Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Zusammenfassung

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Zusammenfassung

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Einleitung

Die Ermittler haben eine breite Palette von Tiermodellen verwendet werden, um die normale Funktion des Gehörs sowie die Pathophysiologie von Hörverlust zu studieren. Diese Modelle sind auch sehr nützlich für die Durchführung von Interventionsstudien gegen verschiedene pathologische Prozesse und dienen als Grundlage für die translationale Anwendungen am Menschen. Für die meisten Untersuchungen, die die Schnecke und die zugehörige Hörbahnen muß ein gewisser Grad an Beschädigung oder Störung in das System eingeführt werden. Oft ist der Vorsatz gerichtet, um eine bestimmte Läsion zu erzeugen, so dass Forscher, um die Wirkung dieser Verletzung auf die normale Funktion als auch die Cochlea Fähigkeit davon zu erholen studieren. Bei der Auswahl eines bestimmten Tiermodell und / oder Technik (en) für die Einführung von Schäden muss eine Reihe von Faktoren in Betracht gezogen, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen. Verschiedenen Tiermodellen kann unterschiedlich auf Eingriffe reagieren, während die direkten und indirekten Auswirkungen einer Technik kannvöllig nachteilig für den gewünschten Erfolg. In den meisten Fällen wäre die ideale Innenohrschädigung Protokoll systemische Toxizität zu vermeiden, schnell und Schäden zuverlässig zu erzeugen, erstellen Sie eine präzise und konsistente Läsionen und überlebensfähig zu sein, um die weitere Untersuchung von funktionalen, zellulären und molekularen Veränderungen zu ermöglichen. Idealerweise würden diese Verfahren auch die empfindlichen Mikroarchitektur und elektrochemische Gradienten der Cochlea zu bewahren, um so weit wie möglich.

Bisher haben Forscher bei der Schaffung einer Reihe von Techniken, um Innenohrschäden induzieren konnten. Die meisten von ihnen bringen Aussetzen der Cochlea zu einem ototoxischen Mittel entweder systemisch oder über chirurgische Vorgehen. Techniken umfassen die parenterale Injektion, intraperitoneale Injektion, trans-Pauken Injektion, Saccus endolymphaticus Injektion und Cochleostomie mit perilymphatische Perfusion. Diese Techniken sind verwendet worden, um eine Vielzahl von ototoxic Mittel, wie Furosemid, Gentamicin, Ouabain und Heptanol einzuführen. ^1-5Während seiner Zeit bei erfolgreicher Erstellung spezifischer Cochlea-Läsionen, die obigen Techniken haben auch Einschränkungen anerkannt. Systemische Injektionen können sehr giftig für das Tier sein und kann mit Cochlea unbeabsichtigten Beleidigungen und inkonsistenten Ergebnissen verbunden werden. Letzteres Manko hat auch mit transPauken Injektionen in Verbindung gebracht. Techniken wie Cochleostomie und perilymphatische Perfusion, während induzieren eine schnelle und sehr zuverlässige Läsionen sind direkt invasive Innenohrstruktur und Funktion. Viele der chirurgische Ansätze sind auch mit einem hohen Maß an technischer Schwierigkeiten verbunden und kann verlangen, so dass Fremdkörper in das Tier, wie eine Mikropumpe Brüheinheit. ^2-4,6-8 Keine einzelne Methode ist frei von Mängeln, und Ermittler müssen sich entscheiden, Methoden sorgfältig auf ihre experimentellen Bedürfnisse anzupassen. Hier beschreiben wir im Detail die runde Fensternische (RWN) Applikationstechnik für die topische Verabreichung von ototoxischen Mittel in erwachsenen Mäusen.

Fizuerst von Husmann et al 1998 beschrieben, während des Studiums Gentamicin Wirkung auf Haarsinneszelldegeneration in einem Vogelmodell, wurde diese Technik festgestellt, dass in der Lage, wesentlich zuverlässiger Läsionen als systemische Gentamicin Anwendung sein, bei gleichzeitiger Vermeidung assoziierten Toxizitäten. ⁹ Seitdem ein Anzahl von anderen Forschern, einschließlich unserem Labor haben diese Technik, um große Erfolge genutzt. Im Jahr 2004 Heydt et al. angepasst ist, um einem Mausmodell beschrieben und eine erhöhte Fähigkeit zur Läsionsgröße durch Füllen des RWN mit absorbierbarer Gelatineschwamm in verschiedenen Konzentrationen von Gentamycin getränkten steuern. ¹⁰ PALMGREN et al., 2010, untersuchten die ototoxic Wirkung von Beta-Bungarotoxin, einem potenten Element im Gift der taiwanesischen gebändert Kiste, indem eine wässrige Form an die RWN von erwachsenen Ratten. ¹¹ Darüber hinaus wurden eine Reihe von früheren Studien aus unserem Labor das runde Fenster Ansatz, um die ototoxische Wirkung von Furosemid studieren genutzte, Ouabain und Heptanol. ^5,6,12-15 Die Ergebnisse dieser Studien haben die Wichtigkeit der Cochlea Fluid und Ionenhomöostase auf normalem Gehör gezeigt entdeckten Zellproliferationsfähigkeit im Ganglion spirale und Cochlea-Seitenwand, gefördert und unser Verständnis altersbedingten Hörverlust.

Der folgende Ansatz beinhaltet operativ Zugriff auf das Mittelohr über eine postaurikulären Inzision und Teil unroofing des knöchernen Bulla tympanica. Dies ermöglicht eine gute Belichtung des RWN und Membran an dem eine ausgewählte ototoxic Mittel kann direkt angewendet werden. Das flüssige Mittel dann Pools in der topfartigen Vertiefung des RWN (oder langsam entweicht aus einer gesättigten resorbierbaren Gelatineschwamm Trägers in die RWN verpackt) und diffundiert durch die runde Fenstermembran in die Perilymphraum des Cochlea-Vorhalle. Keine direkte Cochleostomie wird in diesem Ansatz hergestellt. Vorteile dieses Verfahrens sind: Erhalt der Innenohr-Mikroarchitektur, die Vermeidungeiner systemischen Toxizität, Geld eines innerTierSteuer Ohr, schnelle Wirkungseintritt, selektive Degeneration in bestimmten Cochlea-Zelltypen (z. B. Typ-I-Spiralganglienneuronen mit Ouabain Belichtung und Cochlea-Typ-II-Fibrozyten durch die Behandlung von Heptanol induziert), und reproduzierbare / zuverlässige Ergebnisse. Diese Technik kann mit wenigen Veränderungen zwischen anderen Nagetierarten, darunter Ratten, Meerschweinchen, Wüstenrennmäuse und angewendet werden. Nachteile sind eine steile Lernkurve und technischen die relative Begrenzung der ototoxischen Beleidigung, die zu einem bestimmten Zeitpunkt beschränkt ist.

