Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine schnelle, molekülbasierten Influenza A und B-Assay. Die Influenza-Test weist jedes Ziel innerhalb von 15 Minuten durch den Einsatz von isothermen Amplifikation mit Influenza-spezifischen Primer durch Zielerfassung mit molekularen Signalsonden gefolgt. Das Influenza-A-und B-Test ist benutzerfreundlich und benötigt minimale Hands-on-Zeit auszuführen.

Zusammenfassung

Influenza ist eine ansteckende durch Influenzaviren A und B in Menschen verursacht respiratorische Erkrankung und verursacht eine erhebliche Menge an Morbidität und Mortalität jedes Jahr. Das Influenza-A-und B-Test war der erste CLIA-verzichtet Molekular schnelle Grippe-Test zur Verfügung. Die Influenza A- und B-Test funktioniert durch Verwendung isothermen Amplifikation mit Influenza-spezifischen Primern durch die Zielerfassung mit molecular beacon Sonden folgten. Hier wird die Leistung des Influenza-A-und B-Test auf gefrorenen archivierten Nasen-Rachen-Abstrich (NPS) Proben in Virustransportmedium (VTM) gespeichert wurden einem Atem Panel-Untersuchung verglichen.

Die Leistung des Influenza A- und B-Assay wurde durch Vergleich der Ergebnisse der Atemtafel Referenzmethode bewertet. Die Empfindlichkeit für die gesamte Influenza-Virus A betrug 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5) und eine Spezifität von 86,9% (CI, 71,0 bis 100). Für B-Tests Influenza-Virus, die Sensitivität und Spezifität waren 90,2% (CI, 68,5 bis 100) Und 98,8% (CI, 68,5 bis 100), respectively.

Dieses System hat den Vorteil einer erheblich kürzeren Prüfzeit als alle anderen derzeit verfügbaren molekularen Assays und der einfachen, Pipettenfreien Verfahren läuft auf einer voll integrierten, geschlossenen, mit kleinem Platzbedarf System. Insgesamt hat das Influenza-A-und B-Test in dieser Studie untersuchte das Potenzial als Point-of-Care schnelle Influenza diagnostischen Test zu dienen.

Einleitung

Influenza - Virusinfektionen führen zu einer signifikanten Menge von Morbidität und Mortalität jedes Jahr ^{1, 2, 3.} Unkompliziert Influenza wird durch Verfassungs- und respiratorische Symptome wie Fieber, Muskelschmerzen, Kopfschmerzen, und nicht produktiven Husten ^{4, 5} aus. Ältere Menschen, Kleinkinder, immungeschwächten Patienten und Patienten mit zugrunde liegenden Komorbiditäten sind zu einem höheren Risiko für schwere Komplikationen wie Lungenentzündung, Myokarditis, Zentralnervensystem - Krankheit oder Tod ^{6, 7.}

Influenza - Infektion ist einzigartig von anderen respiratorischen Viren in diesem Prompt Verabreichung von antiviralen Therapie innerhalb von 48 Stunden nach Einsetzen der Symptome kann die Schwere der Erkrankung und der Länge ⁸ zu reduzieren. Schnelle Identifikation von Influenza auch gewesen^{9, 10} gezeigt , die Verwendung von Antibiotika unnötig zu verringern. Ferner hospitalisierten Patienten mit Influenza-Infektionen müssen in isolierten Räumen mit entsprechenden Infektionsschutzmaßnahmen gesetzt werden. Jedoch durch nicht-Influenzaviren verursacht Atemwegserkrankungen kann schwierig sein, klinisch von Influenza unterscheiden. Aus diesem Grunde ist eine schnelle und genaue diagnostische Tests für Influenza sehr wichtig für die klinische Behandlung der Patienten.

Mehrere Tests sind für den Nachweis und die Identifizierung von Influenza-Viren zur Verfügung. Schnelle Influenza - Antigen - Nachweistests (RIDTs) sind weit verbreitet in der klinischen Praxis als Point-of-Care - Tests verwendet , weil sie einfach zu bedienen sind und liefern Ergebnisse innerhalb von 15 bis 30 min ^{11, 12;} jedoch variieren ihre Empfindlichkeiten stark (10-80%) in Abhängigkeit von dem Hersteller und der Population getestet, und die influenza Typ und SUBTY^{13 pe, 14, 15.} Direkte Fluoreszenzassays (DFAs) eine überlegene Empfindlichkeit gegenüber RIDTs, aber die Verarbeitungszeit größer (~ 3 h) , und muss von erfahrenen Technikern ^{16, 17} abgeschlossen werden. Viral Kultur hat für Influenza - Diagnostik der Gold - Standard und hat eine verbesserte Empfindlichkeit über beide RIDTs und DFAs ^18. Allerdings Influenzaviruskultur kann überall 2-14 d in Anspruch nehmen, ihre Nützlichkeit verringern in ¹⁹ Patienten - Management unterstützen. Schließlich haben die Nukleinsäureamplifikation Tests (NAAT) Kulturtechniken wie der neue Goldstandard in der Influenza-Diagnostik ersetzt. NAAT werden als zum Detektieren influenza in wenigen Stunden die größte Empfindlichkeit zu haben. NAAT sind jedoch die teuersten Assays und erfordern spezielle Ausrüstung und Technologen ⁵ auszuführen , ^{20, 21, 22, 23, 24, 25.}

