Generierung von lymphatische Mikropartikel und Nachweis ihrer pro-apoptotische Wirkung auf die Epithelzellen der Atemwege

Zusammenfassung

Zellmembran-Schuppen-Mikropartikel (MP) aktiv biologischen Vesikel, die isoliert werden können und deren pathophysiologische Effekte in verschiedenen Modellen untersucht. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Erzeugen MPs von T-Lymphozyten (LMPs) abgeleitet und zur Demonstration ihrer proapoptotischen Effekt auf Epithelzellen der Luftwege.

Zusammenfassung

Das Interesse an der biologischen Rolle von Zellmembranen abgeleiteten Vesikeln in Zell-Zell-Kommunikation in den letzten Jahren erhöht. Mikroteilchen (MPs) sind eine solche Art der Bläschen, deren Durchmesser von 0,1 um bis 1 um und typischerweise von der Plasmamembran von eukaryotischen Zellen, die Aktivierung oder die Apoptose zu vergießen. Hier beschreiben wir die Erzeugung von T-Lymphozyten abgeleiteten Mikroteilchen (LMPs) von apoptotischen CEM T-Zellen mit Actinomycin D. LMPs werden durch einen mehrstufigen Differenz Zentrifugationsverfahren isoliert und mittels Durchflusszytometrie stimuliert. Dieses Protokoll stellt auch eine in situ Zelltod Nachweismethode für den Nachweis der proapoptotischen Wirkung LMPs auf bronchialen Epithelzellen aus Maus primären Atem bronchiale Gewebeexplantaten abgeleitet. Hierin beschriebene Verfahren eine reproduzierbare Verfahren zur Isolierung reichliche Mengen von LMPs apoptotische Lymphozyten in vitro. LMPs abgeleitetin dieser Weise verwendet werden, um die Eigenschaften der verschiedenen Krankheitsmodellen zu bewerten und für pharmakologische und toxikologische Prüfung. Da das Atemwegsepithel bietet eine Schutz physische und funktionelle Barriere zwischen der äußeren Umgebung und der darunter liegenden Gewebe, stellt die Verwendung von Bronchialgewebe Explantate nicht immortalisierte Epithelzellen Linien ein effektives Modell für Untersuchungen Atemwegstrakt Gewebe erfordern.

Einleitung

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

Protokoll

HINWEIS: Männliche C57BL / 6-Mäuse (5-7 Wochen alt) werden von Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada.) Und nach Protokollen von der CHU Sainte-Justine Animal Care Committee genehmigt manipuliert. Maus Bronchialgewebe Explantate eine gute Quelle von Primär bronchialen Epithelzellen zur Untersuchung der proapoptotischen Wirkung von LMPs auf Epithelzellen. Dieses Protokoll beschreibt die synthetische Entwicklung LMPs sowie ein Verfahren zum Nachweis apoptotischer Epithelzellen auf LMPs behandelten bronchiale Gewebeexplantaten. Dieses Protokoll besteht aus drei Abschnitten.

1. LMPs Herstellung und Charakterisierung

HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass alle in diesem Experiment verwendeten Materialien sind steril und autoklaviert. Alle Schritte bei Raumtemperatur in einem biologischen Sicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen, sofern nicht anders angegeben.

1.1) Stimulation und Sammlung von Abgeordneten⁹

1. Auftauen ein Aliquot von 10 Millionen CEM-T-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Verdünne in 10 ml vorgewärmten serumfreien hämatopoetischen Medium wie X-VIVO, in einem 15 ml sterilen Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g × 5 min. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 5 ml vorgewärmten Medium.
2. Übertragungszellen in einen T75-Gewebekulturkolben (für Suspensionskulturen) mit 15 ml vorgewärmten hämatopoetischen Medium wie X-VIVO und Inkubation für 4 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO _2.
3. Nach 4 Tagen übertragen alle Kulturmedium und Zellen in einen T175 Gewebekulturflasche mit 100 ml frischem Medium. Weiter Inkubieren der Zellen für ungefähr 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen, bis sie zu einer Dichte von 2 Mio Zellen / ml gezüchtet.
4. Gleichmäßig auf vier T175-Flaschen, die jeweils 150 ml frischem Medium und weiterhin Zellkultur, bis Zellen (etwa 48 h Inkubation) zu einer Dichte von 2 Millionen / ml gezüchtet Teilen von Zellen.
5. Sammeln Zellen aus jedem Kolben durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten und Resuspendieren 300 x 10 ⁶ Zellen in ein neues T175-Kolben, der 150 ml frisches Medium, um den 2 Millionen / ml Zelldichte aufrechtzuerhalten.
6. Hinzufügen Actinomycin D (gelöst in DMSO bei 2 mg / ml) zu dem Medium in einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml und Inkubation für 24 Std.
7. Lassen Sie das gesamte Kulturmedium in 50 ml konischen Röhrchen und Spin-down werden die Zellen bei 750 g für 5 min. Den Überstand in 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 1.500 g für 15 Minuten, um große Zellbruchstücke zu entfernen.
8. Den Überstand in einen 250 ml-Flasche und Ultrazentrifuge bei 12.000 × g für 50 min. Überstand verwerfen und sammeln Pellets.
9. Wasch LMPs angereicherten Pellets mit 40 ml sterilem PBS in ein 50 ml Röhrchen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 50 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
10. Sammeln Sie die letzten Waschüberstand; wird sie als Fahrzeugsteuerung verwendet werden. Suspend die LMPs Pellets in 1ml PBS und Übertragung in einem 1,5 ml sterilen Mikroröhrchen. Aliquotieren und Speicher isoliert LMPs bei -80 ° C (um mehrere freie und Auftauen zu vermeiden).