Protokoll

Alle Aspekte der Forschung an Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der entsprechenden Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt. Alle hier beschriebenen Wirbeltierversuchsverfahren wurden unter den Richtlinien der Medizinischen Universität von South Carolina (MUSC) Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen.

1. Modellauswahl

1. Pflegen Sie das Tiermodell in einem rauscharmen Vivarium mit Routine-Hauswartung per institutionellen Protokolle bis zur Verwendung. In Tierforschungseinrichtungen (ARFs), pflegen Vibrationsfestigkeit, Geräuschdämpfung, tägliche Beleuchtung, prep Raum, Oberflächen, Abdichtung und Abdichten, und Lüftung, die NIH-Standards zu erfüllen.
   Hinweis: National Institutes of Health (NIH) Leitlinien für ARFs und Wartung eines rauscharmen Vivarium kann überprüft werden: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
2. Für alle Versuche, verwenden Sie das rechte Ohr wie die experimentelle Ohr. Das linke Ohr dient als intra-Tier-Steuerung und nicht chirurgisch verändert.
3. Überprüfen Sie die Modelltier vor der Operation auf Anzeichen von mittleren oder äußeren Ohr-Infektion. Potential Zeichen können Flüssigkeitsabsonderung oder Eiter aus dem Ohr, entzündete Gewebe Ohrmuschel und / oder Trägheit des Tieres enthalten. Das ist ungewöhnlich, aber wenn darauf hingewiesen, zu vermeiden, eine weitere Operation und Behandlung der tierischen angemessen.

2. Präoperative Prozeduren

1. Betäuben das Tier 30 Minuten vor dem chirurgischen Eingriff und alle perioperative Verfahren via intraperitoneale (IP) Injektion von Ketamin (100 mg / kg IP) und Xylazin (20 mg / kg IP). Ergänzen Anästhesie erforderlich, wie durch eine positive Vorspur pinch Reflex beurteilt, mit einer niedrigeren Dosis von Ketamin (25 mg / kg IP) und Xylazin (5 mg / kg IP). Bestimmen Sie die Dosierung in Übereinstimmung mit den institutionell zulässige Protokolle für Mäuse mit dem Alter entsprechende Anpassungen der Dosis.
2. Überprüfen Sie für weitere sedation des Modells. Überprüfen Sie für eine Bühne 3 Ebene der Anästhesie für die Gesamtheit der durch eine regelmäßige Atmung, fehlende Gewichtsreflexes (bei Mäusen), und der Mangel an Pedal und der Augenlid (toe-Pinch) Reflexe markiert beschriebenen Protokoll. Pflegen Sie das Tier auf dieser Ebene der Anästhesie. Dies ist von größter Bedeutung für die Minimierung von Schmerzen und intraoperative Bewegung, Blutungen und Auslaufen von interstitiellen Flüssigkeiten während der Operation.
3. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tieres bei 37,5 ° C mit einer geschlossenen Schleife Heizkissen.
4. Verwalten Analgesie subkutane Injektion von Buprenorphin. Geben Buprenorphin (0,1 mg / kg SQ einmal 30 Minuten vor der Operation), wie Analgesie, jede chirurgische Beschwerden zu minimieren. Basis Dosierung und Alternativen geeignet, um das ausgewählte Modell auf institutionell genehmigten Protokolle. Antibiotika nicht notwendig ist, wenn gute aseptischen Bedingungen durchgeführt worden ist. Die Tiere erhalten die postoperative Analgesie, wenn Anzeichen von Schmerzen und Leiden.
5. Führen physiologic Tests präoperativ. Darstellende akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) Prüfung und / oder Verzerrungsprodukt optoakustischen Abgasuntersuchung (DPOAE) sowohl präoperativ und kurz vor der Tieropfer dient als objektives Maß für die Wirkung des gewählten ototoxischen Agent auf der Maus die Anhörung.

