tumorentstehung und Progression

HINWEIS: Tiere beginnt Bilden makroskopischen Tumoren durch Biolumineszenz und Histologie nachweisbaren innerhalb 2½-6 Wochen, abhängig von der onkogenen Plasmide injiziert.

1. Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel ausgerüstet injizieren 100 ul einer 30 mg / ml Luciferin-Lösung intraperitoneal.
2. Legen Sie das Tier in Narkose Kammer. Injizieren bis zu fünf Tieren zur selben Zeit.
3. Warten Sie 5 Minuten starten Sie dann den Sauerstoff / Isofluran Strom (1,5 bis 2,5% Isofluran), um die Tiere zu betäuben. Nach 3-4 Minuten, entfernen Sie die Tiere aus der Narkose Kammer, starten Sie den Sauerstoff / Isofluran Fluss in der Biolumineszenz-Kammer. Legen Sie die Tiere in den jeweiligen Schlitzen mit Glas Bugspitzen ausgestattet, um für Anästhesie und ungehinderten Durchgang von Licht zu ermöglichen.
4. In der Regel erwerben eine Reihe von 6 Bildern, bei 2-minütigen Intervallen mit einer automatischen Belichtungszeit, Median Binning und offener Blende von f = 1.
5. Stellen Sie die Region von Interesse für alle Tiere abgebildet wird, in der Regel ein Oval über den Kopfbereich, und messen Sie die Lumineszenz-Intensität mit den kalibrierten Einheiten Photonen / s / cm ² / sr.
6. Notieren Sie den maximalen Wert für jedes Tier. Anschließend können Aufnahmen während des Fortschreitens des Tumors für jedes Tier und / oder zwischen den Tieren verglichen werden, beispielsweise when verschiedene Behandlungen eingesetzt.

4. Die histologische und immunohistochemische Analyse der New GBMs

HINWEIS: Wenn die Tumoren die gewünschte Versuchszeitpunkt erreicht ist, können die Tiere getötet werden, Gehirn durchblutet, fixiert und analysiert. Überlebensanalysen der moribunden Stufe stellt den Endpunkt des Versuchs, wenn die Tiere auf humane Weise bei den ersten Anzeichen von Tumorlast geopfert, wie sie in der klinischen Phase definiert, wenn das Tier symptomatisch zeigt beeinträchtigt Mobilität, gekrümmte Haltung und ungepflegten Fell. Eine kurze Beschreibung der üblichen histologischen und immunhistochemischen Verfahren verwendet wird unten dargestellt.

