miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

Zusammenfassung

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Zusammenfassung

Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs (PCa) klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Therapie gestellt. In den letzten Jahren microRNAs (miRNAs) als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs Diagnose und Prognose entstanden. Jedoch ist die Entwicklung von miRNAs so wirksam Biomarker für Prostatakrebs in hohem Maße von ihrer genauen Nachweis klinisch Geweben. miRNA-Analysen bei Prostatakrebs klinischen Proben ist häufig eine Herausforderung aufgrund Tumorheterogenität, Stichprobenfehler, Stroma-Kontaminationen etc. Das Ziel dieses Artikels ist es, einen vereinfachten Workflow beschreiben, für die miRNA-Analysen in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Proben mit einer Kombination aus quantitative Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH). In diesem Workflow optimieren wir die bestehenden Methoden für die miRNA-Extraktion aus FFPE und eingefroren Prostata tissuES und Expressionsanalysen durch Taqman-Sonde basiert miRNA RT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur ISH Analysen formiRNA Erkennung in Prostatagewebe mit gesperrten Nukleinsäure (LNA) - basierten Sonden. Unsere optimierte miRNA ISH-Protokoll kann zur Prostatakrebsgewebe Dias oder Prostatakrebs Tissue Microarrays (TMA) angewendet werden.

Einleitung

Krebs der Prostata ist eine häufig diagnostiziert männlicher Bösartigkeit, die eine der führenden Ursachen von Krebs bedingte Sterblichkeit unter den Menschen ist. In US schätzungsweise 220.800 neue Fälle und 27.540 Todesfälle im Jahr 2015 ¹ gemeldet werden.

Prostatakrebs ist eine heterogene Erkrankung mit sehr variablen Krankheits Kurs- Tumoren können indolenten oder sehr aggressiv sein. Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Methoden / Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Behandlung ² gestellt. Stromscreeningverfahren schließen Prostata-spezifischen Antigens (PSA) und eine digitale rektale Untersuchung (DRU), gefolgt von Prostatabiopsien ^3. Prostata-spezifisches Antigen (PSA) ist die am weitesten verbreitete Prostatakrebs-Biomarker, die deutlich revolutioniert hat das Klinikmanagement und verbesserte Überlebensraten ^4. Jedoch aufgrund der inhärenten Beschränkungen der PSA einschließlich lack Spezifitäts PSA basierten Screening auf über Diagnose und über die Behandlung der Krankheit geführt. Im Hinblick darauf werden die intensiven Bemühungen in Richtung auf eine Suche nach alternativen Prostatakrebs biomarkers gerichtet, insbesondere solche, die die Aggressivität der Erkrankung vorherzusagen und fahren bessere Behandlungsentscheidungen ^4,5 kann. In den letzten Jahren wurden microRNAs (miRNAs) als vielversprechende alternative Prostatakrebs biomarkers entstanden.

MicroRNAs (miRNAs) stellen eine evolutionär konservierte Klasse von kleinen nicht-kodierenden RNAs, die die Genexpression über sequenzspezifische Wechselwirkungen mit den 3'-untranslatierten Regionen (UTR) des verwandten mRNA-Ziele zu unterdrücken posttranskriptional. Es wird geschätzt, dass> 60% der mRNAs konserviert Ziele miRNAs ^6. miRNA-Gene sind in Intergenregionen oder innerhalb Introns oder Exons von Protein / Nicht-Protein kodierende Gene ^{7 angeordnet.} Diese Gene werden vorzugsweise durch RNA-Polymerase II in prima transkribiertry miRNAs (pri-miRNAs mehrere Kilobasen lang), dass die Form Haarnadel-förmigen Stammschleife Sekundärstrukturen. Diese pri-miRNAs werden in Vorläufer-miRNAs (pre-miRNAs, 60-75 Nukleotide lange), die in das Zytoplasma exportiert und weiter zu reifen miRNAs (18-25 Nukleotide lange) ^8-10 verarbeitet verarbeitet. miRNAs regulieren Schlüssel zelluläre Prozesse einschließlich Verbreitung, Entwicklung, Differenzierung und Apoptose ^11. Studien legen nahe, eine weit verbreitete Fehlregulation der miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen menschlichen Tumoren einschließlich Prostatakrebs ^12-15. miRNA-Expressionsprofile wurde berichtet, weit verbreitet in der primären und metastatischen Prostatakrebs fehlreguliert werden. Veränderte miRNA-Expression wurden mit Prostatakrebs Progression, Aggressivität und Rezidivhervorhebung der prognostische Potential von miRNAs ^12,14,16-19 Verbindung gebracht worden. Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass miRNAs spielen wichtige mechanistische Rolle bei Prostatakrebs Initiierung, Entwicklung, FortschrittIonen und Metastasierung. Insgesamt miRNAs entstehen als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs Diagnose und Prognose, die zwischen normalen und Krebsgeweben und Hilfe bei der Stratifizierung von Prostata-Tumoren ¹² unterscheiden kann. Auch miRNAs sind wichtige Ziele für die Entwicklung wirksamer Therapeutika gegen Prostatakrebs ^20.