3. Chirurgische Vorbereitung und Positionierung

1. Sterilisieren Sie alle Instrumente präoperativ pro institutionellen Standards. Bereiten chirurgischen Instrumenten und Feld in einem konsistenten, steril, und organisierten Art und Weise, um nicht benötigte Anstrengung und Bewegung während des Verfahrens zu verhindern. Typische Instrumente erforderlich, beinhaltet scharfe Präparierschere, mehrere Paare von metallischen Pinzette mit Juwelier-Tipps, ein otologischer Pick ein otologischer Löffel und eine bipolare Elektrokauter Einheit (Abbildung 1).
2. Vorzubereiten und zu sterilisieren Papier Dochte aus labwipes im Voraus gemacht, indem ein kleines dreieckiges Stück des wischen (~ 0.7 in x 1,25 in x 1.75) und Verdrehen sie fest zwischen Daumen und Zeigefinger einer Hand (~ 1,25). Schaffung eines eng verdrillte, extrem dünne Docht ist von größter Bedeutung für den Erfolg des Verfahrens. Bereiten Sie insgesamt 15-20 Dochte vor der Operation (Abbildung 2).
3. Verwenden Sie einen Dentalbohrer, um schnell zu perforieren den Knochen der Bulla tympanica kontrolliert. Verwendung eines riemengetriebenen zahnärztlichen Handbohrmaschine mit 1 oder 2 mm verjüngte Spitze bevorzugt. Der Einsatz des Mikroskops ist notwendig, um das Protokoll zu beenden. (siehe Schritt 4.7)
4. Vorverlosung 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die das ausgewählte ototoxic Mittels in einer 1 ml Tuberkulin-Spritze mit einer 28 G, 1/2 'Nadel. Typischerweise 1 Tropfen (~ 10 & mgr; l) des Mittels ausreicht, um die Maus RWN vollständig ausfüllen. Ein metallisches, erleichtert die stumpfe Spitze Spritzennadel die Abgabe des Mittels und verhindert Schäden an darunter liegenden Strukturen durch eine scharfe Kegelspitze. Zu vertreiben keine Luft in der Spritze als Blasen versehentlich füllen das RWN und / oder die adäquateAnwendung des Mittels an das runde Fenster selbst.
5. Entfernen Fell von der Post-Ohrenhaut mit elektrischen Grooming Clippers. Entfernen Fell in einer Zone, die sich von der auriculo-Kopffalte rostral mit dem Schultergürtel kaudal. Verlängern Sie die Haarentfernung von der dorsalen, sagittalen Mittellinie an den Kieferwinkel seitlich. Sicheres Entfernen Fell ist von größter Bedeutung für die Erhaltung einer sauberen und klaren Operationsfeld. Bürsten Sie Ausschnitte aus der vorgesehenen Operationsstelle.
6. Sterilisieren Sie die Haut von vorbereiteten Fläche pro institutionellen Protokolle. Gelten Betadin (Povidon / Iod) mit Ethanol topisch kreisförmig 2 min gewechselt. Andere Mittel können pro institutionellen Richtlinien ersetzt werden.
7. Legen Sie das Tier auf eine ebene Fläche, um konstante Körperhaltung während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. Mit einem kleinen Heizkissen unter dem Körper platziert auf die Plattform, um die Körpertemperatur während des Verfahrens zu steuern, um die Körpertemperatur des Tieres auf 36-38 ° C zu halten. Ove nichtrheat das Tier da dies zu leichten bis schweren Hautschäden und / oder frühen Euthanasie führen.
   1. Befestigen Sie den Kopf des Tieres über eine Aufbiss / Kopfhaltevorrichtung. Nutzen ein 0,5 cm 2 cm Aufbiss aus Messing gefräst mit 2-4 mm Durchmesser Löchern durch sie jeweils 5 mm entlang der langen Achse gebohrt. Öffnen Sie das Maul des Tieres um diese Halterung und setzen Sie die oberen mittleren Schneidezähne in eine der Bohrungen je nach Größe des Tieres. Eine kleine Klammer über dem Rücken der Schnauze des Tieres, um es in Position zu halten (Abbildung 3) leicht anziehen.
   2. Bestätigen Sie, dass der Aufbiss / Kopfhalter fest mit der Mitte eines U-förmigen Gelenkarm (Abbildung 3) verbunden ist. Sichern Sie sich einen 1 cm breiten Stange in den linken Arm des "U" und benutzen Stange als linksseitigen Kopfstütze (auf der rechten Seite ist immer die operative Seite).
   3. Einmal fest in der Kopfhalter befestigt ist, drehen Sie die Maus auf einer linken Seitenlage. Positionieren Sie den Körper carefully auf der flachen Arbeitsfläche, um sicherzustellen, es wird während des gesamten Verfahrens stabil sein und vermeiden unnötige Torsionsspannung an der Halswirbel.
8. Positionieren Sie ein Operationsmikroskop in der Lage, 4x, 10x und 20x Vergrößerung auf das OP-Feld. Zu bestätigen, dass das Mikroskop kann seine Position in einer freihändigen Weise aufrechtzuerhalten, wie dies ideal für die zweihändige chirurgische Protokoll unten diskutiert.
9. Legen Sie eine bipolare-fähigen Kauter Einheit mit Handstück feiner Spitze Juwelier in der Lage, die für die Unterstützung bei der Ätzung von kleinen Gefäßen und Dissektion von Gewebe sofort zur Verfügung steht. Dies kann auch erforderlich sind, sollten starke Blutungen auftreten können.

