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In diesem Artikel

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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Zusammenfassung

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Einleitung

Cardiac Tissue Engineering hat in den letzten zehn Jahren mit mehreren Gruppen Veröffentlichung der Ergebnisse der voll funktionsfähig, schlagen Gewebe aus beiden murine Kardiomyozyten 1-6 und in jüngster Zeit , die menschliche Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen 7-12 stark vorangetrieben . Das Herzgewebe Engineering - Bereich wird von zwei primären und im wesentlichen unabhängig Ziele angetrieben: 1) exogene Transplantate zu entwickeln , die in Ermangelung Herzen transplantiert werden kann , um die Funktion zu verbessern 4-6; und 2) In - vitro - Modelle zu entwickeln , für das Studium der Physiologie und Krankheit, oder als Screening - Tools für die therapeutische Entwicklung 2,7.

Dreidimensionale (3-D) Zellkultur als Basis für das nächste Generation Screening-Tools zu entwickeln, wie die 3-D-Matrix eine natürliche Herzmikroumgebung als herkömmliche 2-D-Monolayer-Zellkultur widerspiegelt; in der Tat sind einige Aspekte der Zellbiologie grundverschieden in 2-D vs. 3-D Kulturen 13,14 . Zusätzlich sind so konstruiert Herzgewebe von vollständig definierten Komponenten aufgebaut: einer extrazellulären Matrix und einer Zellpopulation. Für traditionelle engineered menschlichen Herzgewebe, während die extrazelluläre Matrix - Zusammensetzung ( in der Regel Fibrin 9 oder Kollagen 7,8,10) streng kontrolliert wird , wird die Eingangszelle Zusammensetzung weniger gut definiert, mit der gesamten Mischung von Zellen aus einer gerichteten Herzdifferenzierung entweder embryonale Stammzellen (ESC 7,9) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS 10,12) zu den Geweben aufgenommen werden. Abhängig von der spezifischen Zelllinie und die Effizienz der Differenzierung Protokoll verwendet, kann der resultierende Prozentsatz der Kardiomyozyten reichen von weniger als 25% auf über 90%, die spezifische cardiomyocyte Phänotyp (dh ventricular-, atrial- oder Schrittmacher-like) kann auch variieren, auch die nicht-Kardiomyozyten Fraktion 15,16 und verändern die Reife des differenzierten Herz m sehr heterogen seinyocytes 17.

Aktuelle Herzgewebe Engineering - Arbeiten wurde versucht , die Eingangs Population von Zellen zu steuern, entweder mit einem Herz-Reporter humanen embryonalen Stammzelllinie 8 oder Zelloberflächenmarker 18 verwendet wird , um die Kardiomyozyten - Komponente der Differenzierung zu isolieren. Während zunächst ein Gewebe von nur Kardiomyozyten bestehen würde die ideal zu sein scheinen, ist dies in der Tat nicht der Fall; zusammengesetzt hECTs nicht nur aus Kardiomyozyten in funktionelle Gewebe zu verdichten, wobei einige Gruppen ein 3 zu finden: 1 - Verhältnis von Kardiomyozyten: Fibroblasten 8 die höchste Zuckungskraftmessungen erzeugen. verschiedene Zellselektionsmethoden, einschließlich Oberflächenmarker für lebende Zellsortierung durch Verwendung ist es möglich, hECTs mit definierten Zellpopulationen zu schaffen. Während der Marker nicht-kardialen Stromazellen seit einiger Zeit zur Verfügung haben, wie beispielsweise die putative Fibroblasten - Marker CD90 19,20, Oberflächenmarker von kardialen Myozyten waren schwierigerzu identifizieren. SIRPα gehörte zu den ersten Marker Herzoberfläche für den menschlichen Kardiomyozyten identifiziert 18 und wurde für die Herz-Linie sehr selektiv erwiesen. Vor kurzem haben wir festgestellt , dass zwei Sortieranlage für SIRPα + und CD90 - -Zellen nahezu reinen Kardiomyozyten mit der CD90 + -Population ergibt einen Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp (Josowitz, nicht veröffentlichte Beobachtungen) aufweist. Auf der Basis dieser gesammelten Erkenntnisse, berichten hier schaffen wir hECTs unter Verwendung eines 3: 1 - Kombination von SIRPα + / CD90 - Kardiomyozyten und CD90 + Fibroblasten.