Aufgrund ihrer geringen Größe und der Beständigkeit gegenüber endogenen RNase-Aktivität sind miRNAs stabile Biomarkern, die in Formalin fixierten Geweben ^{21 und} in Prostatabiopsien ²² leicht erkannt werden können. Darüber hinaus haben die Expressionsprofile von miRNAs in gefrorenen und Formalin fixierten Geweben verglichen worden und haben sich als stark korreliert sein ^21. Allerdings ist miRNA Expression Profiling bei Prostatakrebs klinischen Geweben oft eine Herausforderung aufgrund Tumorheterogenität, Stichprobenfehler, Stroma-Kontaminationen etc. Die Entwicklung von miRNAs als effektive Biomarker für Prostatakrebs stark relies auf ihre genaue Erfassung der klinischen Gewebe. Hier beschreiben wir einen vereinfachten Workflow in unserem Labor für die miRNA-Expression Profiling in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Proben verwendet. Wir verwenden eine Kombination quantitativer Echtzeit-PCR und in situ Hybridisierung für miRNA-Analysen von klinischen Proben mit dem früheren Gewinnung quantitativer Informationen und letztere zur Visualisierung der differentiellen Expression potentieller miRNA Biomarkern in einem Array von Geweben. In diesem Workflow optimieren wir die bestehenden Methoden für die miRNA-Extraktion aus FFPE und gefrorenen Prostatagewebe, Analysen Expression durch Taqman-Sonde basiert miRNA RT-PCR und miRNA in situ-Hybridisierungstechnik unter Verwendung gesperrt Nukleinsäure (LNA) -basierte Sonden ^23. LNA-basierte Sonden bieten eine erhöhte Sensitivität und Spezifität gegenüber DNA- oder RNA-Sonden basiert und ermöglicht robuste Erkennung aller miRNA-Sequenzen, unabhängig von ihrem GC-Gehalt und erlauben auch Diskriminierungtion der miRNA-Familien. Unsere optimierte miRNA ISH-Protokoll kann zur Prostatakrebsgewebe Dias oder Prostatakrebs Tissue Microarrays (TMA) und bietet das Potenzial, miRNA Biomarkern beschleunigen angewendet werden, wobei die letzteren.

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Protokoll

Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs Proben wurden aus dem SFVAMC erhalten. Proben wurden von Prostatakrebs-Patienten, die radikale Prostatektomie bei SFVAMC unterzog. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten, und die Studie wurde von der UCSF Ausschuss für Menschenforschung genehmigt. Alternativ wurden Prostatakrebs Gewebe-Mikroarrays aus kommerziellen Quellen beschafft und verwendet für die miRNA-Analysen von ISH. Klinisch-pathologischen und Follow-up-Informationen für analysiert Prostatakrebs-Patienten gesammelt.

1. Gewebeproben

1. Geschnitten Prostatakrebs Gewebeproben in 10 um-Schnitte mit einem Mikrotom und Fleck mit H & E folgende Protokoll des Herstellers.
2. Überprüfen gefärbten Objektträger für die Identifizierung von Prostatakrebs Herde sowie angrenzenden normalen Drüsenepithel.
   Hinweis: ein Board Certified Pathologen sollte die H & E-gefärbten Schnitten und ma überprüfenrk für die Tumor-und normalen Bereichen. Verwenden Sie die markierten Folien als Führer in den folgenden Abschnitten für die miRNA-Analysen von Tumor vs normalen Bereichen.

