Morris Wasser-Labyrinth-Test: Optimierung für Mausstamm und Testumgebung

Zusammenfassung

This manuscript describes a Morris water maze (MWM) protocol tailored for use with a commonly used mouse model of Alzheimer's disease. The MWM is widely used in transgenic mouse models. Implementation of a procedure sensitive to the background strain of the mouse model is essential for detecting group differences.

Zusammenfassung

The Morris water maze (MWM) is a commonly used task to assess hippocampal-dependent spatial learning and memory in transgenic mouse models of disease, including neurocognitive disorders such as Alzheimer’s disease. However, the background strain of the mouse model used can have a substantial effect on the observed behavioral phenotype, with some strains exhibiting superior learning ability relative to others. To ensure differences between transgene negative and transgene positive mice can be detected, identification of a training procedure sensitive to the background strain is essential. Failure to tailor the MWM protocol to the background strain of the mouse model may lead to under- or over- training, thereby masking group differences in probe trials. Here, a MWM protocol tailored for use with the F1 FVB/N x 129S6 background is described. This is a frequently used background strain to study the age-dependent effects of mutant P301L tau (rTg(TauP301L)4510 mice) on the memory deficits associated with Alzheimer’s disease. Also described is a strategy to re-optimize, as dictated by the particular testing environment utilized.

Einleitung

Transgene Mausmodelle maßgeblich bei der Bewertung der Pathophysiologie der Alzheimer-Krankheit (AD) sowie das Potential therapeutischer Maßnahmen. Kognitiven Aufgaben, wie zB die Morris-Wasserlabyrinth (MWM), sind häufig mit dieser Modelle verwendet werden, um die molekularen Korrelate von Gedächtnisstörungen zu erkennen und um die Wirksamkeit von vorklinischen Medikamente. Entscheidend ist jedoch, dass der dynamische Bereich der kognitiven Aufgabe breit genug ist, um feine Behandlungswirkungen erkennen. Mit Maus-Modellen der AD, sind kognitive Defizite in der Regel altersabhängig und Mäuse zeigen fortschreitende Rückgang der Leistung (zB ^1). Verwendung eines empfindlichen kognitive Aufgabe kann die Erfassung feiner Unterschiede früher im Leben des Tiers zu ermöglichen, wodurch die Kosten, die mit älteren Tieren assoziiert reduziert wird. Zum Beispiel die Verringerung der Anzahl der Trainingsversuche bei den hippocampalen abhängigen Barnes maze 15-5 erhöht die Schwierigkeit der Aufgabe, was zu der detection von Defiziten in der 3xTg Modell in einem früheren Alter als zuvor berichtet ^2. Früherkennung von Defiziten bietet nicht nur erhebliche Zeit- und Kosteneinsparungen, sondern erhöht auch die Wahrscheinlichkeit, dass die zugrundeliegenden molekularen Veränderungen kognitive Defizite identifiziert werden können.

Ein Faktor, der die Empfindlichkeit des kognitiven Aufgaben ist der genetische Hintergrund Stamm der Maus-Modell. B. BALB / c-Mäuse zeigen eine überlegene Leistung bei Lern- und Gedächtnisaufgaben gegenüber anderen Stämmen, wie C57BL / 6 ^3. F1 FVB / N x 129S6 Hintergrund wird für zwei der am häufigsten verwendeten Modelle von AD, der Tg2576 und rTg (TauP301L) 4510 Modellen verwendet. Dieser Stamm zeigt bessere Lernfähigkeit in der MWM in Bezug auf andere Stämme, einschließlich B6 / SJL-Mäusen ^4. Aufgrund dieser überlegenen Lernfähigkeit kann die Verwendung einer einzigen Sonde nach umfangreichen Trainingsgruppe Unterschiede von Übertraining resultierenden maskieren. Darüber hinaus ist die SENSITIVITy der Sonde Studien können altersabhängig. Wir haben früher gezeigt, daß frühere Versuche Sonde nach eingeschränkter versteckte Plattform Ausbildung sind empfindlicher auf Unterschiede in den jungen Tg2576 Vergleich zu jungen Transgen-negative littermate Steuerelemente sind als Sonde Studien nach Verstärkung der Ausbildung ⁵ eingesetzt. Im Gegensatz dazu Sonde Studien nach einer umfassenden Ausbildung sind empfindlicher bei älteren (20-25 Monate) Tg2576 Mäuse im Vergleich zu älteren Wurfgeschwistern als es früher Sonde Studien ^5. Durch Einstreuen Sonde Studien gesamten Ausbildung, wird die Wahrscheinlichkeit, daß ein empfindlich Versuch identifiziert wird erhöht, insbesondere, wenn Längsprüfung durchgeführt und die Empfindlichkeit einer bestimmten Sonde Studie ist altersabhängig. 1 zeigt die überlegene Leistung der F1 FVB / N x 129S6 Mäusen unter dem Protokoll dieser Sorte optimiert im Vergleich zu Mäusen der B6 / SJL Hintergrund unter einem Protokoll mit mehr umfassende Ausbildung geschult.