4.1) Perfusion und Fixierung

1. Anesthetize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin.
2. Überprüfen Sie die Pedalreflex durch Einklemmen des Fußes der Maus. Wenn dieser Reflex wird abgeschafft, was tiefe Narkose, immobilize die Maus auf eine Dissektion Bord mit Stiften, öffnen Sie die Bauchhöhle, sezieren die Membran und öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz zu visualisieren.
3. Legen Sie eine stumpfe 20-Gauge-Kanüle in die linke Herzkammer. Verbinden der Kanüle mit Kunststoffschlauch durch eine Schlauchpumpe in einen Behälter mit sauerstoffreichem und heparinisiertes Tyrode-Lösung (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl ₂ 2H ₂ O, 0,005% NaH ₂ PO _4, 0,1% Glucose, 0,1% NaHCO _3, 0,02 % KCl). Starten des Flusses von Tyrode-Lösung, die durch Einstellen der Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe, um eine langsame und konstante Strömung etwa einem Tropfen pro Sekunde oder weniger, wenn die Tiere sind kleiner gewährleisten.
4. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof des Herzens, um den Abfluss von Blut und Tyrodes ermöglichen.
5. Überwachen Perfusion Effizienz durch Beobachten Blanchierung von inneren Organen, wie sie frei von Blut werden (in der Leber und Niere naheliegendste).
6. Wenn dieLösung Ablassen aus dem Herzen ist klar (3-5 min), schalten die Lösungen aus Tyrode-bis 4% Paraformaldehyd für die Fixierung (4% PFA, pH 7,34 in phosphatgepufferter Salzlösung).
7. Überwachen gute Fixierung des Gewebes durch die erhöhte Steifigkeit des Halses und Schwanz.
8. Enthaupten Sie die Maus und sorgfältig sezieren das Gehirn aus dem Schädel.
   1. Ziehen Sie das Fell, die den Schädel deckt rostral, gegen die Nase zu, und sichern Sie sie fest, um den Kopf, Rückenseite bis zu stabilisieren.
   2. Mit einem scharfen Skalpell entlang der Kante der Bahn nach unten geschnitten, um die Orbitalmuskeln und die zugrunde liegenden Jochbeinbogen durchschneiden.
   3. Drehen Sie den Kopf Bauchseite nach oben und nehmen befestigt Nackenmuskulatur mit einer Zange. Crush the ersten Wirbel und entfernen Sie sie aus dem Hirnstamm.
   4. Visualisieren Sie die Cochlea, greifen die darüber liegenden Felsenbein mit der Zange, und erstellen Sie eine Öffnung zwischen dem zeitlichen und Hinterhauptbein. Ziehen Sie die Hinterhauptbein von der Oberfläche des Kleinhirns.
   5. Crush den Knochen, die über der Nase mit der Zange. Entfernen Sie vorsichtig die verbleibende frontalen und parietalen Knochen von der Oberfläche des Gehirns, wenn ich denke, dass die Oberfläche des Gehirns schädigen. Achten Sie besonders in der Augenhöhlenbereich.
   6. Drehen Sie den Kopf Bauchseite nach oben. Das Gehirn wird nach unten von dem Rest des Schädels gleiten nun ausschließlich durch die Hirnnerven verbunden. Mit einer kleinen Schere schneiden Sie die olfaktorischen, Optik und Trigeminus. Dies wird das Gehirn freizugeben.
9. Zeigen Gehirn in 4% PFA über Nacht bei 4 ° C für Postfixierung.
10. Für die histologische Analyse und Hämatoxylin-Eosin-Färbung, übertragen Sie die Gehirne zu Phosphatpuffer für 24 Stunden und gehen dann der Paraffineinbettung.
11. Für immun histologischen Analyse übertragen Gehirne in einer 30% igen Saccharoselösung in phosphatgepufferter Salzlösung für 24-48 h (bis die Köpfe sinken auf den Boden des Röhrchens)
12. Abschnitt Gehirn in zwei Hälften durch die Mitte der Tumorregion, setzen Sie den SchnittSeite nach unten in einen Gefrierform, einbetten in eine Aufschlämmung aus Trockeneis-Ethanol, Trockeneis Isopentan oder in flüssigen Stickstoff in Kryo-Einbetten von Medien (OCT-Verbindung) und Flash-Freeze. Halten Gefrierblöcken bei -80 ° C bis zum Schneiden und Färben.

4.2) Hämatoxylin-Eosin-Färbung von in Paraffin eingebetteten Gehirne für Histo-pathologische Analyse der Eigen GBMs