4. Chirurgische Ansatz

1. Unter mikroskopischer Vergrößerung, verwenden Sie eine scharfe Schere oder ein Skalpell, um einen 1-1,5 cm postaurikulären Schnitt etwa 6-8 mm kaudal der auriculocephalic Falte erstellen. In der erwachsenen Maus, ein Einschnitt von der dorsalen Mittellinieseitlich bis zu einem Punkt in der Nähe des Kieferwinkels ausreichend. Sorgfältig vermeiden, schneiden tief darunter liegenden Gefäßstrukturen zu bewahren.
2. Führen Sie vorsichtig stumpf durch die subkutanen Fettschicht, die mit variabler Dicke sein kann. Fett kann, falls notwendig, um eine verbesserte Belichtungs sicher entfernt werden. Seien Sie vorsichtig beim Sezieren in einer ventralen-medialen Richtung wie die äußere Halsschlagader durchläuft diesen Bereich und Schäden an dieser Struktur kann große Mengen an Blutverlust und Überflutung des Operationsfeld führen. Kontrolle jeder starke Blutungen mit resorbierbaren Gelatineschwämme und / oder Wattepellets. Verwenden bipolaren Kauter für schwerere Blutungen.
3. Sobald die Fettschicht richtig aufgeteilt ist, setzen die Halsmuskulatur. Hinweis wichtigen Strukturen einschließlich der großen Muskelkörper der cleidomastoideus zentral innerhalb des freiliegenden chirurgischen Bereich, der externen Jugularvene ventral, und Ohrspeicheldrüsengewebe rostral über dem Winkel der Unterkiefer. Ein wichtiger Meilenstein ist ein kleines Nerven branch (der Hirnnerv XI), die um den hinteren / dorsalen Rand des cleidomastoideus wickelt den rostral zu der Ohrmuschel (Abbildung 4) zu verlängern.
4. In einer hinteren / dorsal zurückzuziehen vorsichtig die cleidomastoideus Muskelkörper (4, 5). Teilen Sie vorsichtig den transparenten Faszie umhüllt den Muskel Körper. Auf ähnliche Weise sanft Einfahren der Parotis und äußere Jugularvene in die entgegengesetzte (anterior / ventral) Richtung (Figur 5).
5. Mit guten Einfahren des cleidomastoideus Muskelkörper, wird der glänzende Kuppel der Bulla tympanica Knochenhaut in den Blick (Abbildung 6) zu kommen. Am kaudalen Aspekt der Bulla, das Einfügen eines tieferen zervikaler Muskel, der sternomastoideus, in Sicht (Abbildung 6) zu kommen. Erhaltung der Gesichtsnerven, die an der dorsalen und rostralen Aspekt der Bulla Kuppel sichtbar wird. Legen Sie ein Selbsthalter (Sterile Titan shaft-- in Einweg-Silikon eingebetteteinfügen) vor dem Bohren.
6. Mit Zwei-Hand-Technik, sanft unterteilen die Bulla Knochenhaut mit bipolarer Diathermie, um die darunter liegenden Knochen freizulegen. Mit einer Pinzette oder eines otologischer Löffel vorsichtig heben und schieben Sie die Knochenhaut in einer Umfangsrichtung zu stark setzen die Bulla Kuppel.
   Beachten: Schritt 4.6 ist für chirurgische Ansicht des Mittelohrraum zu maximieren. Nutzen Sie sorgfältige und schonende Umgang mit den Weichteilblutungen und / oder Auslaufen von interstitieller Flüssigkeit in die Bulla Hohlraum nach dem Bohren zu vermeiden.
7. Bei einer richtig belichtet Bulla Kuppel, bohren Sie ein 2 mm Pilotbohrung durch die Bulla Knochen mit einer zahnärztlichen chirurgischen Bohrer zwischen dem kaudalen Rand der Kuppel und der sichtlich undurchsichtigen Linie (die das Trommelfell), die sich über den rostralen Aspekt der Bulla (Abbildung 7). Achten Sie darauf, nur durch Knochen zu bohren, um zugrunde liegenden Strukturen, wie beispielsweise die Arteria stapedia bewahren. Bohren Sie ein zweites Pilotbohrung in der Nähe, um un-Überdachung des Bulla Knochen zu erleichtern ( Abbildung 7).
8. Mit einem Paar Spitze Pinzette Juwelier, uncap die Bulla Knochen in einem Rücken- und Schwanzrichtung (Abbildung 8). Entfernen Sie die Knochen in einer stückweise unter hoher Vergrößerung. Punktion nicht die Steigbügel Arterie, die direkt unterhalb der Bulla Cap liegt, wie Blutungen aus dieser Arterie kann das Verfahren beeinträchtigen. Minimieren Sie die Menge der Knochen entfernt, um übermäßige Flüssigkeitseintritt in das Mittelohr zu verhindern trotzdem erlauben hervorragende Visualisierung und den Zugang zu der runden Fensternische (Abbildung 8).

5. Runde Fenster Anwendung Ototoxische Agenten

1. Machen subtile Dreh Anpassungen an dem Kopfhalter, um die RWN quadratisch in den Blick zu bringen. Das RWN wird typischerweise auf den dorsalen und kaudalen Seite der Mittelohrraum angeordnet und erscheint als topfartigen Einzug der Ohrkapsel Knochen. In den meisten Fällen verläuft die Arteria stapedia 1-2 mm ventral / rostral zu diesem. Das RWN kann manchmal tuc seinperipher in einem spitzen Winkelung der Bulla Kuppel ked. In solchen Fällen ist eine sorgfältige Positionierung der Kopf des Tieres von größter Bedeutung.
   1. Mit Hilfe der Papier Dochte präoperativ vorbereitet, entfernen Sie alle sichtbaren Flüssigkeit im Mittelohr und RWN bis trocken Knochen wird visualisiert.
      Anmerkung: Dies ist der wichtigste Schritt des gesamten Protokolls als die ~ 10 & mgr; l (1 Tropfen) ototoxischer Mittels zum RWN aufgebracht leicht durch diese Flüssigkeit verdünnt werden.
2. Unter maximaler Vergrößerung, verwenden Sie eine feine Kaliber Nadel auf einem 1 ml Tuberkulinspritze zu einem Tropfen (~ 10 & mgr; l) von ototoxischen Mittel direkt an die RWN gelten, vollständig zu füllen. Achten Sie darauf, nicht stören die Steigbügel Arterie und genau zu beobachten, für den Ersatz von einer kleinen Lichtreflexion an der Basis eines trockenen Nische mit einer matt und trübe Flüssigkeitsmeniskus als Indikator, dass die Nische richtig Füllung.
   1. Lassen Sie das Mittel, um innerhalb der RWN für ca. 10 min Belichtungszeit ausruhen. Danach vollständig wick die Mittel und ersetzen sie durch eine neue Anwendung des gleichen Anbieters. Bestimmen Sie Wiederholungen der Anwendung gemäß Mittel-Spezifikationen. Gesamtbelichtungszeit bei dieser Vorgehensweise liegt typischerweise im Bereich zwischen 30 bis 60 min.
   2. Am Ende des Verfahrens vollständig abzusaugen den Agenten ein letztes Mal und gelten frische Mittels auf die RWN. Lassen Sie das Bulla uncapped und benutzen Pinzette, um das Weichgewebe über der Operationsstelle zu schließen.
3. Abdichten Operationsstelle auf der Ebene der Haut mit einem 4-0, nicht resorbierbare Monofilament-Nahtmateriales. Legen Sie das Tier in einem Erholungskäfig / Bahnhof. Überwachen klinischen Zustand des Tieres regelmäßig nach der Operation. Pflegen Sie das Tier in geeigneten Umgebungsbedingungen, einschließlich Wohnraum mit weichen Betten und Supplementierung mit weiche Nahrung, um Stress zu minimieren. Bestimmen Sie, zukünftige Verfahren und postoperative Zustände nach den institutionellen IACUC Protokolle.
4. Verwenden institutionellen IACUC Protokolle Instrument zu sterilisierens vor der Anwendung auf das nächste Tier. Lassen Sie für eine ausreichende Kühlung Zeit zwischen Instrument Gebrauch.