Die MWM istallgemein angenommen, um zuverlässige Maßnahmen, die reproduzierbar über Zeit und Laboratorien ⁶ geeignet sind. So wurde beispielsweise das primäre Protokoll ursprünglich von unserem Labor Minnesota ^1,7 verwendet, erfolgreich mit geringfügigen Änderungen an der West Virginia University ⁸ implementiert. In ähnlicher Weise wurden gleichwertigen Wertminderung in rTg (TauP301L) 4510 Mäuse relativ beobachtet Wurf steuern, wenn unter pathogenfreien oder üblichen Bedingungen ⁹ untergebracht. Allerdings kann die Testumgebung die Empfindlichkeit des MWM Aufgabe beeinflussen. Faktoren wie Raumbeleuchtung, Lüftungsdüsen, Temperaturgradienten, und Geräusche alle dazu beitragen, Umweltreize ^4, die letztlich Einfluss auf die Leistung. Wenn unsere Minnesota Labor und Terrarien wurden in ein neues Gebäude bewegt, bis zu einer Verringerung um 38% in Wildtyp-Leistung beobachtet, den Dynamikbereich der Aufgabe und die Möglichkeit, transgene bedingten Defizite erkennen wesentlich zu reduzieren. Diese Änderung in der performance trat trotz der Gestaltung der Testraum von vergleichbarer Größe und Konfiguration ist, und unter Verwendung der gleichen angelegten visuelle Hinweise. Ein "Wieder Optimierung" der ursprüngliche Protokoll erforderlich, um den Dynamikbereich des MWM Aufgabe in der neuen Testumgebung zu erhöhen.

Hier wird die ursprüngliche Protokoll zur Verwendung mit der F1 FVB / N zugeschnitten x 129S6 Hintergrund ⁵ beschrieben. Weil einige Studien deuten Spannung mit schlechter Leistung MWM ¹⁰ und pre-Handhabung verbunden sind, können diese belastungsinduzierte Defizit in Performance ¹¹ zu mildern, wurde eine Pre-Handhabungsprotokoll, um die Mäuse zu der Einführung und Entfernung des Pools vor MWM Test akklimatisieren . Im Anschluss an pre-Handling, Mäusen unterziehen sichtbare Plattform Training, in dem eine erhöhte Plattform mit einer Flagge markiert. Visible Plattform Training wird verwendet, um Mäuse mit Performance-Problemen zu sensomotorischen Auffälligkeiten im Zusammenhang identifizieren. Verwendung im prot beschriebenen Ausschlusskriterienocol Abschnitt, leistungs inkompetent Mäuse werden von nachfolgenden Untersuchungen der versteckten Plattform Ausbildung und Studien Sonde entfernt. Die Wertminderungen in versteckte Plattform Trainings und Sonde Studien werden als kognitive Defizite interpretiert, weil sensomotorische Leistung wird aus den Daten berücksichtigt. Nach Beendigung der sichtbaren Plattform Ausbildung beginnen Mäusen versteckte Plattform Trainings wobei die Plattform im Wasser eingetaucht und bleibt in der gleichen Position relativ zu externen Signale. Studien, in denen die Plattform entfernt wird (Sonde Studien) sind über versteckte Plattform Trainingssetzt, um den Einfluss von Zusatzausbildung zu bewerten. Da Sonde Studien zu Beginn eines jeden Tages auftreten, bevor zusätzliche versteckte Plattform Trainings, messen Sonde Studien die Fähigkeit des Tieres, um die Position der Plattform nach einer 20 Stunden Verzögerung erinnern, als ein Maß der Referenzspeicher ^12. Schließlich Weisen, in denen diese ursprüngliche Protokoll wurde erneut optimiert, wenn Änderungen in der Testumgebunggestört Regelleistung werden beschrieben.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Standards der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt und von West Virginia University IACUC genehmigt.

1. Pre-Handhabung

1. Einrichten des Pool
   1. Prop die Pre-Handling-Pool so dass es zu einer komfortablen Höhe angehoben wird.
   2. Platz 2 l Wasser (21 ° C) in der Pre-Handling-Pool auf eine Höhe von etwa 1 cm.
      Hinweis: Sie fügen Färbung nicht.
2. Verfahren
   1. Bringt die Mäuse aus dem Vivarium zu den Testraum.
   2. Stellen Sie sicher, das Thema Identifikation (vorbehaltlich Nummer, Schwanz Tätowierung, Ohrclip, etc.).
   3. Mark der Maus den Schwanz mit einem Permanent-Marker, um Mäuse innerhalb des Käfigs, die durchgemacht haben pre-Handling-Tests von denen, die zu prüfenden bleiben unterscheiden. Markieren Sie alle Mäuse in einem Käfig mit der gleichen Farbe.
   4. Legen Sie eine Maus in die Übertragungs Becher für approximadig 5 Sek. Dann vorsichtig gießen Sie die Maus aus dem Becher in die Pre-Handling-Pool.
   5. Verwendung eines Zeitgebers, damit die Maus, um in den Pool für 20 Sekunden bleiben.
   6. Nach 20 sec vorsichtig platzieren Sie die Schaufel (ohne Angel es) vor der Maus. Kurz gesagt kann der Maus, um die Schaufel zu erkunden, und, wenn nötig, zu fördern mit der Maus auf die Schaufel durch leichtes Verschieben der Schaufel unter der Maus, während langsam anheben. Darauf achten, dass die Mäuse mit der Schaufel zu erschrecken.
   7. Sobald sich der Mauszeiger in der Schaufel, transportieren sie zurück an den Haltekäfig.
   8. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Maus im Käfig einmal pro Tag für 10 Tage. In regelmäßigen Abständen (zB nach jedem Tier), nehmen Sie fäkale Boli und Betten aus dem Pool mit einem Netz.
   9. Spülen der Übertragungsbecherglas mit Wasser in regelmäßigen Abständen (zB nach dem Abschluss eines Käfigs von Mäusen).
   10. Nachdem diese Schritte abgeschlossen sind, spülen Sie die Transfer-Becherglas mehrmals mit Wasser, auskippen Wasser ausder Pool, und ungefähr zweimal spülen Sie den Pool mit Wasser.