Die Fähigkeit, eine vollständig definierte menschliche Herzgewebe zu konstruieren ist nicht nur für robuste Screening-Tools zu schaffen, sondern auch für die Entwicklung von Modellsystemen Schwellen zell- und Gen-basierten Herztherapien zu untersuchen. Insbesondere zahlreiche Zelltherapien für Herzversagen, unter Verwendung von Zelltypen , einschließlich mesenchymalen Stammzellen (MSC) 21 , Herz-Stammzellen 22 und Knochenmark mononukleären Zellen 23-25, wurden in klinischen Studien getestet. Während viele der ersten Ergebnisse haben 21,23,25 waren vielversprechend, verringert sich die anfängliche Nutzen oft im Laufe der Zeit von 26 bis 29. Ein ähnlicher Trend wurde in murine engineered Herzgewebe berichtet worden, die durch MSC - Supplementierung einen signifikanten funktionellen Nutzen anzuzeigen, der Vorteil wird jedoch nicht während einer Langzeitkultur 1 aufrechterhalten. die suboptimale Leistung Basiswert ist unser begrenztes Wissen über die Mechanismen, Zelltherapien regeln. Ein tieferes Verständnis davon, wie therapeutischen Zellen ihre positiven Einfluss ausüben, sowie mögliche negative Auswirkungen von myocyte-nonmyocyte Wechselwirkungen, würde die Entwicklung verbesserter Therapien ermöglichen klinisch signifikante und anhaltende Vorteile, mit minimalen Nebenwirkungen bei Patienten mit Herzinsuffizienz führt.

Hier beschreiben wir die Verwendung von definierten hECTs zu interrogate Mechanismen der zellbasierte Therapie. Die gesteuerte Gewebezusammensetzung ist wichtig, spezifische Faktoren zu identifizieren, Kardiomyozyten Leistung zu beeinträchtigen. Direkt hECTs mit dem therapeutischen Zelltyp von Interesse (zB MSCs) ergänzt werden , können die Auswirkungen auf die Kardiomyozyten - Leistung zeigen, wie wir in der Ratte ECTs 1 unter Beweis gestellt haben.

Die folgenden Mehrschritt-Protokoll beginnt mit gerichtetem kardiale Stammzelldifferenzierung, gefolgt von der Herstellung des Mehr Gewebe-Bioreaktor, und mit einer Beschreibung der Gewebekonstruktion und funktionelle Analyse abzuschließen. Unsere Experimente ausgeführt, um die NIH-zugelassenen H7 mit humanen embryonalen Stammzellen (hES) Zeile. Allerdings haben die folgenden Protokolle auch eine zusätzliche hESC Linie und drei induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien mit ähnlichen Ergebnissen getestet werden. Wir haben herausgefunden, dass die Effizienz in Kardiomyozytendifferenzierung und Erfolg in Hect Herstellungszelllinie abhängig sein kann, vor allem for hiPSC Linien von einzelnen Patienten abgeleitet. Durch Anschluss an dieses Protokoll, zwei 6-Well-Platten sind mit insgesamt 1,68 Millionen hESCs (140.000 Zellen pro Vertiefung) plattiert, die etwa 2,5 Millionen Myozyten nach Differenzierung für 20 Tage ergibt und Sortieren, genug sechs definierte Gewebe zu machen.

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Protokoll

Hinweis: Führen Sie alle Zellmanipulationen unter aseptischen Bedingungen einen HEPA-gefilterte Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit und alle Lösungen zu sterilisieren, indem sie durch einen 0,2 um Filter gefiltert wird. Führen Gewebekonstruktion und Funktionstests in entweder denselben oder aseptischen Bedingungen einer laminaren Strömungshaube.