2. miRNA Expressionsanalysen durch quantitative Echtzeit-PCR

Hinweis: Dieser Workflow beinhaltet die folgenden Schritte: Laser Mikrodissektion, Isolierung von Gesamt-RNA (einschließlich miRNA und mRNA), Testen von reifen miRNAs mit den TaqMan MicroRNA Expression Assays, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.

1. RNA-Extraktion
   1. Isolierung von miRNA aus Prostatakrebs FFPE Gewebe
      1. Laser Mikrodissektion (LCM)
         Hinweis: Führen Sie die Schritte 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in einem Chemieabzug benutzen.
         1. Bereiten Gewebeschnitten (10 & mgr; m Sektionen) für LCM. Deparrafinize Gewebeschnitten durch Einweichen in Xylol (2x), für jeweils 10 min, dann rehydrieren das Gewebe durch Inkubation der Objektträger für 5 Minuten jeweils in abgestuften Ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), gefolgt von destilliertem Wasser(5 min).
         2. Nach der Rehydrierung, Flecken Schnitte mit Hämatoxylin für 30 Sekunden, gefolgt von Wasser.
         3. Ort Geweben in abgestuften Ethanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (jeweils 5 min) und Xylol (5 min).
         4. Trockenrutschen in einem Abzug und legen Sie dann in der LCM Instrument zur Mikrodissektion.
         5. Führen Mikrodissektionen mit dem LCM-System in Übereinstimmung mit den Anweisungen ^{von 24} des Herstellers. Verwendung Pathologen bis gleitet als Führungen für die Identifizierung von Prostatakrebs Brennpunkte sowie angrenzende normale Gewebe markiert. Verwenden des Laserstrahls auf einen um Durchmesser 10-20 Pulsen mit einer Leistung von 70-90 mW.
         6. Capture-Bereiche von Interesse mit Infrarot-Laserimpulse auf LCM Kappen. Kombinieren Zellen 2-5 Kappen für miRNA-Extraktion pro Probe. Um die Integrität der extrahierten RNA zu gewährleisten, umgehend bearbeiten fangenen Zellen für die miRNA-Extraktion.
         7. Alternativ lysieren Zellen in der miRNA-Extraktionspuffer (gemäß dem Herstellerprotokoll) und STOWieder Lysate bei -80 ºC.
      2. miRNA Extraktion und Analyse von LCM mikrodissezierten Tissues
         1. Extrahieren Gesamt-RNA aus microdissected FFPE-Geweben unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers.
            Hinweis: Die Ausbeute an RNA von Laser-Capture-miscrodissection typischerweise niedrig ist. Daher wird RNA in geringen Mengen (20-30 ul) eluiert und für die Expression Profiling mit Taqman microRNA Expressionsassays folgenden Herstellerangaben (auch in Abschnitt 2.2 beschrieben) verwendet. Optimierung der Eingangs RNA für Echtzeit-PCR-Nachweis von reifen miRNAs schlägt vor, dass 5 ul der eluierten RNA ist optimal für jedes miRNA-spezifische reverse Transkriptionsreaktion. Als endogene Kontrolle wird RNU48 / RNU24 verwendet. Für Kontrollreaktionen, wurde mit 2 ul der eluierten RNA für die reverse Transkriptionsreaktion verwendet wird.
   2. Isolierung von miRNA aus Prostatakrebs Gefrorene Gewebe