2. Sichtbare Platform Ausbildung

1. Richten Sie die Mausleistung Tracking Software zB Viewer (Siehe Tabelle der Materialien).
   1. Kalibrieren Sie das Video, um die Dimensionen des Labyrinths unter "Konfiguration" entsprechen - "Filters und Objekte" Registerkarte.
   2. Stellen Sie Filter, so dass die Software kann eine Maus aus dem Hintergrund zu unterscheiden.
      1. Stellen Sie die "Empfindlichkeit" unter dem "Background-Filter" Bereich, so dass die Tracking-Software identifiziert das Tier.
      2. Klicken Sie auf die Option "Akzeptieren", wenn der Tracking-Software identifiziert das Tier. Wählen Sie den "edit" Option auf Bereiche außerhalb des Labyrinths Bereich Blackout.
      3. Wählen Sie den entsprechenden "Tier Filter" und "min. Tiergröße ".
2. Erstellen der Run Sheets
   1. Erstellen Sie eine Laufblatt Auflistung jedes der Maus, der potenzielle Standort, und einen Raum für Notizen, die Informationen über abweichendes Verhalten.
   2. Vorbestimmen Stellen für das sichtbare Testplattform, die die gleiche für jede Gruppe von Mäusen sind. So wird im ersten Verfahren vorge bestimmen, dass die Plattform auf der Seite gegenüber, wo die Maus ist auf der rechten Seite in der Nähe der Wand in das Labyrinth gesetzt, platziert werden. Für den zweiten Versuch, vorge bestimmen, dass die Plattform an einer anderen Position entlang der Rückwand für jede Maus platziert werden und dies wird für jeden der 6 Versuche fortgesetzt.
3. Einrichten der Zimmer
   1. Hang Vorhänge durch den Raum, so dass alle räumlichen Informationen sind verdeckt.
4. Einrichten der Tub.
   1. Setzen Sie die Wanne so entspricht der Konfiguration im Tracking-Software, indem sie die maze Spiele mit dem Konfigurations-Setup auf der "Configuration" - Registerkarte "Zone Definition". Hinweis: hELPS, um sicherzustellen, die Wanne ist in der richtigen Position vor der Befüllung mit Wasser als die Wanne nicht einfach verlagert einmal gefüllt.
   2. Füllen Sie die Wanne mit Leitungswasser, und mit einem Thermometer, sicherzustellen, dass die Wassertemperatur beträgt ca. 21 ° C. Stellen Sie sicher, dass das Wasser bleibt ein Grad der Temperatur im gesamten Prüfung, als kälteres Wasser kann die Performance vor allem bei der Verwendung von Mäusen im Alter von ⁸ auswirken.
      Hinweis: Sie fügen Färbung nicht.
   3. Mit den vorgegebenen Stellen, legen Sie die Plattform, die eine Flagge angebracht, die eine Höhe von 13 cm erreicht und ist 4,5 cm x 4,5 cm mit einem mutigen "S" förmigen Charakter auf ihr eingeprägten, in der ersten Stelle der Wanne hat, so dass sie beträgt etwa 1 Zoll oberhalb der Oberfläche des Wassers.
5. Verfahren
   1. Nehmen Sie die erste Maus aus dem Käfig, überprüfen Sie das Thema Identifikation, markieren Sie den Schwanz mit wasserfestem Stift mit der richtigen Farbe und in das Becherglas.
   2. Gently Sie die Mause in die Wanne, starten Sie den Timer, und sicherzustellen, dass die Tracking-Software verfolgt das Tier. Lassen Sie die Maus bis zu 2 min, um die Plattform zu finden. Sobald die Maus lokalisiert die Plattform, ermöglichen die Maus 20 Sekunden auf der Plattform.
   3. Wenn das Tier findet die Plattform und geht zu springen oder fallen aus, schöpfen Sie die Maus und die Maus auf der Plattform. Wenn die Maus weiter zu springen oder fallen von der Plattform, halten Sie die Maus auf der Plattform, so dass die Maus erfährt, dass noch auf der Plattform führt zu aus der Wanne zu entkommen.
      Anmerkung: Die Maus sollte auf der Plattform für eine Gesamtzeit von 20 sec zu bleiben; Somit, wenn die Maus springt nach 5 sec, die verbleibende Zeit auf der Plattform 15 sec und nicht zu 20 sec zurückgesetzt.
   4. Wenn das Tier nicht auf die Plattform in der 2 min Zeitraum zu finden, Schaufel mit der Maus und legen Sie sie auf die Plattform 20 Sek.
   5. Nach 20 sec auf der Plattform, entfernen Sie die Maus von der Plattform, wie in pre-Handling Training getan und die Maus in the beheizten Käfig mit Küchenpapier ausgekleidet und erwärmt auf ~ 31 ° C durch ein Heizkissen und Wärmelampe für 30 Sekunden. Führen Sie regelmäßige Beurteilung der Körpertemperatur mit einem Thermometer rektal, dass bestimmte Stämme von Mäusen oder Mäusen in einem bestimmten Alter zu gewährleisten sind nicht differenziell anfällig für Unterkühlung durch Bestrahlung mit dem Wasser induziert.
   6. Nach 2 min mit dem Haltekäfig mit der Wärmelampe, übertragen Sie die Maus an den Haltekäfig mit nur einem Heizkissen, jedoch kein Wärmelampe, um zwischen Studien zu erholen. Schließlich legen Sie alle Mäuse aus einer Heimkäfig in die gleiche Haltekäfig während der Prüfung.
   7. Reinigen Sie das Labyrinth von Schmutz mit einem Netz, nachdem jede Maus hat eine Studie abgeschlossen, um olfaktorischen Signale zu stören.
6. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Maus in der Gruppe. Nach jeder Maus hat die erste Studie abgeschlossen ist, bewegen Sie die Plattform auf den zweiten vorbestimmten Ort.
   Anmerkung: Die Plattform wird in der gleichen Position bei jeder Maus während einer einzelnen Studie bleiben und werdenbewegt, um den anderen vorbestimmten Stellen für die folgenden Versuche. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass Mäuse, 1) zu lernen gibt es eine Plattform, um aus, 2) schwimmen direkt auf die sichtbare Plattform und bewiesen damit, intakte visuelle Kompetenz, zu entkommen und 3) haben keine motorische Defizite.
7. Führen Sie diese Verfahren für die 6-Studien für die ersten 3 Tage der Prüfung. So führen Sie sichtbar Ausbildung auf die Prüfung den Tagen 1, 2 und 3, mit ca. 10 min zwischen jeder Studie (Abbildung 2).
8. Während sichtbare Plattform Training, verwenden Sie die Tier-Tracking-Software, um die Latenz zu messen, um die Plattform zu erreichen, verfolgen die Pfadlänge des Tieres, und schwimmen Geschwindigkeit. Erhalten diese Messungen aus dem "Wasser-Labyrinth" unter "Experimental-Liste" und Export direkt auf einer Excel-Tabelle.
   Anmerkung: Die Verwendung eines Handauslöser kann auch nützlich sein, um die Genauigkeit des Verfolgungs Software zu gewährleisten.