1. Seeding von H7 hESCs in Vorbereitung auf die Herzdifferenzierung

  1. (Tag 1) Vorbereiten der Basalmembranmatrix
    1. Auftauen 150 ul aliquote Menge von hESC qualifizierte Basalmembranmatrix auf Eis über Nacht bei 4 ° C.
  2. (Tag 0-4) Beschichtung von hES auf beschichteten Platten
    1. Verdünnen Sie die aufgetauten Matrix in 12 ml eiskaltem DMEM / F12 und gut mischen.
    2. 1 ml des DMEM / F12-Matrix-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekultur-behandelte Schale. Jedes Aliquot der Matrix kann coat zwei 6-Well-Platten.
    3. Inkubieren der beschichteten Platten bei Raumtemperatur für mindestens 1 Std.
      Hinweis:Unserer Erfahrung beschichteten Schalen mit Paraffin versiegelt kann für bis zu 10 Tage vor der Verwendung bei 4 ° C in Matrixlösung gelagert werden.
    4. Bei ca. 75% Konfluenz distanzieren die H7 hESCs von der 10-cm-Schale mit 6 ml der nicht-enzymatische Dissoziation Reagenz. Nach 5 min, kratzen sanft die Zellen von der Kulturoberfläche eine Wegwerfzellschaber und übertragen die Zellsuspension in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen verwendet.
    5. Entfernen Sie 0,5 ml der Dissoziation Lösung mit den Zellen aus dem 15-ml-Tube und in ein neues steriles 15-ml-Röhrchen (Abfahrt 5,5 ml der Dissoziation Reagenz, um die hESCs distanziere) für Stammzelllinie Ausbreitung.
    6. Pellet die 0,5 ml Zellen bei 300 xg für 5 min bei 20 ° C. Entfernen Sie den Überstand und vorsichtig resuspendieren in 8 ml pluripotente Stammzellmedium , das 1% Penicillin-Streptomycin übertragen dann auf eine neue, überzogen, 10 cm Gewebekulturschale und aufrechtzuerhalten 37 ° C und 5% CO 2 , um die Stammzelllinie beibehalten.
      Hinweis: Bewahren Sie pluripotente Stammzellmedien auf Eis während der Medienwechsel.
    7. Inzwischen fügen 5,5 ul 10 mM ROCK-Inhibitor Y-27632 auf den verbleibenden 5,5 ml der Dissoziationslösung und weiter bei Raumtemperatur für weitere 5-10 min inkubiert. Vorsichtig mischen die Zellen mit einem 5 ml serologische Pipette. Weiter zu brüten, bis eine Einzelzellsuspension erreicht wird, dann die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur bei 300 g pelletieren.
    8. Resuspendieren der Zellen in 5 ml von pluripotenten Stammzellmedien und führen eine Hämozytometer einer Zellzahl verwendet.
    9. Samen jeder Vertiefung der 6-Well-Platte bei einer Dichte von 140.000 Zellen pro Vertiefung. Samen zwei Platten mit 6 Vertiefungen insgesamt sechs definierten Geweben zu schaffen. Entsorgen Sie alle verbleibenden Zellen nach der Plattierung.
    10. Füllen Sie die gut zu 1 ml mit pluripotenten Stammzellmedien und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2. Vierundzwanzig Stunden später, entfernen Sie die Medien und 2 ml frisches Medium pluripotente Stammzelle hinzufügen zu jeder Vertiefung (Abbildung 1A ).
    11. Schauen Sie sich die Mündung der jeden Tag Platten und beginnen , die Differenzierung , sobald die Zellen erreichen etwa 75% Konfluenz (1B - D).

2. (Tag 4-24) Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen zu Kardiomyozyten 30,31