      1. Homogenisieren froren resezierten Prostatagewebe durch Schleifen die Gewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel. Übertragen homogenisiertem Gewebe ein Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer gekühlten Spachtel. Pflegen Sie den Mörtel / Stößel und Spachtel auf der gleichen Temperatur durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff so homogenisierte Gewebe können leicht übertragen werden.
      2. Hinzufügen kommerziellen Guanidinisothiocyanat-Phenol-Reagenz (1 ml / 0,1 g Gewebe) zu der homogenisierten Gewebe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
         Hinweis: homogenisierte Gewebe in das Handels Guanidinisothiocyanat-Phenol-Reagenz kann bei -80 ° C mehrere Monate gelagert werden.
      3. In Chloroform zum Homogenat (0,2 ml Chloroform / ml) und kräftig schütteln für 30 Sekunden. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 3-5 min, gefolgt von Zentrifugation bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ºC.
      4. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches steriles RNase-freies 1,5 ml-Tube.
      5. Hinzufügen eines gleichen Volumens Isopropylalkohol. Mischen und Inkubation für 10 min bei RT, gefolgt von Zentrifugation bei 12.000 xg für 20 min bei 4 ºC, um die RNA zu pelletieren.
      6. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die RNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol. Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min bei 4 ºC.
      7. Vorsichtig den Überstand aspirieren. Dry RNA-Pellets bei RT für 5-10 min. Lösen sich RNA in 50-100 ul Nuklease-freies Wasser.
      8. Führen Quantifizierung von RNA unter Verwendung eines Nanodrop Spektralphotometer und festzustellen, RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer. Einstellen RNA-Konzentrationen bis 10 ng / & mgr; l. Verwenden Sie 10-50 ng RNA für die miRNA-spezifischen cDNA-Reaktion, gefolgt von Echtzeit-PCR-Analysen (Abschnitt 2.2).
2. Quantitative Real-time PCR zur miRNA-Expressionsanalysen
   Hinweis: Assay für reife miRNA Verwendung wie unten beschrieben ein zweistufiges RT-PCR-Protokoll.
   1. Reverse Transkription (RT)
      1. Reverse Transkription von cDNA aus RNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-miRNA-Kit gemäß den Anleitungen des Herstellers.Verwenden Sie 10-50 ng Gesamt-RNA mit miRNA spezifische Primer aus der MicroRNA Assays und RT-Kit. Verwenden RNU48 / RNU24 / RNU6B als Kontrollen. Verdünnte cDNA 1: 5 bis 1:10 (in Abhängigkeit von der Fülle der analysierten miRNA) und die Verwendung in Echtzeit-PCR-Nachweis, wie im folgenden Schritt beschrieben.
   2. Real-time PCR zum Nachweis von miRNA Ältere
      1. Verstärken PCR-Produkten aus cDNA-Proben unter Verwendung der MicroRNA Assays mit einer Fast-Universal-Master-Mix in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. Normalisieren Proben RNU48 / RNU24 / RNU6B Kontrolle. Verwenden Sie die Vergleichs Ct (threshold cycle) -Methode, um die relativen Veränderungen in der Genexpression auf der Fast-Echtzeit PCR-System zu berechnen. Analysieren Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung.