1.2) Charakterisierung der Abgeordneten über FACS-Analyse ⁴

1. Planen 2 Proben von Annexin Puffer, 1 mit und andere ohne CaCl _2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus oder minus 5 mM CaCl _2.
2. Filtern Annexin Puffer und FACS Strömungs Hüllfluid mit einem 0,22 um Filter, um Partikel zu entfernen.
3. Verdünnen Sie 1 ul LMPs in 44 ul von Annexin-Puffer mit 5 mM CaCl ₂ in einer FACS-Röhrchen. Bereiten anderes Rohr mit 1 ul LMPs in 44 ul Annexin Puffer ohne CaCl ₂ (Negativkontrolle).
4. In 5 ul der Annexin-Cy5 in jeder Röhre und gut mischen. Inkubieren für 15 min bei RT im Dunkeln. Die Reaktion durch Verdünnen der Mischung mit 400 ul FACS Fluss Mantelfluid in jedem Röhrchen.
5. In 10 ul (200.000 Kügelchen) von 7 um das Zählen beads Suspension als interner Standard in jedem Röhrchen, um eine absolute Anzahl ermitteln.
6. Stellen Toren der relativen Größe (FSC-H, PMT E00, logarithmischer Maßstab) und die relative Granularität (SSC-H, PMT 325, logarithmischer Maßstab) Dot-Plot auf dem Durchflusszytometer mit Größe kalibriert fluoreszierende Kügelchen von 1 um (Tor 1) und Zählen Perlen Tor bei 7 um (Tor 2).
7. Analysieren Sie den LMPs Probe auf FSC-H / SSC-H Grundstück mit den etablierten Toren und FL-4-Kanal für Annexin (PMT 765, logarithmischer Maßstab) Dot-Plot, durch Erfassen eines Signals, bis 20.000 Zählen Perlen sind in Tor 2 erreicht.
8. Ermitteln Sie die positive Annexin Ereignisse LMPs in Annexin-Puffer, der CaCl _2, und dann die Ereignisse des LMPs in Annexin Puffer subtrahieren ohne CaCl ₂ (Negativkontrolle).
9. Berechnung der absoluten Anzahl der MPs basierend auf der folgenden Gleichung:
   

1.3) Bestimmung des MP Protein Konzentration (Bradford-Assay)

1. Bereiten 5 Reihenverdünnungen eines Proteinstandard 1,25-20 ug / ml. Pipette 800 ul jeder Standard- und Probenlösung in ein sauberes Reagenzglas in zweifacher Ausfertigung. Gib 200 ul Brad Farbstoffreagens zu jedem Röhrchen. Gut mischen, dann bei Raumtemperatur für 5 min.
2. Messung der Extinktion bei 595 nm. Bestimmung der Proteinkonzentration von LMPs der linearen Regression der Standardkurve.

2. Bronchial Gewebeexplantaten und LMPs Behandlung

HINWEIS: Achten Sie besonders auf die sterile Arbeitsumgebung, und aseptisch bereiten die Lösungen und mittel folgenden Experimenten verwendet. Um die vollständige Heilung Medium vorbereiten, 1 ml der Gewebeheilung Mittelergänzung mit Serum (auf Eis aufgetaut) auf 100 ml Gewebeheilung Medium und gut mischen.