6. Postoperative Verfahren und Cochlear Tissue Harvesting

1. Wie in Schritt 2.5 beschrieben, durchführen physiologische Prüfung des Gehörs postoperativ an gewünschten Punkten und vor der Tötung. Zuführen Postoperative Verfahren nach experimentelle Zwecke. Opfern das Tier auf jeden gewünschten postoperativen Tag.
2. Bei Vollnarkose über IP-Injektion, nach institutionellen IACUC Protokolle erforderlich ist, zu opfern das Tier. Mit Hilfe einer scharfen Schere, enthaupten Tier nur kaudal des Hinterhauptbein. Stark öffnen Sie das Schädeldach mit einer Schere entlang der dorsalen und ventralen Mittellinie und weit verbreitet. Vorsichtig aushöhlen Hirngewebe, die zeitlichen Knochen freizulegen.
   Hinweis: Eine Reihe von Verfahren für die Untersuchung nach der Exposition Veränderungen in der Cochlea können von diesem Punkt verzweigt und werden in der Diskussion Abschnitt erwähnt werden. Bestimmen Sie die Untersuchungsmethode meisten relevant an die experimentellen Zwecke. Wenn Elektronenmikroskopie ist geplant, nachdem der Cochlea geschnitten werden, verwenden Sie Herzkatheteruntersuchung vor, eine Fixierung des Gewebes. Dies würde den Rahmen dieser Diskussion und hat sich in der Tiefe an anderer Stelle abgedeckt. ¹³
3. Schneiden Sie die Schläfenbeine aus der Schädelbasis mit der Schere und sofort in Fixierungslösung gelegt. Tauchen Knochen direkt in 4% Paraformaldehyd 1,5 h bei RT. Überwachen Fixierungszeit, wie längere Dauer kann das Ergebnis der histologischen Analyse bei späteren Schritten zu begrenzen. Entkalken seziert Knochen für eine variable Zeitperiode durch Eintauchen in 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).

Ergebnisse

In einer aktuellen Studie von Stevens et al Verwendung des obigen Protokolls, wurden erwachsene CBA / CaJ Mäusen beider Geschlechter über runde Fenster Diffusion Heptanol ausgesetzt. ¹⁵ Heptanol ist ein Gap Junction un-Koppler bekannt, gezielt erzeugen, erzielbare Verletzung Zellen des Cochlea-Seitenwand. Der Zweck der Studie war es, ein zuverlässiges Modell für gezielte Cochlea-Schäden zu produzieren, so dass für die Untersuchung von postoperativen Regeneration von allen beschädigten Elemente. Präoperative und postoperative Hörschwellen als Funktions Endpunkt serviert. Mikroskopie und immunhistochemischen Färbetechniken wurden verwendet, um morphologische Veränderungen zu untersuchen. Ein signifikanter Anstieg der ABR Schwellen im Heptanol behandelten Mäusen (Figur 9) beobachtet. Kontrolltiere Empfangen Scheinoperation, mit der Lieferung von Kochsalzlösung anstelle von Heptanol, keine signifikante Schwellenverschiebungen in jedem getesteten Frequenz demonstrieren.

Immunfärbung gegen eine einwärtsgleichrichtendenKaliumkanal (Kir) 4.1 diente als eine indirekte Methode zur Visualisierung von Schaden / Rückgewinnung von Cochlea-Strukturen. Dies zeigte, hoch reproduzierbare Unterschiede zwischen Behandlung und Kontrolle Ohren. Insgesamt Färbeintensität wurde deutlich zurückgegangen innerhalb der Stria vascularis (STV) und unter Fibrozyten des Ligamentum spirale (SLF) 1-3 Tage nach der Exposition Heptanol, bezeichnet große Mengen von gezielten Schädigung dieser Gebiete. Gab es eine bestimmte Abnahme der Kir 4.1 Färbungsintensität in den Bereichen der Typ II und Typ IV SLFs (Abbildung 10) und STV (Abbildung 11). Der Nachweis der gestörten Kern Integrität und Chromosomenkondensation / typisch für zelluläre Apoptose blebs wurde auch über die Kern Gegenfärbemittel in diesen Cochlea-Bereichen (Abbildung 10) zu sehen. Vakuolisierten Zonen Kir 4.1 Anfärben deutlich in 7 Tagen gelöst und abwesend waren vollständig auf 14 Tage. Wenn Kir 4.1 Färbungsintensität wurde in den Bereichen StV quantifiziert, nachgewiesen behandelten Ohren eine initial Trog, gefolgt von einer signifikanten Verschiebung (p <0.05) zurück in Richtung Steuerintensität von 7 Tagen nach heptanol Exposition (Abbildung 12).

Abbildung 1. Instrument einzurichten. Darstellung der präoperativen Aufbau der Instrumentierung. Alle Geräte sollten innerhalb der sterilen OP-Feld leicht zugänglich sein. Typische Instrumentierung umfasst 2 scharfe Dissektion Schere, 2-3 geraden und / oder einer Pinzette gebogene Spitze Juwelier mit Ohr-Küretten, gekrümmte Wellen otologischer Picks (später substituiert mit Rosen nimmt - nicht gezeigt) und eine elektro Kauter Einheit mit einer Pinzette feine gebogene Spitze Juwelier Kopfschmuck. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die chirurgische Versorgung. Zusätzliche Lieferungen für die Aufrechterhaltung der RWN Umwelt. Sterilisiert labwipe Ausschnitte für Papierdocht Bildung (links), Schwefelfäden dicht gebildet Papier aus sterilisierten Laborwischtücher (Mitte), und 4 mm Wattepellets (rechts) werden verwendet, um überschüssige Flüssigkeit und Bluthochwasser in der runden Fensternische wischen gemacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Tierkopfhalter. Bild der Darstellung der Kopfhalter und Beißblock. Die Löcher in den Block passen, und befestigen Sie die oberen mittleren Schneidezähne. Eine Klemme wird vorsichtig über den dorsalen Schnauze festgezogen, um das Tier zu befestigen. Verwendung eines Kopfhalter ist entscheidend für die erfolgreiche chirurgische outcome. Idealerweise sollte dieser in der Lage, über die rostral-kaudale Achse des Tieres, um chirurgische Blick auf die Bulla während des Verfahrens zu optimieren drehen zu können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Cleidomastoideus m.. Schemadiagramm, das die grundlegende Anatomie der Nagetier-Halsmuskulatur und seine Verbindung mit der äußeren Halsschlagader. Die cleidomastoideus Muskel ist das ohne weiteres identifiziert Muskel während der chirurgischen Ansatz. Freigabe der Kuvertierung Faszie gefolgt von posterior / Rückenzurückziehen des Muskels Körper chirurgische Dissektion in Richtung der Bulla tympanica (schwarzer Kreis) zu richten. Bitte klicken Sie hier, um al ansehenArger Version dieser Figur.