1. Abschnitt Paraffin eingebetteten Gehirne bei 4 & mgr; m Dicke, fallen in einem 42 ° C Wasserbad und montieren auf Glasobjektträger.
2. De-Paraffin säubern gleitet, indem sie für 10 min in einem Ofen bei 60ºC und dann ihre Übertragung in Abständen von 5 min durch eine Reihe von drei Schiebe Behälter mit Xylol gefüllt.
3. Hydratisieren die Folien durch eine Reihe von Ethanolbäder: 100% Ethanol für 2 Minuten, einmal wiederholen, 95% Ethanol für 2 Minuten, einmal wiederholen, 70% Ethanol für 2 min und dann übertragen Folien zu Wasser.
4. Färben die Folien durch Eintauchen in eine Folie-Container mit Harris Hämatoxylin gefüllt 2 min.
5. Spülen mit Leitungswasser, bis das Wasser klar ist.
6. Dip gleitet zweimal in Blaufärbung (0,1% Natriumbikarbonat).
7. Lassen Sie Folien stehen in Leitungswasser 2 Minuten lang, dann auf 80% Ethanol zu übertragen für 2 min.
8. Färben die Folien durch Eintauchen in einen Behälter mit Eosin gefüllt für 5 min.
9. Entwässern Folien in einer Reihe von Ethanolbädern (80% Ethanol 3-4 Einbrüche, 95% Ethanol 2 min, wiederhole noch einmal, 100% Ethanol 2 min, wiederhole noch einmal).
10. Klar mit 3 aufeinanderfolgenden Bädern Xylol je 3 min.
11. Deckglas mit einer Xylol-basierte Montage Medium und lassen, bis sie zur Bildgebung trocken auf einer ebenen Oberfläche bei Raumtemperatur. Lagerung bei Raumtemperatur.

4.3) Immunhistochemie von kryokonserviert Embedded Gehirne für Molekulare und zelluläre Charakterisierung von De-novo-Induced GBMs

1. Abrufen Gefrierblöcken aus dem -80 ° C Lagerung, legen Sie in Kryostaten und ermöglichen Temperaturen für 30 Minuten ins Gleichgewicht kommen.
2. § 12-14 & Mgr; m dicke Schnitte und montieren 2-3 Schnitte auf positiv geladene Objektträger aus Glas. Schneiden Abschnitte seriell, durch das Sammeln von benachbarten Abschnitten auf verschiedenen Rutschen. Dies ermöglicht die Färbung mit verschiedenen Antikörpern an benachbarten Gewebeabschnitten innerhalb des Tumors.
3. Trockenrutschen in einem Exsikkator für mindestens 1 Stunde nach Schneiden für gute Haftung des Gewebes ermöglichen.
4. Erstellen Sie eine hydrophobe Barriere (mit einer hydrophoben Marker) an jedem Ende des Schiebers, für Flüssigkeit, um die Abschnitte zu decken und auf dem Objektträger in den Waschanlagen bleiben können. Umfassen die Abschnitte mit einer Lösung von phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,1% Triton-X (PBS 0,1% Tx) und schütteln für 5 min auf einem Horizontalschüttler, um das Gewebe zu permeabilisieren. Zweimal wiederholen.
5. Blockieren unspezifische Bindung mit einer Lösung von 10% normalem Ziegenserum (oder Serum aus dem Tier, in dem der sekundäre Antikörper gezüchtet wurde) für 30 min unter leichtem Schütteln
6. Planen primärer Antikörperlösung in 2% normalem Ziegenserum in PBS 0,1%Tx und pipettieren Sie die Lösung in den Abschnitten. Die Objektträger in eine feuchte Kammer überzogen in der Dunkelheit bringen und Raumtemperatur über Nacht.
7. Am nächsten Tag waschen Abschnitte dreimal 5 min mit PBS 0,1% Tx und Inkubation in fluoreszierenden sekundären Antikörper in 2% normales Ziegenserum PBS 0,1% Tx für eine Stunde verdünnt.
8. Dreimal waschen Abschnitte für 5 Minuten mit PBS 0,1% Tx, mit einer Kernfärbung (zB DAPI) für 2 Minuten gegenfärben, waschen Sie einmal mehr deutlich, in Wasser und Deckglas mit einem wasserbasierten Montage Medium, das die Fluoreszenz erhalten wird. Die Objektträger auf eine ebene Fläche und lassen Sie sie zu heilen für mindestens 24 Stunden, in der Dunkelheit, bis sie zur Bildgebung. Halten bei 4 ° C danach.