2.1) Herstellung von Bronchialgewebe Explantate

1. Vor dem Kultivieren zerkratzen 6 Bereiche von 1 cm ²jeweils an der Kante der Fläche von je 100 mm Gewebekulturschale mit einem Skalpell. Coat jeweils zerkratzt 100 mm Gewebekulturschale mit 2 ml der Kulturschale Beschichtungslösung und Inkubation wird die Schale in einem befeuchteten CO ₂ -Inkubator O / N bei 37 ° C. Vakuum saugen Sie den Überschusslösung und füllen Sie die Schale mit 15 ml Gewebewaschmedium.
2. Euthanize C57BL / 6-Mäuse (5-7 Wochen alt) durch CO ₂ Inhalation nach Protokollen, die von der Tierpflege Ethik-Kommission genehmigt.
3. Aseptisch sezieren Lungengewebe mit Skalpell, Dumont superfeinen Pinzette und chirurgische Schere. Parenchym und Blutgefäße vorsichtig entfernen. Zeigen Lungengewebe in eiskaltes Gewebewasch Medium für den Transport ins Labor, falls zutreffend.
4. Ferner sezieren Bronchus im Tissue Waschmedium getaucht und trenne die Bronchien mit einem Durchmesser von 1 bis 2,5 mm vom peripheren Lungengeweben. Scheibe Bronchialgewebe in ca. 5 mm dick Bronchien Ringe mit einem Skalpell.
5. Verwenden Sie einen Schöpfbewegung mit den sterilen gebogenen microdissecting Pinzette zu holen die bronchiale Fragmente und legen Sie sie auf die verkratzten Stellen der Gerichte.
6. Entfernen Sie die Gewebewaschmedium und bebrüten die Fragmente bei RT ~ 5 Minuten, damit sie an die Gerichte zu halten.
7. 10 ml komplette Heilung Medium zu jeder Schale und legen Sie sie in einer kontrollierten Atmosphäre modulare Inkubatorkammer. Spülen Sie die Kammer mit hoher O ₂ Gasgemisch (70% O _2, 25% N ₂ und 5% CO _2). Legen Sie die Kammer in einem Benchtop Orbital-Inkubator und schütteln Sie sie bei 37 ° C. Schüttle die Kammer für 24 h bei 10 Zyklen pro Minute, bis das Medium, um intermittierend über die Fragmente fließen.
8. Nach 24 Stunden Inkubation, beachten Sie Gewebeexplantaten unter einem Phasenkontrast-invertierten Lichtmikroskop. Wählen bronchiale Explantate mit kompletter, feines Haar Bewegung und lebendige Bronchialepithel für nachfolgende LMPs Behandlung.

2.2) LMPs Behandlung

1. Bereiten komplette Wachstumsmedium wie folgt: Tau-Wachstumsmedium ergänzt mit Serum und Fibroblasten-Inhibitor auf Eis. 1 ml des Wachstumsmediums ergänzt mit Serum und 200 ul Fibroblasteninhibitor zu 100 ml des Wachstumsmediums; gründlich mischen. Erwärmen die vollständige Wachstumsmedium bei 37 ° C für 10 min vor der Verwendung.
2. Verdünne isoliert LMPs in ein neues steriles Eppendorf-Röhrchen mit PBS auf eine LMPs Lager in einer Konzentration von 800 ug / ml herzustellen.
3. Mit 0,5 ml vollständigem Wachstumsmedium in jede Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte.
4. Übertragung der gewählten bronchiale Explantate mit den gekrümmten microdissecting Pinzette aus dem vorherigen Protokoll (Abschnitt 2.1) in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte.
5. Beschriften Sie die Kulturplatte angemessen auf LMPs Behandlung Brunnen und Kontrollvertiefungen zu identifizieren. In 25 ul LMPs Lager ineinander LMPs Behandlung gut (für eine Endkonzentration von 40 ug / ml) und 25 ul Kontrollfahrzeug (siehe LMP s-Produktion) zu den Kontrollvertiefungen.
6. Fortsetzung der Inkubation in einer kontrollierten Atmosphäre modularen Inkubatorkammer bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
7. Nach 24 Stunden, waschen Explantate 3-mal mit PBS und fahren Sie mit dem nächsten Schritt (4% Paraformaldehyd [PFA] Fixierung).

3. Histopathologische Untersuchung

3.1) die folgenden Lösungen an, bevor Sie den nächsten Schritte

1. Bereiten 1x PBS-Puffer hergestellt, indem 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,76 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4.
2. Die Herstellung von 4% PFA, aufzulösen 20 g PFA in 400 ml Wasser, bei 60 ° C unter Rühren erhitzt; ein paar Tropfen von 10 M NaOH, um die Lösung zu löschen. Next hinzufügen 1x PBS-Puffer und die Lautstärke auf 500 ml und pH-Wert auf 7,4. Filter und aliquoten; bei -20 ° C.
3. Bereiten Sie die folgenden Austrocknung oder Rehydrierung Reagenzien; 100%, 90%, 70%, 50% Ethanol und Xylol.