3. Morris Water Maze versteckte Plattform Trainings

1. Set Bis Zimmer
   1. Aufhängen Vorhänge im Zimmer zu räumlichen Informationen im Labor zu verschleiern.
   2. Zeigen Cues strategisch auf den Vorhängen. Stellen Sie sicher, dass die Signale sind groß und enthalten kontrastierenden Farben (ex .: schwarz und weiß) für eine bessere Sichtbarkeit. Dreh Signale in einem Abstand und einer Höhe, wo sie sichtbar Mäusen aus dem Inneren der Wanne sind. Hinweis: Die Hinweise sind statisch und nicht im Laufe des Tests zu bewegen.
2. Richten Sie die Mausleistung Tracking Software
   1. Kalibrieren Sie das Video, um die Dimensionen des Labyrinths unter "Konfiguration" entsprechen - "Filters und Objekte" Registerkarte.
   2. Der Filter so eingestellt, dass die Software die Mäuse vom Hintergrund zu unterscheiden.
      1. Verwenden Sie die gleichen Verfahren wie im sichtbaren Plattform-Tests beschrieben (Schritte 2.1.2.1-2.1.2.3), die Filter für Morris-Wasserlabyrinth versteckte Plattform Trainings einzurichten.
   3. Erstellen Sie vier gleiche Quadranten innerhalb des Labyrinths
      1. Klickendie Option "Ellipse" unter dem Reiter "Zone Definition" ersten, und erstellen Sie einen Kreis, der das Labyrinth auf dem Bildschirm übereinstimmt. Hinweis: Auf dieser Registerkarte wird die eigentliche Labyrinth einrichten angezeigt wird, so dass es ermöglicht die Option, den Computer-Setup mit dem eigentlichen Labyrinth Setup übereinstimmen.
      2. Klicken Sie auf die Option "Rechteck" und erstellen Sie vier gleiche Quadrate. Legen Sie diese Felder auf dem Bildschirm, um vier gleiche Quadranten innerhalb des neu geschaffenen Kreis zu erstellen.
   4. Erstellen Sie die Plattformen in das Labyrinth.
      1. Wählen Sie die Option "Ellipse", und erstellen Sie einen Kreis die Größe der Plattform, die verwendet werden soll. Hinweis: Wenn sich die Plattform in das Labyrinth kann vorher von Vorteil sein, eine Ellipse, die genaue Größe der Plattform zu erstellen.
      2. Legen Sie die neu erstellte Plattform Lage in der Mitte des Ziels Quadranten. (Es wird empfohlen, dieses Objekt "Ziel" zu nennen, um die richtigen Plattformen vom Rest zu unterscheiden). Critical Schritt: Geben Sie im Feld nur below "Grid", wählen Sie die Option "Stopp" unter "Auslöser" für die Zielplattform. Dies führt dazu, das Programm zu stoppen, wenn die Maus die Plattform erreicht.
      3. Erstellen Sie drei andere identische Plattformbereiche, und legen Sie sie in die genauen Standorte in den anderen Quadranten. Wählen Sie nicht "Stopp" in der Option "Trigger".
3. Erstellen der Run Sheets
   1. Erstellen Sie eine Laufblatt Auflistung jedes Maus, jeden Versuch, ein Raum, um die Zeit, um die Plattform zu erreichen aufzuschreiben, und einen Raum zu beachten, abweichendes Verhalten (Tabelle 1).
   2. Pre-Bestimmung der Auslösepunkt jeder Maus in einer pseudo-zufälligen Weise. Verwenden Pseudozufallsauswahl, dass der Abstand zu der Plattform gleich jeden Tag, jede der 4 Positionen wird gleichermaßen verwendet, und der Winkel vom Start bis Plattform (dh., Von links oder rechts) innerhalb und zwischen den Tagen ausgeglichen.
      Hinweis: die Position der Plattform auf der FluchtFolie, um die Position der Plattform zu gewährleisten nicht von der ursprünglichen Position zu bewegen. Sicherzustellen, dass die Plattform in der Mitte von einer der vier Zonen, die auf dem Tracking-Software erstellt wurden.
      Hinweis: Wenn Längsprüfung wird in verschiedenen Altersstufen durchgeführt, bewegen Sie die Plattform an eine neue Position in jedem Alter.
4. Einrichten des Maze
   1. Passen Sie entweder das Wasserlabyrinth oder die Kamera, so dass es eine Übereinstimmung zwischen dem Labyrinth und dem Konfigurations-Setup auf die Schaltfläche "Konfiguration" - "Zone Definition" Registerkarte.