Das Influenza-A-und B-Test hier beschrieben wird, ist die erste CLIA-verzichtet Molekular schnelle Grippe-Test, die leicht verfügbar ist. Dieser Test funktioniert durch eine Nicking Endonuklease Amplifikationsreaktion (NEAR) unter Anwendung, die durch Zielerfassung mit molekularen Signalsonden gefolgt isothermen Amplifikation mit Influenza-spezifischen Primer verwendet. Dieser Test unterscheidet Influenza A von B, erfordert 2 Minuten einzurichten und eine Probe verarbeiten und erfordert insgesamt 15 Minuten zu beenden.

Hier präsentieren wir das Protokoll für die Influenza A & B-Test. Darüber hinaus bieten wir ein Beispieldaten die Leistung des Influenza-A-und B-Test auf archivierten Nasen-Rachen-Abstrich (NPS) Exemplare, gespeichert in der viralen Transportmedium zu vergleichen (VTM) zu einem anderen respiratorischen Erreger Panel-Untersuchung.

Protokoll

ETHIK STATEMENT: Die Verwendung von übrig gebliebenen klinischen Proben zugelassen ist und nach den Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review Board.

1. Vor dem Assay Lauf

HINWEIS: Das Influenza-A-und B-Test wird für Nasen-Rachen-Abstrichproben und für Nasen-Rachen-Abstrichen in viralen Transportmedien gespeichert zugelassen. Tupfer sind im Kit enthalten und sollte für eine optimale Leistung verwendet werden. Jedoch, Rayon, Schaum, beflockte Tupfer oder Polyester Nasenabstrichen können auch Nasentupferproben zu sammeln, verwendet werden.

1. Um eine Nasenabstrichprobe sammeln, legen Sie den Tupfer in das Nasenloch, die am meisten sichtbaren Drainage oder das ist am stärksten belasteten. Mit sanften Drehung, drücken Sie den Tupfer in das Nasenloch bis auf Widerstand stoßen und mehrmals gegen die Nasenwand drehen, bevor sie aus dem Nasenloch langsam entfernen. Lagern Sie die Tupfer und transportieren sie in Fläschchen mit 3 ml Virustransportmedien (VTM).
   HINWEIS: Eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf appropriate Probenentnahme muss als unzureichend Probenentnahme entnommen werden kann, zu falschen Ergebnissen führen.
   HINWEIS: Abstrichproben sollten so bald wie möglich nach der Entnahme getestet werden. Sie können jedoch bei Raumtemperatur für bis zu 2 Stunden oder gekühlt bei 2-8 ° C bis zu 24 Stunden aufbewahrt werden, wenn der Test nicht sofort verfügbar ist. Frisch sind gesammelt Proben für eine optimale Testleistung ideal. Eine unsachgemäße Handhabung von Proben, Lagerung und / oder Transport können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
   HINWEIS: Als Vorsichtsmaßnahme, Einzelpersonen der Durchführung dieser Prüfung sollten alle Proben zu behandeln, als potenziell infektiös durch allgemeine Vorsichtsmaßnahmen Folgendes, wenn Umgang mit den Proben.
2. Bringen Sie alle Proben auf Raumtemperatur vor dem Test.
   HINWEIS: Alle Testkomponenten für den einmaligen Gebrauch sind nur und sollte nicht verwendet werden, um mehrere Tests durchzuführen. Kitkomponenten nicht unterschiedlicher Chargen mischen. Nicht Kitreagenzien nach dem Verfallsdatum nicht mehr verwenden.
3. Bringen Sie den blauen Probeaufnahme zu room Temperatur vor der Prüfung. Die orange Testbasis kann ohne die Notwendigkeit, auf Raumtemperatur erwärmen, getestet werden.
4. Lassen Sie alle Teststücke in der Folienverpackung erst unmittelbar vor dem Gebrauch. Schalten Sie das Gerät durch Drücken der Power-Taste an der Seite des Gerätes. Geben Sie die User-ID ein und drücken Sie "OK".