3. miRNA Expressionsanalysen durch in situ Hybridisierung (ISH)

1. Vorbehandlung von Geweben
   1. Schneiden Sie 5 um Abschnitte aus FFPE Prostatakrebsgewebeblöcke mit einem Mikrotom.
   2. Fix Gewebeschnitten durch Inkubation der Objektträger bei 56 ° C für 1 Stunde.
      Hinweis: Die Objektträger können bei RT für mehrere Wochen gelagert werden für miRNA-Analysen.
   3. Deparrafinize der Gewebe durch Einweichen der Folien mit Xylol (2 x), für jeweils 15 min.
   4. Rehydrieren das Gewebe durch Inkubation der Objektträger für 5 Minuten jeweils in abgestuften Ethanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), gefolgt von destilliertem Wasser (5 min).
   5. Befestigen Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 20 min.
   6. Waschen der Objektträger mit PBS (2x) bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten.
   7. Behandeln die Folien mit 10 & mgr; g / ml Proteinase K bei 37 ºC für 10 min in vorgewärmtem Proteinase K-Puffer (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl).
   8. Im Anschluss an Proteinase-K-Behandlung, spülen Sie die Folien mit 0,2% Glycin in PBS für 30 Sekunden.
   9. Waschen Folien in PBS (1x) bei Raumtemperatur für 5 min.
   10. Befestigen Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min.
   11. Rinse Dias mitPBS für 5 min.
2. Hybridisierung
   1. Vorge hybridisieren die Folien mit Vorhybridisierungslösung für 3-4 h bei 55 ºC in einer befeuchteten Kammer. Benutzen Sie Gewebelaborwischtücher in 50% Formamid / 50% 5x SSC eingeweicht zu halten, der Kammer befeuchtet.
   2. Benutzen 5'Digoxigenin markierten Sonden in einer Konzentration von 20-50 nM in Hybridisierungspuffer. Verdünnen Sie miRNA-spezifischen Sonde (20-50 nM) und Snrna U6 Kontrollsonde (20 nM), Wärme bei 90 ° C für 4 Minuten, legen Sie es auf Eis und in den kalten Hybridisierungspuffer Eis (2-4 ng / ul ).
   3. Entfernen Vorhybridisierungslösung, fügen Hybridisierungslösung (Sonde + Hybridisierungspuffer, 100 ul pro Folie), Inkubation für 12-16 Stunden bei sondenspezifischen Hybridisierungstemperatur (Hybridisierungstemperatur = Tm-Sonde-21 ºC). Zuführen Hybridisierungen in einer feuchten Kammer (50% Formamid / 50% 5x SSC).
3. Waschschritte
   1. Waschen Sie die Objektträger mit 2 × SSC für 10 Minuten bei 45 ºC.
   2. Wash tEr gleitet mit 1,5x SSC für 10 Minuten bei 45 ºC.
   3. Waschen Sie die Objektträger mit 0,2 × SSC (2x) bei 37 ºC für jede 20 min.
   4. Objektträger mit 1x Blockierungslösung inkubieren 1-2 Stunden bei Raumtemperatur
4. Erkennung
   1. Die Objektträger mit 1 inkubieren: 100 PBS verdünntes AP-konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörper für 1-4 Stunden oder über Nacht bei 4 ºC.
   2. Waschen Sie die Objektträger mit PBS (3x) bei Raumtemperatur für jeweils 10 min.
   3. Für jeweils 5 min Waschen der Objektträger (2x) mit alkalischer Phosphatase-Puffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl _{2, 100} mM NaCl, 0,1% Tween-20) bei RT.
   4. Die Folien in BM Lila AP-Substrat Inkubieren im Dunkeln bei RT 1-20 Std.
   5. Mit PBS, das 0,1% Tween-20 und Wasch (2x) in Wasser zu spülen Sie die Folien.
   6. Montieren Sie die Objektträger unter Verwendung einer wässrigen Eindeckmittel und untersuchen unter dem Mikroskop.

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Ergebnisse

Expression Profiling von miR-203 in LCM primären Prostatakrebs klinischen Proben durch RT-PCR-Analysen (Abbildung 1)

RT-PCR-Analysen von relativen miR-203-Expression in LCM primären Prostatakrebsgewebe und die angepaßten angrenzenden normalen Regionen erfolgt wie in Saini et al. ¹⁵ RNU48 beschrieben wurde als eine Kontrolle verwendet wurde. Die folgende Tabelle fasst die relative miR-203 Expression in Prostatakrebstumorgewebe relativ zu benachbarten no...

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Diskussion

In diesem Artikel beschreiben wir einen vereinfachten Workflow für die miRNA-Expression Profiling in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Gewebe. Bei Prostatakrebs, schlagen mehrere Studien eine wichtige Rolle von microRNAs im Prostatakrebs Initiation, Progression und Metastasierung. Allerdings sind widersprüchliche Ergebnisse oft auf einen bestimmten miRNA ²² seit der miRNA-Extraktion erhalten und analysiert Methoden weit auseinander. Im Hinblick auf die Schwellen Nachweise fü...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Leica Biosystems	RM2255
Arcturus Autopix for LCM	Arcturus/ Life Technologies	LCM1621/LCM1110	Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
miRNeasy FFPE Kit	Qiagen	217504
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems/ Life Technologies	4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems/ Life Technologies	4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix	Applied Biosystems/ Life Technologies	4352042
DIG labeled LNA probe for U6	Exiqon	99002-01
BM Purple AP substrate	Roche	11442074001
Pre-hybridization solution	Biochain	K2191050-1
Hybridization solution	Biochain	K2191050-2
Blocking solution	Biochain	K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody	Biochain	K2191050-7
Aqueous mounting media	Vector Laboratories	H-5501
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)	Life Technologies	15596-018
Harris hematoxylin	Statlab	SL200
Eosin	Statlab	SL201