5. Generation des Primärtumorzelllinien mit spezifischen genetischen Veränderungen.

1. Für Zelllinien aus Dornröschen tumortragenden Mäusen zu erzeugen wählen Sie eine Maus mit bestätigten großen Tumor (Biolumineszenz 10 ⁷ bis 10 ⁸ Photonen / s / cm2 / sr).
2. Euthanize Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran Narkose, enthaupten, das Tier und sorgfältig sezieren das Gehirn aus dem Schädel (wie in Kapitel 4 beschrieben). Stellen Sie das Gehirn in einer sauberen Petrischale.
3. Mit einer Rasierklinge, stellen koronalen Schnitte vor und hinter dem Tumor. Die Lage des Tumors ist in der Regel erkennbar aufgrund der Transparenz des Gehirns.
4. Präparieren Sie den Tumor in der Regel 5-7 mm Durchmesser mit feinen Pinzetten und in einen 1,5-ml-Röhrchen mit 300 ul Neural Stem Cell Medien gefüllt (NSC Medium: DMEM / F12 mit B-27 zu ergänzen, zu N2 zu ergänzen, und Normocin, ergänzt humanes rekombinantes EGF und bFGF in einer Konzentration von 20 ng / ml).
5. Homogenisieren sanft Tumors mit einem Kunststoff Stößel, die mit den Wänden des Rohrs passt.
6. 1 ml enzymfreier Gewebedissoziation Lösung und bei 37 ° C für 5 min.
7. Pass Zellsuspension durch ein 70 um Zellsieb, waschen Sie die Filter mit 10 mlNSC Medien, bei 300 g zentrifugiert 4 min, dekantieren Überstand und resuspendieren Pellets in 7 ml NSC Medien.
8. Platte auf einem T25-Kulturkolben und die Kultur bei 37ºC in einem Gewebekultur-Inkubator mit und Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO _2. Nach 3 Tagen wurden einige Zellen starben, einige an der Unterseite der Petrischale geklebt, und einige sind Bilden Neurosphären in den Medien frei schwebend.
9. Entfernen Sie diese suspendierten Zellen und Wiederplatte auf einen T75-Zellkulturflasche.
10. Nach weiteren drei Tagen Kultur sammeln Neurosphären, zu distanzieren, wie in Schritt 5.6 beschrieben, Belastung durch Zellsieb und zählen Zellen. Gefriert Aliquots von Zellen in fötalem Rinderserum 10% DMSO und Passage-Zellen in einer Dichte von einer Million Zellen in 14 ml NSC mit EGF und FGF eine T75-Flasche ergänzt. Die Wachstumsrate wird auf die zur Tumoren bilden Onkogene abhängen. Anzupassen Zellkulturbedingungen, um Hypertrophie zu verhindern und Zellen bei relativ hoher Dichte.

Ergebnisse

Um histopathologischen Merkmale SB induzierten Glioblastome charakterisieren, C57 / BL6 neugeborenen Mäusen wurden an P1 mit einem Plasmid, das für Luciferase (PT2 / SB100x-Luc) in Kombination mit Plasmiden, Transposons Codieren mit onkogener DNA, dh NRAS (pT / CAGGS spritzt -NRASV12) und SV40 LgT (Pt / CMVSV40-LgT) (3c) oder ein Plasmid, das eine kurze Haarnadel-p53 mit PDGFβ und GFP-Reporter (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in Kombination mit NRAS (Abbildung 3d Codierung). Die ...

Diskussion

In diesem Artikel werden wir ausführlich ein vielseitiges und reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung von neuen Modellen der GBM mit SB transposase- vermittelte Integration onkogenen Plasmid-DNA in die Zellen umgebenden Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen. Wir stellen ein Protokoll zur Transposon-Plasmiden mit neuen Genen von Interesse zu erzeugen, zu veranschaulichen, wie das Fortschreiten von Tumoren in lebenden Tieren zu überwachen und, wie histopathologischen und immunhistochemischen Eigenschaften dieser ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20 oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
[header]
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified)	Fisher Scientific	314-631