   2. Beschriften Sie die vier Quadranten des unsichtbaren Labyrinth (N, S, E, W). Überprüfen Sie, ob diese Übereinstimmung mit der Konfiguration in der Tracking-Software, um Mäuse zu gewährleisten, die von den richtigen Ausgangspunkte freigegeben.
      Critical Schritt: Legen Sie diese Etiketten außerhalb des Labyrinths und aus der Sicht eines Schwimmtier da Signale im Labyrinth bilden eine nicht-räumliche, nicht-Hippocampus-abhängigen Aufgabe.
   3. Füllen Sie das Labyrinth mit Leitungs water (etwa 21 ° C), so dass die Plattform etwa 5 mm unterhalb der Oberfläche des Wassers.
   4. Setzen Sie die Plattform in der vorbestimmten Stelle.
      HINWEIS: Die Position der Plattform wird für alle Mäuse, die für alle Tage und Studien getestet gleich bleiben.
   5. Verwenden Sie nicht-toxische Weiß Temperafarbe das Wasser undurchsichtig zu machen. Tun Sie dies, um sicherzustellen, dass die Oberseite der Plattform ist unsichtbar aus Augenhöhe der Tiere beim Schwimmen.
5. Verfahren
   1. Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig, markieren Sie den Schwanz mit wasserfestem Stift von der richtigen Farbe, und legen Sie in den Becher.
   2. Gießen Sie die Maus sanft in das Labyrinth, so dass es tritt dem Gesicht zur Wand. Anmerkung: Jede Maus wird in der gleichen Ausgangsposition für einen besonderen Prozess platziert werden.
   3. Bei der ersten Version von der Maus, beginnen Sie den Timer und stehen in einem Gebiet, wo der Prüfer ist nicht leicht von den Mäusen sichtbar. Stellen Sie sicher, dass Tier Tracking-Software ordnungsgemäß Verfolgung des Tieres.
   4. Sobald das Tier die Plattform erreicht wurde, sollte es auf der Plattform 15 Sekunden bleibt.
      Anmerkung: Dies ermöglicht es dem Tier zu orientieren, seine räumliche Lage im Raum.
   5. Nach 15 sec auf der Plattform, entfernen Sie das Tier aus dem Labyrinth und zurück die Maus, um die erhitzte Käfig.
   6. Wenn die Maus findet die Plattform und geht zu springen oder fallen vor 15 sec, schöpfen Sie die Maus und legen Sie es wieder auf der Plattform für den Rest des 15 s, so dass die Maus lernt, die Plattform mit Flucht zu verknüpfen.
   7. Wenn die Maus nicht die Plattform innerhalb von 60 Sekunden zu suchen, sanft Schaufel mit der Maus und legen Sie sie auf die Plattform. Lassen Sie es auf der Plattform 15 Sekunden bleiben, dann entfernen Sie das Tier mit der Schaufel und bringen sie zurück zum beheizten Käfig.
   8. Reinigen Sie das Labyrinth von Schmutz mit einem Netz zu olfaktorischen Signale zu stören.
   9. Wiederholen Sie diese Schritte für die restlichen Mäuse in der Gruppe. So kann zum Testtage 4 bis 9, führen vier Studien der versteckten Plattform Zuging pro Tag mit ca. 20 min zwischen jedem Versuch.
   10. Ändern Sie den Startort pseduorandomly für jeden Versuch. So wurden während Test 1, lassen Sie alle Mäuse aus der gleichen Ausgangsposition ein, wiederholen Sie den Vorgang von einem anderen Ausgangsposition für die folgenden Versuche. Jeder Tag, variieren die Release Punkte auf Tiere zu gewährleisten haben eine nicht-räumliche, nicht-Hippocampus-abhängigen motorischen Strategie entwickeln. Zum Beispiel, wenn die Mäuse aus N, S, E und W Punkte am ersten Tag freigesetzt, dies nicht in der gleichen Reihenfolge die folgenden Tag freisetzen.
   11. Während versteckte Plattform Trainings, verwenden Sie die Tier-Tracking-Software, um die Latenz zu messen, um die Plattform, die Pfadlänge des Tieres, und den Prozentsatz der Zeit zu erreichen oder Distanz in jedem Labyrinth Quadranten das Tier verbringt. Erhalten diese Messungen auf der Registerkarte "Wasserlabyrinth" unter "Experiment Liste" und kann direkt an eine Excel-Tabelle exportiert werden.
       Anmerkung: Die Verwendung einer Hand Timer stellt die Genauigkeit des VerfolgungsSoftware.

