Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Zusammenfassung

Diese Handschrift beschreibt eine einfache und Hochdurchsatzverfahren für wasserlösliche Proteine ​​mit hydrophoben Pigmente Zusammenbauen, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen basiert. Wir zeigen die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Montage von nativen Chlorophylle mit vier Varianten von rekombinantem wasserlösliches Chlorophyll-Bindungsproteine ​​(WSCPs) von Brassica - Pflanzen in E. ausgedrückt coli.

Zusammenfassung

Chlorophylle (Chls) und bacteriochlorophylls (BChls) sind die primären Cofaktoren, die photosynthetischen Lichtnutzung und Elektronentransport durchzuführen. Ihre Funktionalität hängt entscheidend von ihrer spezifischen Organisation in großen und aufwendigen Multiuntertransmembranprotein-Komplexe. Um auf molekularer Ebene zu verstehen, wie diese Komplexe Umwandlung von Solarenergie zu erleichtern, ist es wesentlich, Protein-Pigment, und das Pigment-Pigment-Wechselwirkungen und ihre Wirkung auf die angeregten Dynamik zu verstehen. Eine Möglichkeit, ein solches Verständnis zu gewinnen, ist durch die Konstruktion und Komplexe von Chls mit einfachen wasserlöslichen rekombinanten Proteinen zu studieren. Jedoch ist die lipophile Chls und BChls in wasserlösliche Proteine ​​enthält schwierig. Darüber hinaus gibt es kein allgemeines Verfahren, das für die Montage von wasserlöslichen Proteinen mit hydrophoben Pigmente verwendet werden könnten. Hier zeigen wir ein einfaches und hohen Systemdurchsatz auf Basis von Wasser-in-Öl-Emulsionen, die Esel ermöglichtembly von wasserlöslichen Proteinen mit hydrophoben Chls. Das neue Verfahren wurde durch Zusammenfügen von rekombinanten Versionen des wasserlöslichen Chlorophylls Bindungsprotein von Brassicaceae Pflanzen (WSCP) mit Chl validierten einem. Wir zeigen die erfolgreiche Montage von Chl a mit rohen Lysaten von WSCP E. exprimieren coli - Zelle, die für die Entwicklung eines genetischen Siebsystem für neue wasserlösliche Chl-Bindungsproteine ​​verwendet werden können, und für Studien der Chl-Protein - Wechselwirkungen und Montageprozessen.