Abbildung 5. Chirurgische Belichtungsbereich. Zeigt die Exposition nach der Sektion durch die kutanen und subkutanen Fettschichten. Strukturwahrzeichen von Note gehört ein Zweig der Hirnnerv XI über der cleidomastoideus Muskel (A), die externe Halsvene (B), und freiliegende Parotisgewebe (C). Die Hirnnerv XI Zweig wird oft mit einem kleinen Gefäß zugeordnet und müssen vor der Verfahren unterteilt werden. Rechts nach links auf dem Bild entspricht rostral-kaudale Achse des Tieres. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. freilegen bulla. Die Exposition der Bulla tympanica nach dem Zurückziehen des cleidomastoideus und der umgebenden Strukturen. Bemerkenswerte Sehenswürdigkeiten sind der cleidomastoideus Muskelkörper (A) reflektiert posterior / dorsal, der Gesichtsnerv (B), und die glänzende Kuppel der Bulla tympanica Knochenhaut (C). Beachten Sie auch, das Einführen des sternomastoideus Muskel an der linken kaudalen Aspekt der Bulla tympanica (Sternchen). Die Anwesenheit des Gesichtsnerven an der dorsalen und rostralen Aspekt der Bulla ist ein entscheidender Meilenstein für wahre Identifizierung der Bulla. Rechts nach links auf dem Bild entspricht rostral-kaudale Achse des Tieres. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Machen runden Fensternische ich. Bild zeigt das tympanic Bulla nach der Sektion der darüberliegenden Periost vollständig ausgesetzt. Die Pilotbohrung wird am besten auf halber Strecke zwischen dem kaudalen Rand des Bulla Kuppel und einem subtilen undurchsichtigen Linie innerhalb des rostralen Bereich der Bulla (die das Trommelfell) sichtbar platziert. Eine zweite, benachbarte Pilotbohrung kann einfacher un-Überdachung des Bulla Knochen zu erleichtern. Vermeidung von Tiefbohrungen zu achten, um nicht die zugrunde liegende Arteria stapedia verletzen werden. Die dunkle, metallischer Gegenstand am unteren Rand des Bildes ist die Titan weichen Geweberetraktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8. Machen runden Fensternische II. Ohne Cap Bulla tympanica mit der Exposition von der runden Fensternische (Pfeil) und Arteria stapedia (rot Struktur1-2 mm lateral der Nische), wie unter 20-facher Vergrößerung betrachtet. Die Nische oft liegt in einer Position unter dem spitzen Winkel von der Bulla Kuppel mit der Ohrkapsel an der kaudalen Seite der Kuppel gebildet versteckt. Es ist zwingend notwendig, dass die vollständige Visualisierung der Nische vor dem Aufbringen des ototoxic Mittel oder Docht erreicht werden. Übermäßige Knochenentfernung während Entdeckeln sollte auch vermieden werden, wie interstitieller Flüssigkeit / Blut neigte dazu, die den Hohlraum überschwemmen, wenn große Löcher wurden erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9. Repräsentative Ergebnisse -. Heptanol Hörverlust und Recovery Mittlere akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) Schwellenwerte (dB SPL), aufgetragen als Funktion der Ton pipFrequenz. Die Messungen werden nach Vorbelichtung (Black-Control) und postoperativen Tag (POD) 1, 7 und 14 (rot) zusammengefasst. Fehlerbalken stellen SEM. Bild wurde von Stevens et al erneut aufgetragen. 2014 ¹⁵ Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 10. Repräsentative Ergebnisse - Gezielte Cochlea-Schäden nach heptanol Exposition Teil I. Änderungen der Kalium Inner Rectifier (Kir) Kanal 4.1-Färbung in der Stria vascularis (STV) der Ohren mit heptanol behandelt und unter Kontrolle zu Ohren. (A) Normale Kir 4.1 Färbung typisch für Steuer Ohren mit starken strial Zell Affinität für Kir 4.1 (grün). (B) Behandlung Ohr auf POD1. Große vakuolisierte Zonen decrgelockert Kir 4.1 Affinität innerhalb der StV (Pfeilspitzen) zusammen mit einem allgemeinen Rückgang der StV Kir 4.1 Färbungsintensität gesehen. Kerne mit Propidiumiodid (rot) (B) gegengefärbt. Maßstabsbalken = 15 & mgr; m. Bild wurde von Stevens et al erneut aufgetragen, 2014 ¹⁵ Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 11. Repräsentative Ergebnisse - Gezielte Cochlea-Schäden nach heptanol Exposition Teil II Änderungen des Ligamentum spirale (SL) von Heptanol behandelten Ohr im Vergleich zu Ohr zu steuern.. (A) Normale Kir 4.1-Färbung (grün) innerhalb der typischen Steuer Ohr mit normal erscheine Typ II Ligamentum spirale Fibrozyten (II) SL. (B) Heptanol treated Ohr mit deutlichen Abnahme der Kir 4.1 Färbungsintensität im Bereich des Typ-II-Spiralband Fibrozyten Kern Störungen und chromosomalen Kondensations- / die mit Apoptose (Pfeile) Blasen. Kerne werden mit Propidiumiodid (rot) gegengefärbt. Maßstabsbalken = 15 & mgr; m. Bild wurde von Stevens et al erneut aufgetragen, 2014 ¹⁵ Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 12. Repräsentative Ergebnisse -. Rückgewinnung von Cochlea-Färbeintensität folgenden heptanol Exposition Die mittlere relative Luminanz Kir 4.1 Färbung aufgetragen als Funktion der Post-Expositions-Tag. Relative Leuchtdichte wird als Kir 4.1 reflektierenden Intensität unter der konfokalen Mikroskopie in Heptanol treat berechneted Ohren als Prozentsatz des gleichen Kontroll Ohren gemacht. Hinweis POD14-28 Daten werden als ein einzelner Punkt auf der Kurve gebündelt. Ausgefüllte Kreise stellen Mittelwerte dar, während die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts. Eine deutliche Erholung der relativen Leuchtdichte wurde zwischen POD 7 und späteren Zeitpunkten (Student t-Test p <0,05, Sternchen) demonstriert. Bild wurde von Stevens et al. Neu aufgetragen, 2014 ¹⁵ Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Die oben beschriebenen Protokoll und repräsentative Ergebnisse wurden in einer CBA / CaJ Mausmodell einschließlich beider Geschlechter erhalten. Diese Inzuchtstamm ist bekannt als ein "gutes Gehör" Standard und "normalen Alterungs" Modell im Gehörforschung etabliert. ^16-23 Beschreibung der Verwendung dieses Protokolls in anderen Säugetiermodelle geht über den Rahmen dieses Textes. Der Leser sollte jedoch beachten, dass die RWN Anwendungstechnik bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung der Säugetier-Innenohr. Von diesen ist der bedeutendste, dass es direkte Störung des empfindlichen anatomischen Struktur und biochemische Gradienten, die innerhalb der Wände der Ohrkapsel vorhanden vermeidet. Verfahren wie Cochleostomie und Implantation von Infusionspumpen haben die Neigung, sich direkt verletzen Innenohrstrukturen, die zu Dauerschwelle verschiebt; eine Tatsache, die berücksichtigt bei der Analyse von Ergebnissen getroffen werden müssen. Störung der Cochlea-Seitenwandstrukturen durch invasive methods kann auch die Verwendung von ototoxischen Mittel wie Furosemid oder Heptanol, deren spezifische Zone der Effekt wird zu dieser Position beschränkt. ^15,24 Alternative nicht-invasive Ansätze wie trans-Paukeneinspritzung und parenterale Injektion durch unzuverlässige Ergebnisse und gequält worden zu begrenzen / oder systemische Toxizität auf die Tiermodell. Diese Anwendungsmethode hat sich diese beiden Nachteile zu vermeiden, und erreicht ein Niveau der Konsistenz, die der von den oben diskutierten invasiven Methoden.