4. Probe Trials

1. Richten Sie die Mausleistung Tracking Software
   1. Verwenden Sie die gleichen Verfahren wie in der Morris-Wasserlabyrinth versteckte Plattform Verfahren (Schritte 3.2.1-3.2.4.3) mit einer Ausnahme. Critical Schritt: Für Sonde Studien gewährleisten die Option "Stopp" für die "Trigger" wird während Sonde Studien geworden. Dadurch wird das Programm vom Stoppen, wenn eine Maus überquert die Plattform Bereich zu verhindern.
2. Erstellen der Run Sheets
   1. Erstellen Sie eine Laufblatt Auflistung jedes Maus, jeden Versuch, und einen Raum zu beachten, abweichendes Verhalten. Pre-Bestimmung der Auslösepunkt während der Sonde Studien, dass sie zwischen den beiden Seiten gegenüber der Plattform zu wechseln. Somit voraus bestimmbar Freigabestellen derart, dass die Mäuse nicht von den beiden Seiten, die benachbart zu der Plattform freigegeben werden.
3. Verfahren
   1. Durchführen Sonde Studien ähnlich versteckte Plattform Trainings, mit dem exception, die keine Plattform ist in das Labyrinth.
   2. Lassen Sie eine Maus von einem vorbestimmten Auslösepunkt. Während der Testsonde, entfernen Sie die Plattform und die Maus hat 60 sec bis in das Labyrinth zu schwimmen.
   3. Während des Tests durchführen 4 Sonde Studien. Ändern Sie den Freigabepunkt der Mäuse zwischen den Sonden Studien. So ändern Sie den Freigabepunkt der aktuellen Sonde Studie von dem des vorherigen Sonde Studie.
   4. Während die Sonde Studien verwenden das Tier Tracking-Software, um die Weglänge des Tieres zu verfolgen, der Prozentsatz der Zeit in jedem Quadranten des Labyrinths das Tier verbringt und der Anzahl, wie oft das Tier über den zuvor platformed Bereich schwimmt. Erhalten diese Messungen aus dem "Data Analysis" Tab und dem "Water Labyrinth" unter "Experimental-Liste", und exportieren direkt an einer Excel-Tabelle.
      Anmerkung: Die Verwendung eines Handauslöser kann auch nützlich sein, um die Genauigkeit des Verfolgungs Software zu gewährleisten.
   5. Führen Sie eine Sonde Studie vorversteckte Plattform Ausbildung an den Tagen 6, 7, 8 und 10 (Figur 2). Nach diesen Sonde Studien durchzuführen, 4 Versuche versteckte Plattform trainieren jeden Tag. So führen Sie eine erste Sonde, sofort durch versteckte Plattform Ausbildung für alle Mäuse nach dem gleichen Verfahren gefolgt, wie in Kapitel 3 beschrieben, im Gegensatz dazu keine zusätzlichen versteckten Plattform Training nach der Sonde Studie am Tag 10 durchzuführen.