Einleitung

Hydrophobe Pigmente wie Chlorophylle (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) und Carotinoide sind die primären Cofaktoren in photosynthetischen Reaktionszentren und Lichtsammelproteine, die den Elektronentransport durchzuführen, und Lichtenergie Erfassung und Übertragung. Die Reaktionszentren und die meisten der Chl-bindenden Lichtsammelkomplexe sind Transmembranproteine. Die Fenna-Matthews-Olson (FMO) Protein von nicht-oxygenic photo grün-Schwefelbakterien ^1,2 und die Peridinin-Chl Protein (PCP) von Dinoflagellaten ³ sind außergewöhnliche Beispiele von wasserlöslichen Lichtsammelproteine. Die wasserlöslichen Chlorophyll - bindenden Proteinen (WSCPs) von Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae und Amaranthaceae Pflanzen ^{4, 5} sind ein weiteres einzigartiges Beispiel, aber im Gegensatz zu FMO und PCP, sind diese weder in einem Licht Ernte noch in einem der primären photosynthetischen Reaktions und ihre genaue PHYphysiologischen Funktionen sind noch unklar ^5-8. Ihre hohe Chl-Bindungsaffinität haben zu einem empfohlenen Funktion führte als vorübergehende Träger von Chls und Chl Derivate ^9,10. Alternativ wurde die Hypothese aufgestellt , dass WSCP spielt eine Rolle bei Spülung Chls in geschädigten Zellen und schützt vor Chl-induzierten Photooxidationsschäden ^7,11-13. In jüngerer Zeit wurde gezeigt , dass WSCP Funktionen als Protease - Inhibitor vorgeschlagen und spielt während der Blütenentwicklung ¹⁴ eine Rolle bei der Pflanzenfresser Widerstand als auch reguliert Zelltod. WSCPs werden in zwei Hauptklassen aufgeteilt, den photophysikalischen Eigenschaften auf. Die erste Klasse (Klasse I, z. B. von Chenopodium album) kann Photokonversion bei Beleuchtung unterziehen. Klasse II WSCPs von Brassica - Pflanzen , die durchlaufen nicht fotovoltaischen ^5,10, sind weiter in der Klasse IIa unterteilt (z. B. von Brassica oleracea, Raphanus sativus) und IIb (z. B. von Lepidium virginicum ). Die Struktur der Klasse IIb WSCP von Lepidium virginicum ⁸ wurde durch Röntgenkristallographie bei 2,0 Å Auflösung gelöst. Es zeigt eine symmetrische Homotetramers, in dem die Protein-Untereinheiten einen hydrophoben Kern bilden. Jede Untereinheit bindet ein einzelnes Chl, die in einer engen Anordnung Ergebnisse von vier dicht gepackten Chls innerhalb der core.This einfach alle Chl Anordnung WSCPs ein potentiell nützliches Modellsystem zur Untersuchung der Bindung und Montage von Chl-Protein-Komplexe bildet, und die Auswirkungen der benachbarten Chls und Protein-Umgebungen auf die spektralen und elektronischen Eigenschaften einzelner Chls. Darüber hinaus kann es Vorlagen bieten für die Konstruktion künstlicher Chl-bindende Proteine, die für die lichtsammelnden Module in künstlichen Photosynthese-Geräten verwendet werden kann.

Rigorose Studien von nativen WSCPs sind nicht durchführbar , da die Komplexe aus Pflanzen gereinigt immer ein heterogenes Gemisch von Tetrameren mit verschiedenen Kombinationen von Chl a enthaltenund Chl b ^9. Somit wird ein Verfahren zur rekombinant exprimierten WSCPs mit Chls in vitro Zusammenbauen erforderlich. Dies wird durch die vernachlässigbare Wasserlöslichkeit Chls herausgefordert , die es unmöglich macht , den Komplex in vitro zusammenzubauen , indem einfach die wasserlöslichen Apoproteine ​​mit Pigmenten in wässrigen Lösungen vermischt wird . In vitro Montage durch die Apoproteine ​​mit Thylakoidmembranen Vermischen von ¹⁵ gezeigt wurde, aber dieses Verfahren ist mit dem nativen Chls in den thylakoids begrenzt. Schmidt et al. berichtete über mehrere Chl und BChl - Derivate mit WSCP von Blumenkohl (CaWSCP) Montage von rekombinant ein Histidin-markierten Protein in E. exprimieren coli Immobilisierung es auf eine Ni-Affinitätssäule und in Detergenzien ¹¹ Chl Derivate solubilisiert einzuführen. Erfolgreich Rekonstitution von rekombinantem WSCPs von A. thaliana ⁶ und Rosenkohl (BoWSCP), Japanisch Hederich (RshWSCP) eind Virginia pepperweed (LvWSCP) durch ein ähnliches Verfahren wurden ebenfalls berichtet.

Hier stellen wir eine neue, allgemeine, einfache Methode zur Chls mit WSCP Montage, die nicht Tagging erfordert oder die Immobilisierung von Proteinen. Es stützt sich auf Emulsionen aus ihren wäßrigen Lösungen der wasserlöslichen Apoproteine ​​in Mineralöl vor. Die Proteine ​​werden daher in Wasser-in-Öl (W / O) Mikrotröpfchen mit sehr hohen Oberflächen - Volumen - Verhältnis ¹⁶ eingekapselt. Die hydrophoben Cofaktoren werden dann in dem Öl gelöst und leicht in den Tröpfchen aus Ölphase eingeführt. Wir berichten über die Verwendung der Methode für Apoproteine ​​von mehreren Varianten von WSCP Montage rekombinant in E. ausgedrückt coli mit Chl a. Wir veranschaulichen die Anordnung aus rohem Lysat von WSCP-überexprimierenden Bakterien, die für die Entwicklung neuer Bindeproteine ​​Chl als Screeningsystem verwendet werden kann.