Andere Vorteile dieses Verfahrens sind: seine breite Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von Tiermodellen und die Durchführbarkeit in eine bestehende Infrastruktur integrieren Labor. Für Letztere sind keine spezialisierten Reagenzien oder Chemikalien neben den gewählten ototoxische Mittel, Anästhetika, Analgetika und erforderlich. Ototoxic Mittel werden typischerweise in einer festgelegten Konzentration in einem ausreichend großen Volumen der Lösung (5 ml) verwendet und gemischt werden, um längere Zeit dauern betrachtening jede Anwendung verwendet etwa 10 & mgr; l (bei Mäusen). So nach der ersten Beschaffung von Verbrauchsmaterialien und Instrumente, sind Ermittler relativ frei von zeitaufwendigen Herstellung der Lösung oder häufigen Austausch von Materialien. Diese Technik bietet auch Verringerungen der Operationszeit, die erheblich sein können im Vergleich zu den Verfahren, die Implantation von perilymphatische Infusionspumpen oder cochleostomies. Bei Erreichen eines Niveaus an technischer Kompetenz, unsere durchschnittliche Bearbeitungszeit von der ersten Inzision bis zum Abschluss war in der Regel 20 Minuten bis 1,5 Stunden, je nach Länge der Exposition für die ototoxische Mittel gewünscht. Drei oder vier Operationen können leicht an einem Tag abgeschlossen werden, so dass für mehr Effizienz und erhöhte Potenzial für den Erhalt von erfolgreichen Ergebnissen. Wie oben beschrieben, kann diese Technik auch leicht auf eine Vielzahl von Tiermodellen einschließlich Mäusen, Ratten, Meerschweinchen und Wüstenrennmäuse aufgetragen werden.

Beschränkungen dieses Verfahrens sind auf die zentriertemäßig steile Lernkurve erforderlich, es zu meistern und verringerte erwarteten Ergebnisse, bis technische Kompetenz erreicht wird. Wie in größerem Detail unten diskutiert wird, werden kleine Fehler bei der chirurgischen Ansatz oder unzureichende Visualisierung des Operationsfeldes fast unweigerlich zu einem schlechten Ergebnis führen. Subtile Erkenntnisse, die ein Anfänger kann nicht erkennen, wie eine Sub-Millimeter dicke Luftblase blockiert den Zugriff des Agenten zu der runden Fenstermembran oder interstitieller Flüssigkeit Verdünnung des Mittels, die Zeit nehmen, zu schätzen und zu entwickeln, die psychomotorischen Fähigkeiten erforderlich, um sie zu korrigieren. Aber mit wiederholter Durchführung des Verfahrens diese Hindernisse sind leicht zu überwinden und bilden eine weniger einschüchternd technische Herausforderung für Ermittler, als einige der oben genannten invasiven Methoden. Schließlich ist diese Technik mit der Einschränkung, dass in Bezug Cochlea Verletzung kann nur an einem einzigen Punkt in der Zeit während des chirurgischen Exposition induziert werden verbunden. Dies kann zu einem gewissen Grad überwunden werdenDurch Füllen des RWN mit absorbierbarer Gelatineschwamm in dem Mittel getränkte wie von Heydt et al. ¹⁰ Der absorbierbare Gelatineschwamm wird mit der Zeit resorbiert wird, kann jedoch für eine längere Belichtungszeit zu ermöglichen, als es durch Auftragen einer wässrigen Lösung alleine nicht erreichbar.