5. Analysen

1. Visible Platform Ausbildung
   1. Führen wiederholte Messungen ANOVAs getrennt für (a) Schichtdicke, (b) Wartezeit, um die Plattform zu finden, und (c) schwimmen Geschwindigkeit, mit Transgens (oder einer anderen Variablen, wie die Behandlung) als Zwischensubjektvariable und Tage oder Trainingsblöcken die Innersubjektvariable. Hinweis: Für komplexere Designs kann eine Beratung durch einen Statistiker nützlich sein. Siehe ^8,13 für Informationen über Gruppengrößen ausreichen, um richtig zu versorgen diese Aufgabe mit gängigen Modellen der Alzheimer7; s Krankheit.
   2. Performance Inkompetenz
      1. Identifizieren Sie leistungs inkompetent Mäusen, einschließlich Mäusen, die visuelle oder motorische Unfähigkeit zu demonstrieren, oder Tiere, erwerben nicht die Verfahrenskomponenten des Tests, und entfernen Sie diese Mäuse aus der statistischen Analyse der verborgenen Plattform und Sonde Leistung.
         1. Berechnen Sie die mittlere Wartezeit und schwimmen Geschwindigkeit für den letzten Tag der sichtbaren Plattform Training für jede Maus. Mäuse, die mit Mitteln 2 Standardabweichungen über dem Gruppendurchschnitt zu entfernen, da dies die auf motorische oder Sehbehinderungen können.
         2. Identifizieren und Mäusen andernfalls zu orientieren, zu entfernen oder folgen Sie dem Flucht Schaufel oder Mäusen zeigen abweichendes Verhalten, wie zum Beispiel Korkenzieher schwimmen oder schweben.
2. Morris Water Maze versteckte Plattform Trainings
   1. Führen wiederholte Messungen ANOVAs auf (a) Pfadlänge, (b) die Latenz versteckte Plattform zu finden, (c) schwimmen Geschwindigkeit, und (d) Prozent Zeit oder ProzentEntfernung in Quadranten mit Transgen als Zwischensubjektvariable und Prüfungen wie die intraindividuelle Variablen.
3. Sonde Trials
   1. Swim Geschwindigkeit
      1. Führen wiederholte Messungen ANOVAs auf Schwimmen Geschwindigkeit über Sonde Studien mit transgenen als Zwischensubjektvariable und Prüfungen wie die intraindividuelle Variablen.
   2. Platform Kreuzung Index
      1. - Durchschnittsdurchgänge des äquivalenten Position in den anderen 3 Quadranten PCI = Anzahl von Malen, die der Maus kreuzt die Zielstelle: Verwendung der Sondentestkonfiguration für jede Maus wird Plattformübergang (PCI) mit der folgenden Formel berechnet.
         Hinweis: Dies wird durchgeführt, um festzustellen, ob die Maus unter Verwendung eines räumlichen Suchstrategie, wie durch mehr Übergänge über den geschulten Plattform Standort oder einem nicht-räumliche Strategie thigmotaxic Schwimmen angegeben, wie etwa gleichen Übergänge über alle vier Standorte angezeigt.
      2. Verhalten wiederholtMaßnahmen ANOVAs auf PCI mit Transgen als Zwischensubjektvariable und Prüfungen wie die intraindividuelle Variablen.
   3. Prozent Zeit oder Prozent Abstand in Quadranten
      1. Berechnen Sie die prozentuale Zeit oder Strecke jede Maus in den vier Quadranten des Labyrinths verbringt. Führen wiederholte Messungen ANOVAs auf der Prozent der Zeit oder Distanz, mit Transgen als Zwischensubjektvariable und Prüfungen wie die intraindividuelle Variablen. Nutzen Sie die Zeit, Prozent, um zu bestimmen, ob eine räumliche Suchstrategie verwendet wird; Ergebnisse von ca. 25% der Zeit in der Ziel Quadranten zeigen Mäuse werden in Zufallsniveau Durchführung und nicht unter Verwendung eines räumlichen Suchstrategie.
   4. O / N zu vergessen
      1. Vergleichen Sie die Latenz der Plattformbereich Kreuzung an der Sonde Studie der Latenz, die Plattform auf die letzte Prüfung des Vortages zu lokalisieren. Hinweis: Wenn die Latenzzeit der Plattform Kreuzung an der Sonde Studie ist deutlich länger als die Latenzzeit, um die platfor findenm in der letzten Studie von versteckten Plattform am Vortag, dann O / N Vergessen der Plattform Stelle auftritt.
4. Post-Hoc-Analyse
   1. Folgen Sie signifikante RMANOVAs mit Post-hoc-Vergleiche der Transgen bei jedem Versuch.