  1. (Tag 4-7, Differenzierung Tag 0-3) Mesoderm Induction
    1. Bereiten RPMI Differenzierungsmedium I (Tabelle 1) durch die Kombination von 500 ml RPMI 1640 mit 10 ml B27 Supplement (ohne Insulin) und 5 ml Penicillin-Streptomycin - Stammlösung (10.000 IU / ml Penicillin; 10.000 & mgr; g / ml Streptomycin). Aliquot auf Eis in 50-ml-Röhrchen und lagern bei 4 ° C.
    2. (Tag 4, Differenzierung Tag 0) Bereiten Sie Mesoderm Induktionsmedien um 2,4 ul des kleinen Moleküls GSK3-Inhibitor CHIR99021 Zugabe (10 mM Lager, 6 & mgr; M Endkonzentration) zu 12 ml RPMI Differenzierung Medien I. aus jeder Vertiefung pluripotente Stammzellmedien entfernen einnd ersetzen mit 2 ml der Mesoderm Induktionsmedien pro Vertiefung. Bringen Sie die Platte in den Inkubator.
      Anmerkung: Signifikante Zelltod typischerweise mit der Zugabe von CHIR99021 (1E) auftritt. Die Monoschicht wird sich erholen, aber es ist wichtig, dass die toten Zellen entfernt mit dem DMEM / F12 Spülung zu spülen.
    3. (Tag 5, Differenzierung Tag 1) Bereiten Sie frische Mesoderm Induktionsmedien wie oben beschrieben. Entfernen Sie die alten Medien aus jeder Vertiefung und spülen Sie einmal mit 1 ml DMEM / F12 pro Vertiefung. 2 ml frisch Mesoderm Induktionsmedien in jede Vertiefung.
      Hinweis: Spülen Sie jeden Tag von Tag 0-10 stark erhöht Ausbeute und Reinheit der Kardiomyozyten.
    4. (Tag 6, Differenzierung Tag 2) Entfernen Sie die Herz-Induktionsmedien und spülen Sie einmal mit 1 ml DMEM / F12 pro Vertiefung. Ersetzen Sie die Spülung mit 2 ml RPMI Differenzierung Medien I (keine kleinen Moleküle zugegeben, aber immer noch mit der B27 (ohne Insulin) zu ergänzen) und zurück in den Inkubator.
  2. (Tag 7-13, Differenzierung Day 3-10) Cardiac Mesoderm Induction
    1. (Tag 7, Differenzierung Tag 3) Bereiten Sie Herz-Mesoderm Induktionsmedien durch Zugabe von 6 ul des kleinen Moleküls Wnt-Inhibitor IWR-1 (10 mM Lager, 5 uM final) zu 12 ml RPMI Differenzierung Medien I.
    2. Entfernen Sie die Medien aus jeder Vertiefung gründlich einmal mit 1 ml DMEM / F12 pro Vertiefung und ersetzen mit 2 ml Herz-Mesoderm Induktionsmedien pro Vertiefung.
    3. (Tag 8, Differenzierung Tag 4) Bereiten Sie weitere 12 ml Herz-Mesoderm Induktionsmedien wie oben beschrieben. Entfernen Sie die Medien am Tag vor, spülen Sie einmal mit 1 ml DMEM / F12 pro Vertiefung und ersetzen mit 2 ml frischem Herz Mesoderm Differenzierung Medien pro Vertiefung und zurück in den Inkubator gegeben.
    4. (Tag 9-10, Differenzierung Tag 5-6) an beiden Tagen, entfernen Sie die Herz Mesoderm Induktionsmedien und spülen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DMEM / F12.
    5. 2 ml frischem RPMI Differenzierung Medien I (keine kleinen Moleküle zugegeben, aber immer noch mit der B27 (ohne Insulin) zu ergänzen)zu jeder Vertiefung und zurück in den Inkubator der Platte.
  3. (Tag 11-24, Differenzierung Tag 7-20) hES-abgeleitete Kardiomyozyten-Organisation / Ausreifung
    1. Bereiten Sie die RPMI Differenzierung Medien II (Tabelle 1) durch die Kombination von 500 ml RPMI 1640 mit 10 ml B27 - Ergänzung (mit Insulin) und 5 ml Penicillin-Streptomycin - Stammlösung. Aliquot auf Eis in 50-ml-Röhrchen und lagern bei 4 ° C.
    2. (Tag 11, Differenzierung Tag 7) Entfernen Sie RPMI Differenzierung Medien (ohne Insulin) aus jeder Vertiefung und spülen mit 1 ml DMEM / F12. Ersetzen mit 2 ml des neuen RPMI Differenzierung Medien II (mit Insulin) in jede Vertiefung und zurück in den Inkubator.
      Hinweis: Die spontane Schlagen sollte zunächst zwischen den Tagen 7 und 10 beobachtet werden, wenn Schläge während dieser Zeit nicht beobachtet wird, es in der Regel schlechte Differenzierung Effizienz angibt. Das Protokoll kann bis zum Tag 15 in dem Bemühen fortgesetzt werden Schläge zu beobachten, aber wenn keine Schläge für Tag beobachtet 15 ist es am besten zu stKunst eine neue Differenzierung.
    3. (Tag 12-24, Differenzierung Tag 8-20) Jeden Tag, entfernen Sie die alte Differenzierung Medien und ersetzen mit 2 ml frischem RPMI Differenzierung Medien II pro Well Zellreifung und Organisation der Schläge einschichtigen (1F, Video 1 zu ermöglichen , ).
      Hinweis: Je nach dem Rest Zelltod kann es erforderlich sein, mit 1 ml DMEM / F12 durch Differenzierung Tag 10 zu spülen.

3. (Tag 24, Differenzierung Tag 20) Isolierung von Herzmuskelzellen und Fibroblasten-ähnliche Zellen