Damit ein Prüfer, um die vollen Vorteile dieser Technik realisieren und alle Fallstricke zu vermeiden, ist es wichtig, die beiden entscheidenden Elemente dieser Technik erkennen: 1) die konsequent Visualisierung der Mittelohrraum und RWN aufrecht zu erhalten; und 2) die Fähigkeit, OP-Feld frei von interstitieller Flüssigkeit und / oder Blut zu halten. Bei der Erreichung der ehemaligen von diesen, kann die Bedeutung einer ordnungsgemäßen Kopfhalter nicht überbetont werden. Sichere Fixierung der Kopf des Tieres gewährleistet eine stabile Ausblick unter dem Mikroskop; deren Bedeutung wird ohne weiteres deutlich, wenn subtile Instrumentierung drastisch die Positionierung der Strukturen unter Vergrößerung ändert. Ein guter head Halter, der über rostral-kaudale Achse des Tieres drehen kann erleichtert auch wichtig dynamischen Veränderungen in der Prüfer Linie der Website. Oft kann ein paar Millimeter der Drehung um diese Achse die Differenz zwischen Visualisierung der RWN und Visualisierung von nur der Ohrkapsel Knochen bedeuten. Die Fähigkeit, sich ständig Ansicht zu ändern ist auch ausschlaggebend für die Gewährleistung der interstitiellen Flüssigkeit ordnungsgemäß aus der Tiefe der Nische und entfernt auch, dass die ototoxische Mittel vollständig zwischen Anwendungen entfernt, wie in Teil 5. diskutiert Unserer Erfahrung nach Blut, Kondensation, oder interstitieller Flüssigkeit dass tritt in den Mittelohrraum hat die Fähigkeit, mit der gesamten Experiment stören. Dies ist nicht verwunderlich, da die winzige Menge ototoxische Mittel an die Rundfenster (~ 10 & mgr; l) kann leicht durch in Kontakt kommen auch kleine Mengen an Fremdflüssigkeit verdünnt werden angewendet. Aus diesem Grund, sorgfältige chirurgische Präparation, Stückwerk Entdeckelungs der Bulla tympanica und sorgfältige preservatIon der Arteria stapedia sind gleichbedeutend mit einer erfolgreichen Versuchsergebnisse.

Wenn die oben genannten kritischen Schritte eingehalten werden und die erwarteten Ergebnisse sind immer noch nicht erreicht, sollte Fehlerbehebung beginnen. Nach unserer Erfahrung ist es oft hilfreich, um Testvariationen von zwei Verfahrenselemente durchzuführen. Die erste ist, die Frequenz, mit der die ototoxic Mittel wird in die runde Fenster nachgefüllt modifizieren. Je nach Mittel verwendet wird, ist Gesamtbelichtungszeit zwischen 30 Minuten und 1 Stunde, mit kompletter Dochtwirkung und anschließende Austausch der Mittel alle 10 min. Wenn Aussetzen für kürzere Laufzeiten, Erhöhung der Gesamtbelastung kann dem Agenten mehr Zeit, um über die runde Fenstermembran diffundieren. Zusätzliche Expositions und Nachfüllen kann auch helfen, unerwünschte Verdünnung des ototoxischen Mittel durch Blut, Kondensation, oder interstitielle zu vermeiden, wie oben erörtert. Sollte bei diesem Ansatz vorsichtig aufrechterhalten werden jedoch, da es das Risiko eines unbeabsichtigten erhöhen neigtly Verletzung der Arteria stapedia und / oder Einführung von interstitieller Flüssigkeit in die RWN.

Diese Technik ist in dem, was er anbietet, um Untersuchungen von Cochlea-Physiologie und Pathophysiologie signifikant. Diese minimal-invasive Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der empfindlichen biochemischen Prozesse und war bei der Förderung unserer Forschung auf die Beurteilung Cochlea regenerative Potenzial soll gleichbedeutend. ^12,24 Dieses chirurgische Vorgehen und die Belichtung wird auch in einer Vielzahl von anderen Ableger Techniken wiedergegeben und erfolgreiche Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden in Studien von Cochlea-Stammzelle Implantation berichtet worden. ¹⁴ Es bleibt noch viel Unbekanntes über die Cochlea, aber diese Technik, zusammen mit dem breiteren Instrumentarium zur Verfügung, um Ermittler, wird in Verengung diese Wissenslücke zu unterstützen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Heptanol 98%	Sigma-Aldrich	H2805	PubChem Substance ID 24895536
Ketaset Injectable	Patterson Veterinary	07-803-6637	Concentrate 100mg/ml
(Ketamine HCl)	10 ml	Schedule CIII controlled substance
Anased Injectable	Lloyd Laboratories	NADA# 139-236	Concentrate 20mg/ml
Buprenex Injectable	Patterson Veterinary	07-850-2280	Concentrate 0.3 mg/ml
(Buprenorphine HCl)	5 ampules per box	Schedule CIII controlled substance
Betadine Skin Prep Solution	Medline	MDS093941	1 Quart screw top bottle
0.9% Sterile Saline	Variable		For mixing solutions and injections
Operating Microscope	Carl Zeiss	32192
Controlled Acoustics Environment Sound Booth	Industrial Acoustics Company
Surgical Head Holder	Custom Made –	Please see Figure 3
Medical University of South Carolina
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch	World Precision Instruments	555801L	Maximum spread 20 mm
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder
90N Dental Belt Driven Hand Drill	Emesco	Vintage Item
Scalpel Handle Size 6	Bard-Parker	MEDC-011990
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade	Bard-Parker	SKU: 097-7215	50 Blades/Box
Via ACE Surgical Supply Code
Straight Tip Jewelers Forceps	Bernell	MIL17304
Iris Scissors Curved	Medline	DYND04026
Iris Scissors Straight	Medline	DYND04025
Stevens Tenotomy Scissors Straight	Medline	MDG3222111
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip	MytaMed	Item# 6.56.00	Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip	MytaMed	Item# 6.56.01
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	CODE 34155	White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.
House Ear Curette, 6” shaft, light angle	Medline	MDG0396486
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100	Medline	IIS34201	Substitutions may be made
Cotton pellets #3 4 mm	Richmond	Manufacturer Code 100108
ElectroSurgical Unit 100 E M/M	Elmed	List No. 52-5770	Bipolar and Monopolar Capable
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle	BD	Product Number: 329410	Optional for delivery of Ototoxic agent
23G, blunt tip, 1” length needle	Kendall	Product Code 8881202397	For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery
Surgical Mask	U-line	S-10478
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves	U-line	S-12549
Precision Hair Clippers	Wahl		Multiple models may be substituted
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13 mm 3/8 circle needle	Ethilon	1855G	Substitutions may be made.
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisher	01-812054
Dry Sterilizer	ROBOZ	Germinator TM 500