6. Beispiel der Re-Optimierung für eine neue Testumgebung

1. Pre-Handling. Zuführen pre-Handling im Gehäuse Raum. Legen Sie die Käfige ohne Deckel auf einem Transportwagen für die gesamte Sitzung.
   Hinweis: Ziele für die Modifikation der pre-Behandlungsprozedur sind mehr schrittweise einzuführen Handler Manipulationen und Exposition gegenüber den Transporteinrichtungen (Becher und Schaufel) und erhöhen die Zeit Mäuse sind im Käfig ohne Mikroisolator Deckel und außerhalb ihres Käfigs in eine offenen Feld und heller Lichtverhältnissen.
   1. Tag 1 und 2
      1. Lassen Sie Mäusen, die Hände in den Käfig gewöhnen, durch sanfte Berührungen gefolgt, Gefolgt von Tattoo-Inspektion und Kennzeichnung von den Schwanz angehoben. Ab dem 2. Tag der Pre-Behandlung, setzen zusätzliche Nistmaterial in den Käfig, um zusätzliches Material zum Nestbau und Schutz bieten, während Deckel entfernt worden ^9.
   2. Tage 3 und 4
      1. Setzen Sie die Transportbecher, Schaufel, und die Flagge des sichtbaren Plattform in der Pre-Handling-Box und lassen Mäuse für 2-Studien bei 2 min pro Versuch zu erkunden.
      2. Verwenden Sie kein Wasser in diesem Protokoll während der Pre-Handling. Vielmehr sorgen die Box enthält genügend saubere Bettwäsche, den Boden bedecken und wird mit einer kleinen Menge von weiblichen und männlichen verschmutzte Streu duftend, wenn beide Geschlechter werden derzeit getestet. Jeden Tag die Bettwäsche wechseln.
   3. Tag 5
      1. Platz Mäusen in der Pre-Handling-Box mit leicht verschmutzte Streu und die sichtbare Plattform Flagge für 3-Studien, für jeden 20 sec. Verwenden Sie den Becher und die Schaufel, um die Mäuse zu und von der Box zu transportieren.
2. Visible Platform Ausbildung
   1. Eingestellten Wassertemperatur bei 27 ° C (routinemäßig für die Minnesota Testumgebung verwendet wird).
   2. Bringen Sie die Maus auf den Heimkäfig auf den Erwerb der cued Plattform.
   3. Lassen Sie Mäusen bis zu 60 sec, um die sichtbare Plattform erwerben.
   4. Schulungen durchzuführen, die aus 3 Versuchen pro Tag für 5 Tage.
3. Versteckte Plattform Trainings
   1. Ändern Sie visuelle Hinweise. Bis auf einen großen Vorhang, um den Handler zu verschleiern, entweder zu beseitigen oder schmaler machen andere Vorhänge rund um den Pool, um eine offenere Zimmer. Platzieren Sie zusätzliche Objekte durch den Raum (zB ausgesetzt Regale, schwarzen Stoff-Plakat mit einem weißen Symbol, ein Schwarz-Weiß-Beach-Ball, große schwarze Trichter, Notebooks und einer schwarzen Stofftier), was zu einer ausgewogenen, aber abwechslungsreicher visueller Cue gesetzt als bisher verwendet.
   2. Beginnen Sie versteckte Plattform Trainings 72 Stunden nach Abschluss der sichtbaren Plattform training, mit einem Intervall von etwa 30 min zwischen den Durchgängen.
   3. Schulungen durchzuführen, die aus 2-Studien für 8 Tage.
4. Sonde Trials
   1. Führen Sonde Studien 72 Stunden nach versteckten Ausbildung Studien 8, 12, und 16.Include ein 3-Tages-Intervall zwischen den Versuchen 8-9 und 12-13 der Ausbildung.
   2. Stellen Sie die Sonde Dauer 30 Sek.

Ergebnisse

Wir haben den Morris-Wasserlabyrinth verwendet, um die Wirkungen von Beta-Amyloid (Tg2576 Mäuse) und mutierten P301L tau (RTG (TauP301L) 4510-Mäuse) auf Raumbezugs Speicher (zB ^1,5,7,8). Figur 3 ist zu studieren der Vertreter Ergebnis in unserer Studie berichteten Untersuchung der Wirkung von Altersdiabetes P301L-tau Ausdruck auf Lernen und Gedächtnis ^8. Verwendung Testumgebung A. Um Motor und visuellen Fähigkeiten zu beurteilen, wurden die Mäuse über sichtbare Platt...

Diskussion

MWM Aufgabe wird häufig verwendet, um das Lernen und Gedächtnis zu beurteilen. Jedoch kann die Robustheit dieser Aufgabe durch viele Faktoren beeinflusst werden und benötigt die Optimierung sowohl Hintergrundstamm und Testumgebung. Wie in Abbildung 4, die gleiche Trainingsprotokoll gezeigt und angewandte visuelle Hinweise in zwei verschiedenen Testräume (äquivalente Größe und Layout) verwendet ergab signifikant unterschiedliche Sonde Leistung. Da viele Funktionen des Testraum könnte zu räumlich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Viewer Tracking software	Biobserve		This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available
Pre-handling pool			Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep
Plastic beaker			1 L
Scoop
Small net
Stopwatch
Non-toxic white tempera paint			Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal.
Visible platform			Color should contrast that of maze
Curtain rod
Curtains
Circular tub			Usually white in color; approximately 4 feet in diameter
Hidden platform			Painted same color as the water