Protokoll

1. Vorbereiten Chl ein Stammlösungen

1. Kritischste Schritt: Führen Sie alle Schritte des Chlorophylls Zubereitung in einer chemischen Haube, unter grünem Licht (520 nm) oder in der Dunkelheit, um Lichtschäden zu minimieren. Immer Stickstoff oder Argon hinzufügen, bevor die Pigmente für die Lagerung einfrieren. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungsmittel Analysequalität sind.
2. Man wiegt etwa 5 mg lyophilisiertes Spirulina platensis Zellen oder andere Cyanobakterium Zellen , die nur Chl a in Thylakoidmembran und zerquetschen sie mit einem Mörser zerstoßen.
3. Legen zerstoßenen Zellen auf eine Glassäule und wäscht mit etwa 50 bis 100 ml 100% Aceton, um Carotinoide zu entfernen. Entsorgen Sie die eluierte orange / grün Fraktion.
   Hinweis: Wenn das orangefarbene Fraktion nicht mit 100 ml Aceton weiter Waschen der Zellen mit Aceton, bis die grüne Fraktion eluiert wird, beginnt zu eluieren.
4. Austausch Aceton mit 100% Methanol und sammeln die grüne Fraktion , die Chl ein. Das Volumen des eluierten fractIon kann zwischen 50 bis 100 ml variieren. Am Anfang hat die eluierte Fraktion eine dunkelgrüne Farbe, die am Ende der Elution in hellgrün verändert. Wenn die Farbe der eluierten Fraktion in blass grün wird die Elution stoppen.
5. Man dampft das Methanol am Rotationsverdampfer, bis der Extrakt vollständig trocken ist. Wenden Sie keine Wärme an die Lösung; sicherzustellen, dass die Wasserbadtemperatur des Verdampfers nicht mehr als 30 ° C nicht übersteigt.
   Hinweis: Die Zeit der Verdampfung auf das Volumen des Methanolfraktion hängt verdampft und kann variieren zwischen 10-60 min. Es ist wichtig, den Extrakt vollständig trocknen.
6. Man löst die Pigmente aus dem getrockneten Extrakt in einem kleinen Volumen Diethylether (ca. 5-10 ml) und filtriere durch Watte. Stellen Sie sicher, dass Pigmente vollständig in Ether vor der Filterung gelöst sind.
7. Man dampft das Diethylether, bis die Pigmente vollständig trocken sind (10-30 min).
   Anmerkung: Die trockenen Pigmente mit gespült werden kann und gehalten unter Stickstoff oder Argon bei -2im Dunkeln 0 ° C bis zur Weiterverarbeitung.
8. Man löst die trockenen Pigmente in dem kleinsten Volumen möglich von 100% Methanol (ca. 1 ml), auch wenn nicht alles vollständig suspendiert. 4 ml Aceton zu der Lösung, und schlagen Sie das Glas vorsichtig, um vollständig die Pigmente auflösen.
9. Mit Hilfe einer Pasteur-Pipette, laden Sie die Probe vorsichtig auf eine Säule von DEAE-Sepharose in 100% Aceton ins Gleichgewicht gebracht.
10. Eluieren Carotinoide (ein orange-gelbes Band) mit 100% Aceton. Dann eluieren Chl a (grünes Band) mit 3: 1 v / v Aceton / Methanol - Gemisch.
    Hinweis: Das Volumen an Aceton und Aceton / Methanol-Gemisch auf das Volumen der DEAE entspricht etwa Sepharose auf die Säule geladen.
11. Überprüfen Chl eine Reinheit durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer 68: 25: 5: 2 Dichlormethan / n-Hexan / Isopropanol / Methanol (v / v) -Mischung als Eluierungsmittel ^17.
12. Dampfe das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer , bis der Chl a vollständig trocken ist (10-60 min).
    Hinweis: Das trockene Chl a kann mit Stickstoff oder Argon gelagert und unter Argonatmosphäre bei -20 ° C im Dunkeln gespült werden.
13. Bereiten Sie Chl eine Stammlösung von 2-4 ml 100% Ethanol , um das trockene Chl a wieder aufzulösen.
    Hinweis: Der Extinktionskoeffizient von Chl a bei 663 nm beträgt 74.400 cm ^-1 M ^-1 (83,3 cm ^-1 (mg / ml) ^-1) in Ethanol. Eine typische Vorratslösung sollte eine OD von 1,860 haben, auf eine Konzentration von 25 mM (23 mg / ml) entspricht. Zugabe von 20 ul dieser Lager zu einer Emulsion , enthaltend 5 ml der organischen Phase, und 1 mg WSCP in 1 ml der wässrigen Phase führt zu einem Gemisch mit 10 - facher molarer Überschuß von Chl a vs. WSCP.