e_step "> 3.2) Explantation Fixierung und Gewebeschnitten Entparaffinierung

1. Legen Sie jedes Explantat in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,5 ml 4% PFA und Inkubation O / N bei 4 ° C. Zweimal Spülen Sie die Explantate mit 1x PBS.
2. Entwässern Explantate durch eine Alkoholreihe (70% Ethanol: jeder 3-mal 30 Minuten, 90% Ethanol: je 2 mal 30 min; 100% Ethanol: 3 mal 30 Minuten jeweils, dann Xylol: 3 mal 20 Minuten jede). Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur in einem Abzug.
3. Imbed Gewebeexplantate in Paraffin bei 58 ° C in einem Ofen. Bereiten Sie 5 um dicken Gewebeschnitten unter Verwendung eines Rotationsmikrotoms.
4. Schweben Sie die Abschnitte in einem 56 ° C Wasserbad, und montieren Sie die Schnitte auf beschriftet histologischen Präparaten. Objektträger in manuelle Färbung Racks und trocken bei 65 ° C für 1 Stunde. Die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
5. Tauchen Sie die Racks in 4 aufeinander folgenden Fleckenschalen mit Xylol 10 min je nach Paraffin zu entfernen. Tauchen die Racks mit einer Ethanolserie Entfernung von Xylol: 100%, dann 95%, then 80%, dann 70%, dann 50% Ethanol (5 Minuten für jeden Schritt). Spülen Sie die Ständer mit Leitungswasser für 5 Minuten, um Ethanol zu entfernen.

3.3) Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung

1. Weiterhin mit den Gewebeschnitten; legen die Zahnstange in einen Färbetrog mit Mayers Hämatoxylin gefüllt für 15 min. Spülen Sie das Rack mit Leitungswasser auf Hämatoxylin für 20 Minuten zu entfernen.
2. Platzieren in destilliertem Wasser für 30 sec.Place in 95% Ethanol für 30 sec. Platzieren Sie in Eosin G Färbelösung Gericht für 1 min. Dehydratisieren durch 2 Änderungen von 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol, jeweils 2 min.
3. Führen Sie eine schnelle Überprüfung unter dem Mikroskop, damit überschüssiges Eosin wird entfernt. Zeigen 2-3 Tropfen Eindeckmedium (Fisher SP15-100) auf jeder Folie, dann decken mit einem Deckglas.

3.4) In-situ-Cell Death Detection: TUNEL Assay

1. Bevor Sie beginnen, bereiten Proteinase K Arbeitslösung: 20 ug / ml in10 mM Tris / HCl, pH 7,4.
2. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 5 von Ziffer 3.2 (Explantation Fixierung und Gewebeschnitt Entparaffinierung). Spülen Sie die Folien mit deionisiertem H ₂ O
3. Tauchen Sie die Objektträger mit 1x PBS für 10 min. Lassen Sie das überschüssige PBS. Inkubieren Gewebeschnitten 30 min bei RT mit Proteinase K-Arbeitslösung. Rinse gleitet zweimal mit 1 × PBS.
4. Führen Sie die TUNEL-Assay, wie in der Bedienungsanleitung der Zelltod-Nachweis-Kit beschrieben. Montieren Sie mit Eindeckmedium und Deckglas von Hand mit Deckgläsern.
5. Analysieren Sie die Proben unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie Image Pro 4.5, um die apoptotischen Zellen in der braunen Farbe analysieren.

Ergebnisse

LMPs wurden mit Annexin V-Färbung ¹⁰ durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse und gated mit 1 & mgr; m-Perlen, in dem 97% der Abgeordneten (≤1 um) waren Annexin-V-positiven Cy5 gekennzeichnet (Abbildung 1A und 1B). Typischerweise wurden etwa 2,5 mg LMPs nach diesem Protokoll erhalten. Bronchialgewebe Explantaten aus C57BL / 6-Mäuse wurden zum Träger und LMPs Behandlung unterworfen. Histopathologische Analyse Bronchialsegmente zeigte die Wirkung von LMPs auf die struk...

Diskussion

Abgeordnete sind aktive Vermittler der interzellulären Übersprechen und deren Studie ist in vielen Bereichen der Wissenschaft verspricht. ¹¹ Diese Studie präsentiert ein detailliertes Protokoll für die in-vitro-Groß Generation LMPs von einem apoptotischen T-Zelllinie abgeleitet. Diese Abgeordneten zum Ausdruck bringen ein großes Repertoire an Lymphozyten-Molekülen und sind biologisch in der Regulation von Zell- und Gewebe Homöostase beteiligt ist. Jedoch kann LMPs aus verschiedenen Quellen ab...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E