  1. Dissoziieren Zellen aus der Monoschicht
    1. Entfernen Differenzierung Medien und spülen Sie einmal mit 1 ml PBS.
    2. Dissoziieren die Monoschichten mit 1 ml der enzymatischen Dissoziation Lösung (0,04% Trypsin / 0,03% EDTA) zu jeder Vertiefung.
    3. Bewegen Sie Platte in Inkubator für 10 min. Inzwischen fügen Sie 12 ul ROCK-Inhibitor bis 6 ml Trypsin Neutralisierungslösung.
    4. Gently 1 ml der Trypsin Neutralisierungslösung die ROCK-Inhibitor in jede Vertiefung der Platte mit dem Trypsin-Lösung zu neutralisieren.
    5. Mit einer sterilen Transferpipette, die jeweils sanft gut mischen die Zellhaufen auseinander zu brechen.
    6. Übertragen Sie alle 12 ml der 6-Well-Platte in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
      Hinweis: Da zwei Platten mit 6 Vertiefungen in diesem Protokoll verwendet werden, werden zwei 15-ml-Röhrchen benötigt werden.
    7. Transfer 3 ml PBS zu einer Vertiefung der Platte, und übertragen dann nacheinander die gleichen 3 ml zu jeder nachfolgenden auch alle restlichen Zellen in der Schale zu sammeln. Übertragen Sie die restlichen 3 ml aus dem letzten gut in die gleiche 15 ml Zentrifugenröhrchen, die Zellen enthält.
    8. Pellet bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
  2. Vorbereitung der Zellen für Live Cell Sorting durch FACS
    1. Bereiten Sie die Färbepuffer durch Zugabe von 5 ml Fetal Bovine Serum auf 45 ml PBS auf Eis mit 50 & mgr; l von ROCK-Inhibitor.
    2. Entfernen Sie den Überstand aus der Zelle pellassen (in 3.1.8) und resuspendieren in 1,2 ml Färbepuffer.
    3. Übertragung von 200 & mgr; l der Zellsuspension auf eine neue, vorgekühlte 50 ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Dies wird die negative Färbung Kontrolle.
    4. Übertragen die restlichen 1 ml der Zellsuspension auf eine neue, vorgekühlte 50 ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis und mit 2 & mgr; l SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 Verdünnung) und 4 ul CD90-FITC (1: 250 Verdünnung) . Vorsichtig mischen die Zellsuspension mit einer Transferpipette und zurück auf das Eis.
    5. Inkubieren sowohl der negativen Kontrolle und der Probe, auf einer Wippe shaker auf Eis bei 4 ° C für 1 Stunde.
    6. Präparieren Probensammelröhrchen durch Zugabe von 3 ml RPMI-Medium (mit Insulin) mit zwei 15 ml-Zentrifugenröhrchen. In 3 ul ROCK-Inhibitor in jedes Röhrchen und lagern auf dem Eis.
    7. Pellet die gefärbten Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und spülen Sie zweimal mit mindestens 10 ml eiskaltem PBS pro Spülung.
    8. 1 & mgr; l DAPI (1 ug / ml) zu 5 ml Färbepuffer. Sanftresuspendieren Probepellet mit 1-3 ml des DAPI haltigen Färbepuffers einen Transfer-Pipette.
    9. Hinzufügen, 500 & mgr; l Färbepuffer (ohne DAPI hinzugefügt) zu der Negativkontrolle.
    10. Filter vorsichtig sowohl die negative Kontrolle und Probe durch ein 40 & mgr; m Zellsieb Zellklumpen zu entfernen und übertragen FACS-Röhrchen auf Eis zu Polystyrol. Unmittelbar bringen Proben der Zellsortierer.
    11. Ähnlich wie bei etablierten Lebendzellsortierverfahren 18, verwenden Sie die negative Kontrolle , die Tore zu setzen, wählen Sie für lebende Zellen (DAPI negativ) und sammeln sowohl die FITC + (dh CD90 + Fibroblasten) und PE / Cy7 + (dh SIRPα + Kardiomyozyten ) Populationen unabhängig bei 20 psi (Abbildung 2).
      Hinweis: Nachdem die Tore Einstellung kann die negative Kontrolle in 4% PFA fixiert werden, um die Differenzierung Effizienz bestimmen, indem für die kardiale Troponin-T-Färbung.
      Hinweis: Einige Forscher bevorzugen eine zu verwendenIsotyp-Kontrolle statt ungefärbten Kontrolle, die Tore zu setzen, um für nicht-spezifische Antikörperbindung zu kompensieren. Eine so genannte Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrolle ist eine weitere Möglichkeit. Aufgrund der klaren bimodale Verteilung des FITC, DAPI und PE-Cy7 Signale, gated wir von der positiven Bevölkerung, konservativ weit in die positive Tor, das möglicherweise schließt einige echte positive, sondern hilft keine Fehlalarme zu minimieren Ziel.
  3. Zell reaggregation in Vorbereitung für Tissue Engineering
    1. Nach der Zellsortier, Pellet- beide Sammelröhrchen und Resuspendieren in 1 ml DMEM 10% Neugeborenen-Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 0,2% Amphotericin B ( "NBS media").
    2. Rekombinieren die SIRPα + und CD90 + Zellen in einem Verhältnis 3: 1 und die Platte der kombinierten Zellen in einem nicht-Gewebekultur behandelt Petrischale mit einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro 60 cm 2 (10 - cm - Schale). 10 ml NBS Medien und 101; l ROCK-Inhibitor Y-27632.
    3. Legen Zellsuspension in der Gewebekultur-Inkubator 48 Stunden Zelle reaggregation in kleine Cluster zu ermöglichen.

4. Human Cardiac Tissue Engineering

  1. Fabrizieren des Multi-Gewebe Bioreactor
    Hinweis: Um die Abbildungen in 3A, CAD - Dateien mit detaillierten Bioreaktor Design Pläne ergänzen sind auf Anfrage bei den Autoren.
    1. Maschine der PDMS-Vorlagenform durch Bohren von sechs gleichmäßig beabstandeten Löchern von 0,5 mm Durchmesser in eine 9 x 33 x 3,25 mm Quaders aus Polytetrafluorethylen.
    2. Unter Verwendung eines Schaftfräsers, Maschine mit einem Rahmen aus Polysulfon den Maßen 25 x 35 x 11 mm 3. Der Zweck des Rahmens ist, die PDMS-Beiträge zu halten (aus der obigen Guss konstruiert) in Ausrichtung mit den Vertiefungen in der Grundplatte.
    3. Verwendung einer 1-mm endmill, Maschine 6 Vertiefungen (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm voneinander entfernt in einen 20 x 40 x 5 mm 3 Stück schwarzes polyTetrafluorethylen die Grundplatte zu bilden.
    4. Mischen Sie die elastomere Base und Härter für Polydimethylsiloxan (PDMS) in einem 10: 1 w / w-Verhältnis und zu der benutzerdefinierten Polytetrafluorethylen Form (Schritt 4.1.1) zwei Reihen von sechs Kraftmess Beiträge zu erstellen, und Inkubation über Nacht und unter Vakuum bei 80 ° C. Nach dem Aushärten sanft die PDMS aus der Master-Form zu entfernen und markieren Sie sorgfältig die Spitzen jeder Säule mit einem schwarzen Permanent-Marker für verbesserten Kontrast und automatisierte Echtzeit-Tracking Post Ablenkung.
      Hinweis: Polytetrafluorethylene ziemlich weich ist und leicht beschädigt werden können. Seien Sie vorsichtig, wenn die Master-Form vor der Reinigung des Gießens PDMS Langlebigkeit des Systems und konsistente PDMS Post Geometrie zu gewährleisten. Ein 0,5-mm-Draht kann verwendet werden, um die Löcher für die Pfosten nach jedem Gebrauch gereinigt werden, aber darauf achten, das Innere der Löcher nicht kratzen.
      Hinweis: Eine Alternative ist zum Entgasen der PDMS unter Vakuum für mehrere Stunden bei Raumtemperatur, dann lassen Sie die Mischung Heilung bei Umgebungsdruck.Dies kann zu weniger Restgasblasenbildung in den PDMS während des Härtungsprozesses führen.
    5. Sterilisieren alle Komponenten in einem Dampfautoklaven.
      Hinweis: Die PDMS Masterform (Schritt 4.1.1) und Polysulfon Rahmen (Schritt 4.1.2) sind beide wieder verwendbar. Die PDMS-Beiträge von der Besetzung (Schritt 4.1.4) erstellt ist auch wiederverwendbar, aber nur für ca. 10 Anwendungen. Es können jedoch mehr PDMS Stellen geschaffen werden, wie die Masterform benötigt werden.
  2. Sammeln Sie neu zusammengefügt Herzzellen
    1. Entfernen Sie die neu zusammengefügt Zellen aus dem Inkubator und übertragen alle 10 ml des reaggregation Medien zu einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen.
    2. Spülen Sie die Platte mit 3 ml PBS und übertragen die Spülung auf den gleichen 50 ml Zentrifugenröhrchen, enthaltend das reaggregation Medien.
    3. 3 ml 0,04% Trypsin / 0,03% EDTA auf die 10 cm-Schale und zurück zum Inkubator für 5 min.
    4. Nach 5 min untersuchen bei 10-facher Vergrößerung, die Platte mit einer invertierten Verbindung Mikroskop komplette Zelle dissocia, um sicherzustellen,tion von der Schale. Wenn einige Rest Cluster noch gebunden sind, leicht bewegen die Platte die Klumpen zu lösen. Wenn die Cluster verbunden bleiben, kehren in den Inkubator für eine weitere 2-3 min. Sie brüten nicht länger als zehn Minuten oder signifikante Zelltod auftreten können.
    5. Sobald alle Zellen abgelöst, 3 ml Trypsin Neutralisierungslösung. Vorsichtig mischen die Neutralisierungslösung mit dem Trypsin-Zell-Lösung und Transfer in die 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das die reaggregation Medien und spülen Sie einmal mit PBS.
    6. Spülen Sie die gesamte Schale mit 5 ml PBS und übertragen auf den gleichen 50-ml-Röhrchen mit den Zellen.
    7. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 · g für 5 min bei Raumtemperatur.
    8. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 1 ml NBS Medien übertragen, dann in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    9. Pellet bei 300 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Die Herzzellen (CD90 + Stromazellen und SIRPα + MYOCytes) sind jetzt für die Gewebekonstruktion bereit.
  3. (Optional) sammeln Supplemental Zellen von Interesse
    Hinweis: Zusätzlich zu den definierten Geweben , die nur SIRPα + Kardiomyozyten und CD90 + Fibroblasten-ähnliche Zellen, ist es möglich, zusätzliche Zellen von Interesse hinzufügen , um ihre Wirkung auf die Gewebefunktion zu befragen. Beispielsweise Ratten - MSCs wurden 1 die Funktion von Ratten - engineered Herzgewebe gezeigt , zu verbessern. Die folgenden optionalen Schritt wird die Sammlung von zusätzlichen Zellen für das definierte System.
    1. Sammeln Sie die zusätzlichen Zelltyp von Interesse (zB mesenchymale Stammzellen) unter Verwendung von 0,25% Trypsin / 0,1% EDTA.
    2. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 · g für 5 min bei Raumtemperatur, dann Resuspendieren in 5 ml einer geeigneten Zellkulturmedien für den Zelltyp von Interesse. Zum Beispiel für MSCs verwenden DMEM mit 20% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 0,2% Amphotericin-B zur Kultur der cells.
    3. Durchführen einer Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers, dann die Zellen pelletieren wieder bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
    4. Entfernen des Überstands, Resuspendieren in 1 ml Zellkulturmedium und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    5. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 · g für 5 min bei Raumtemperatur.
    6. Entfernen Sie den Überstand. Die zusätzlichen Zellen sind nun bereit für die Gewebekonstruktion.
      Hinweis: Wenn der zusätzliche Zellen bei einer Konzentration von 10% der Gesamtzellzahl in dem Gewebe hinzugefügt werden, dann für die definierten Geweben, diese 50.000 zusätzliche Zellen pro Gewebe erfordern , da jedes Gewebe 500.000 Herzzellen enthält (beide CD90 + Stromazellen und SIRPα + Myozyten).
  4. Erstellen Sie die Menschen Engineered Herzgewebe
    Hinweis: Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis und die Zellen bei Raumtemperatur. Alle Bände unten aufgeführt sind pro Gewebe. Typischerweise können etwa sechs Gewebe konstruiert werden aus zwei 6-Well-plAtes von Herz Differenzierungen.
    1. Verdünnte 60,0 ul der 5 mg / ml Kollagen Lager zu 3,125 mg / ml mit 1,5 ul 1 M NaOH, 9,6 ul 10 fach PBS und 24,9 ul sterilem ultrareinem deionisiertem Wasser.
      Critical Schritt: Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen zu jeder Lösung während der Herstellung als Luftblasen richtigen Gewebebildung stören wird.
    2. Hinzufügen, 12.0 & mgr; l sowohl von 10x MEM und 0,2 N HEPES pH 9 zu dem verdünnten Kollagenmischung das Kollagen Mischung zu schaffen. Both Lösungen auf der Seite des 15 ml-Zentrifugenröhrchen, um die Einführung von Luftblasen in die Kollagenmischung zu vermeiden.
    3. Fügen Sie die Basalmembranmatrix bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,9 mg / ml an das Kollagen-Mix und auf Eis halten das endgültige Gewebe-Mix zu erstellen. Die Endkonzentration an Kollagen sollte 2 mg / ml sein.
    4. Hinzufügen 500,000 der neu zusammengefügt Zellen an der Gewebemischung (Myozyten + Fibroblastenkonzentration 20 Millionen / ml) und fülle auf ein Endvolumen von 25 & mgr; l proGewebe entweder mit zellfreien NBS Medien oder 50.000 Zellen der zusätzlichen Zelltyp von Interesse (zB hMSCs) und gut mischen eine gleichmäßige Zellsuspension zu bilden.
      Anmerkung: Die Anzahl der Zellen ergänzt werden aus für verschiedene Anwendungen variieren. Hier 10% Supplementierung verwendet wird.
    5. Mit Sorgfalt, pipettieren 25 ul der Zellsuspension in jede der sechs Bohrungen in den Bioreaktor Grundplatte, ohne die Einführung von Luftblasen in das Bohrloch.
    6. Schieben Sie zwei Reihen der PDMS-Kraftsensoren auf beiden Seiten des Polysulfon-Rahmen, 6 bilden Paare von gegenüberliegenden Pfosten, invertieren dann den Rahmen auf der Oberseite der Grundplatte, so dass ein Paar Pfosten jeder tritt auch mit dem Zellsuspension.
      Hinweis: Das Polysulfon Rahmenansätze in Ausrichtung der PDMS zu unterstützen, umfasst.
    7. Sorgfältig den Bioreaktor zu platzieren, die Grundplatte nach unten, in eine 60-mm-Schale, dann die Schale innerhalb einer 10-cm-Schale ohne Deckel legen, legen Sie die 10 cm Abdeckung auf der Oberseite, und bewegen Montage des gesamten BioreaktorsDem Kultur Inkubator Gewebe, wartet zwei Stunden auf dem Gewebe zu gelieren.
    8. Nach 2 Stunden, in den Bioreaktor aus dem Inkubator entfernen und 14 ml NBS Medien auf die gesamte Baugruppe, ausreichend zur Deckung der Grundplatte hinzuzufügen. Zurück in den Inkubator, und ändern Sie die Hälfte der täglich Medien.
    9. Achtundvierzig Stunden später, vorsichtig die Bodenplatte entfernen, indem Sie sanft auf jeder Seite der Grundplatte aus dem Rahmen ein paar Millimeter zu einem Zeitpunkt, zu bewegen, um die Medien zu ändern, kehren dann in den Bioreaktor, Gewebe nach unten, zu den Medien.
    10. Weiter Hälfte der NBS Kulturmedien ändert jeden Tag.
      Hinweis: Spontane Kontraktionen des Gewebes kann bereits 3 Tage nach der Gewebekonstruktion beobachtet werden, meßbar twitch Kräfte zu erzeugen bereits Tag 5 bis 7.