2. Herstellung von organischen Phase der Emulsion

Anmerkung: Die organische Phase der Emulsion aus Mineralöl zusammengesetzt ist, das 4,5% (v / v) Span 80 und 0,4% (v / v) Tween 80.

1. Wiegen in einem 50-ml-Röhrchen mit 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 und 38 g Mineralöl. Gut mischen alle Komponenten und abkühlen auf Eis.
   Anmerkung: Die organische Phase kann bis zu einer Woche in 4 ° C gelagert werden.

3. Herstellung der wässrigen Phase der Emulsion

Anmerkung: Die wässrige Phase der Emulsion von entweder gereinigtem WSCP zusammengesetzt sein kann, oder Rohextrakt von Bakterien überexprimieren WSCP.

1. Herstellung einer wässrigen Phase gereinigten WSCP enthält.
   1. Wachsen E.coli BL21 - Bakterien WSCP Plasmid ¹² in 1 l LB - Medium bei 37 ° C bis zur OD von 0,3-0,6 enthält.
   2. Induzieren die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG. Nach der Induktion wachsen Bakterien bei 30 ° C für 12 bis 16 Stunden.
   3. Ernte Bakterien durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
   4. Man löst das Pellet in Bindungspuffer und beschallen auf Eis (30 sec auf 15 sec ab, fünf Mal). Verwenden 10 ml Puffer für das erhaltene Pellet aus der Zentrifugation von 250 mlLB-Medium mit Zellen, die das Protein überexprimieren.
      Hinweis: Je nach Reinigungsverfahren kann die Bindungspuffer aus 100 mM Phosphatpuffer bestehen, pH 7,2 oder 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.
   5. Drehen, um die Zell-Lysats bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C.
   6. Reinige WSCP durch Affinitätschromatographie. Je nach dem Tag zu WSCP fusioniert, reinigen rekombinante Proteine ​​die geeignete im Handel erhältliche Affinitätschromatographie System zur Proteinreinigung folgende Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
   7. Zur Emulsionsherstellung Verwenden gereinigter WSCP in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,8. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Proteinmenge zur Rekonstitution verwendet wird, ist 0,5 bis 1,0 mg pro 1 ml Puffer.
2. Herstellung einer wässrigen Phase rohen Bakterienlysats mit WSCP enthält.
   1. Wachsen E.coli BL21 Zellen enthaltende Plasmid-exprimierenden WSCP in 250 ml LB - Medium bei 37 ° C bis zur OD 0,3-0,6.
   2. Induce Proteinexpression mit1 mM IPTG und Bakterien wachsen über Nacht bei 30 ° C.
   3. Erntebakterienzellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
   4. Auflösen des Pellets in 1-2 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,8, Sonikat (30 sec auf 15 sec ausgeschaltet, dreimal) und Zentrifuge bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C.
   5. Vorbereitung der wässrigen Phase der Emulsion von 0,125 ml Überstand Mischen mit 0,875 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,8.