2. Durchführung des Tests

1. Um den Testprozess zu beginnen, berühren 'Run Test "auf der Instrumentenanzeige. Geben Sie die Patienten-ID, indem Sie auf dem Bildschirm, Tastatur oder Barcode-Scanner ein und drücken Sie "OK". Öffnen Sie den Deckel und legen Sie die orange Testbasis in den Testgrundhalter orange.
2. Bestätigen Sie, dass der richtige Test auf dem Bildschirm angezeigt wird, und drücken Sie "OK". Legen Sie die blauen Probeaufnahme in den blauen Probenaufnahmehalter.
   HINWEIS: Schalten Sie den Proben Empfänger nicht öffnen, bevor sie in das Gerät legen, da dies die Elutionspuffer verhindern die richtige Betriebstemperatur erreicht und können die Testleistung auswirken.
3. Warten Sie auf die Probeaufnahme, um sich aufzuwärmen. Wenn vom Gerät aufgefordert, die Foliendichtung entfernen und den Patiententupfer setzen in die Probenaufnahmeeinrichtung getestet werden.
   HINWEIS: Wenn die Folie zu entfernen, zwei Finger auf den Rand des Sample-Empfänger, um sicherzustellen, dass es an seinem Platz bleibt.
4. Energisch den Tupfer für 10 Sekunden in der Flüssigkeit mischen, wird der Tupfer gegen die Seite durch Drücken der Probenaufnahme, wie Sie es mischen, um die Probe aus dem Tupfer entfernen. Drücken Sie auf "OK", um fortzufahren. Wenn die Prüfung in viralen Transportmedium gespeichert Tupfer, fügen Sie die VTM für 10 sec vortexen dann 200 & mgr; l der Probe Empfänger.
5. Drücken Sie die weiße Transferpatrone in den blauen Probeaufnahme. Weiter auf der Probeaufnahme drücken, bis die orangefarbene Anzeige steigt.
6. Heben und dann die Transfereinheit an der Testbasis verbinden. Beachten Sie die orangefarbene Anzeige absteigen, wenn die Patrone Übertragung korrekt angebracht ist. Den Deckel schließen und nicht erst öffnen, wenn der "Test Complete"Meldung erscheint auf dem Bildschirm.

3. Qualitätskontrolle

1. Tippen Sie auf "Run QC Test 'auf dem Home-Bildschirm. Wählen Sie den QC-Test zu starten. Bestätigen Sie den Testtyp der QC-Probe für den Test vorgesehen übereinstimmen durch Berühren "OK", und im Anschluss an die auf dem Bildschirm Tests abgeschlossen auffordert.

4. Ergebnisauswertung

1. Nachdem der Testlauf abgeschlossen ist, beachten Sie die Ergebnisse des Tests auf dem Bildschirm mit Interpretationen auf die Anwesenheit von Influenza A, B, unbekannte Subtypen angezeigt. Für ungültige Ergebnisse wiederholen Sie den Test.

5. Wartung und Reinigung

1. Reinigen Sie das Gerät und die umliegende Bankbereich täglich mit 70% Ethanol oder 10% Bleichlösung. Sprühen Sie die Reinigungslösung auf einem feuchten, fusselfreien Tuch zu reinigen. Gießen Sie die Lösungen nicht direkt auf dem Instrument.

Ergebnisse

In dieser Studie wurden archivierten NPS Proben von Patienten stationär gesammelt 15, am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) während einer Influenza-Ausbruch zwischen Dezember mit grippeähnlichen Symptomen präsentiert 2012 und 1. März 2013. Die NPS Exemplare in 3 ml vorgelegt wurden von VTM und als Teil der klinischen Routine mit einem molekularen Test getestet, die eine Gruppe von Atemwegsviren (RP), einschließlich Influenza A, A-1, A-3 und B. Während der Studie, 3675 ...

Diskussion

Influenzaviren sind signifikant weltweit Ursachen von Morbidität und Mortalität. Eine schnelle und genaue Diagnose der Influenza ist eine der wichtigsten Schlüssel zur Grippe-Ausbrüche während Atem Saison zu verwalten. Andere Antigen-basierte Tests sind schnell und einfach durchzuführen; sie haben jedoch geringe Empfindlichkeiten ^13. Auf der anderen Seite haben die traditionellen molekularen Tests Empfindlichkeit verbessert, benötigen aber mehr erfahrenen Labortechniker durchführen und si...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alere i Instrument	Alere	NAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test Kit	Alere	425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode Scanner	Alere	EQ001001
Alere Universal Printer	Alere	55115 (Global), alereiprinter (US)
200 µL precision pipette
200 µL disposable pipette tips
Viral transport medium	Remel	M4-RT