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Ergebnisse

Kardiomyozyten, eine leicht modifizierte Version der Boheler und Lian Differenzierung Methoden 30,31 verwendet zu erhalten. Es ist zwingend notwendig, dass die Differenzierung beginnt, während der log-Phase des Zellwachstums, aber auch, dass die Ausgangspopulation ausreichend konfluenten eine brauchbare Anzahl von Zellen nach dem Sortieren (ca. 75% ist optimal) zu erhalten. Typischerweise für H7 hESCs, in wesentlicher 8 Medien und 5% CO 2 -Inkubator pro Well einer 6-Well - Platte bei einer Dichte...

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Diskussion

Der Bau der definierten menschlichen engineered Herzgewebe (Hect) können bieten eine konsistente und zuverlässige Modell der menschlichen Kardiomyozyten-Funktion. Critically alle zellulären und extrazellulären Komponenten im System sind bekannt und können nach Wunsch manipuliert werden, wodurch die confounding Einfluss anderer Zelltypen unbekannten Entfernung von dem Differenzierungsprozess resultieren. Um einen schnellen Zellwachstum und hohe Ausbeute auszubalancieren, ist es bevorzugt, dass die Differenzierung be...

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Offenlegungen

The authors declare that they have no competing financial interests.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die NIH (1F30HL118923-01A1) zu TJC, NIH / NHLBI PEN Vertrag HHSN268201000045C auf KDC, das Forschungsstipendium Rat von Hong Kong TRS T13-706 / 11 unterstützt (KDC), NIH (R01 HL113499) zu BDG, die amerikanische heart Association (12PRE12060254) zu RJ und Research Grant Council of HKSAR (TBR, T13-706 / 11) zusätzliche Mittel zu RL wurde TJC von NIH DRB 5T32GM008553-18 zur Verfügung gestellt und als Praktikum auf NIDCR-Interdisziplinäre Ausbildung in Systeme und Entwicklungs Biologie und Geburtsfehler T32HD075735. Die Autoren möchten auch dankbar Arthur Autz an der Zahn Zentrum der City College of New York für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Bioreaktors und Mamdouh Eldaly für die technische Unterstützung anerkennen. Wir danken auch Dr. Kenneth Boheler für die Beratung über Herz-Differenzierung und Dr. Joshua Hare für humanen mesenchymalen Stammzellen großzügig bereitstellt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell CultureCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with InsulinLife Technologies17505055
B27 without InsulinLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Human Embryonic Stem CellsWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning354277Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf SerumLife Technologies16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation ReagentStem Cell Technologies7174
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)Stemgent04-0012Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell SortingCompanyCatalog NumberComments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) PromoCellC-41200
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Tissue ConstructionCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin/0.1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOptional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS PacketsSigma-AldrichP3813
Collagen, Bovine Type ILife TechnologiesA10644-01Keep on ice
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High GlucoseSigma-AldrichD5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodium HEPESSigma-AldrichH3784
Sodium HydroxideSigma-Aldrich221465
MaterialsCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml microcentrifuge tubesFisher ScientificNC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom TubeCorning352235With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plateCorning353046
Cell Scraper, DisposableBiologix70-2180
PolysulfoneMcMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)McMaster-Carr
EquipmentCompanyCatalog NumberComments
Dissecting MicroscopeOlympusSZ-61Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing SystemAstro-Med, IncGrass S88X Stimulator
High Speed CameraPixelinkPL-B741UOr similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature ControlUsed to maintain media temperature during data acqusition.
Custom MaterialsCompanyCatalog NumberComments
LabView Post-tracking Programavailable upon request from the authors

Referenzen

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