4. Montage von WSCP mit Chl a in Emulsion

1. Transfer 5 ml Öl-Tensid-Mischung in einen Glaskolben und zu kühlen es auf Eis. Vor dem Pipettieren, sicherzustellen, dass alle Komponenten der organischen Phase werden gründlich gemischt, und es gibt keine Phasentrennung zwischen Tenside und Mineralöl.
2. 1 ml eiskaltem wässrige Phase hergestellt, wie in Abschnitt 3 bis 5 ml der organischen Phase.
3. Das Vermischen der beiden Phasen ein Gewebe-Homogenisator für 2 min bei 9.500 Umdrehungen pro Minute auf Eis verwenden.
4. Kritischste Schritt: Von diesem Zeitpunkt an, führen alle weiteren Schritte unter grünem Licht (520 nm), um Lichtschäden zu minimieren. In 20 ul 25 mM Chl eine Stammlösung zu der Emulsion (Abschnitt 1.13 sehen). Disperse durch Ausklopfen und Umkehren der Glasfläschchen. Stellen Sie sicher, dass die Chl gleichmäßig in der Emulsion verteilt wird.
5. Inkubieren Sie die Emulsion für 1-2 h auf Eis im Dunkeln.
6. Um die Emulsion und einem separaten Wassertröpfchen aus der organischen Phase übertragen, die Emulsion zu 1,5 ml Kunststoffröhrchen und Zentrifuge für 5 Minuten bei Raumtemperatur bei 14.000 xg abzubauen.
   Hinweis: Falls die Montage erfolgreich ist, sollte die untere wässrige Phase, die eine grüne Farbe haben.
7. Entsorgen Sie die obere Ölphase und 1 ml Mineralöl. Gut mischen das Mineralöl mit der pelle Emulsion durch Wirbel oder durch das Rohr gründlich Spiegeln. Spin down die Probe bei 14.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine klare Meniskus Abtrennen der wässrigen und Bergmannal Ölphasen, ohne Zwischen Emulsion erhalten.
8. Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Haube. Nachdem die wässrige und Mineralöl Phasen deutlich voneinander getrennt sind, Mineralöl zu entfernen, und 1 ml Wasser-gesättigtem Diethylether hinzu. Vortex und Spin der Probe bei 14.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur nach unten. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
9. die Diethylether Nach der zweiten Zentrifugation, zu entfernen und die Röhrchen für 5-20 min in der Haube offen lassen.
10. Schließlich laden die wässrige Phase , die die WSCP / Chl einen Komplex auf eine Entsalzungssäule und Eluieren mit Puffer geeignet für weitere Experimente enthält.
    Hinweis: Das Protein in Phosphat- und Tris-Puffer in einem breiten Bereich von pH-stabil ist, (6,0-7,5). Die Probe kann bis zu einem Monat vor Licht geschützt bei 4 ° C gelagert werden.

Ergebnisse

Rekombinante WSCP Apoproteine ​​wurden in W / O - Emulsionen gemäß dem Protokoll mit Chl a montiert in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Das Protokoll wurde unter Verwendung von wässrigen Phasen umgesetzt entweder reine WSCPs enthält, oder Lysaten von E. coli - Zellen überexprimieren WSCP (Abbildung 1). Das Protokoll ist einfach, schnell und erfordert keine spezielle Ausrüstung, außer einem Gewebe-Homogenisator.

Diskussion

Unser Ziel war es, ein neues allgemeines System für die Montage von wasserlöslichen Chlorophylls-bindende Proteine ​​mit hydrophoben Pigmente zu entwickeln. Hier wird gezeigt , dass das neue Rekonstitution System auf Basis von W / O - Emulsion ein allgemeiner Ansatz ist erwiesen , für die Montage von WSCP Apoproteine ​​von Rosenkohl, Blumenkohl, japanischer Meerrettich und Virginia pepperweed rekombinant in E. ausgedrückt arbeiten coli. Hier werden Ergebnisse aus der Rekonstitution von 1 mg...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification