Ein einfacher Ansatz zur Manipulation von gelöstem Sauerstoff für Tierverhaltensbeobachtungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine einfache und reproduzierbare Protokoll gelösten Sauerstoffbedingungen im Labor für Tierverhaltensstudien zu manipulieren. Dieses Protokoll kann in Lehre und Forschung Labor-Einstellungen verwendet werden, um organismal Antwort von Makrozoobenthos, Fische oder Amphibien zu Veränderungen in der Konzentration des gelösten Sauerstoffs zu bewerten.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, gelösten Sauerstoff zu manipulieren (DO) in einer Laborumgebung hat bedeutende Anwendung eine Reihe von ökologischen und organismischen Verhalten Fragen zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll bietet eine einfache, reproduzierbare und kontrollierte Methode zur Manipulation Verhaltensreaktion in Wasserorganismen zu untersuchen DO aus hypoxischen und anoxischen Bedingungen. Während Entgasung von Wasser durchführt mit Stickstoff häufig in Laborumgebungen, keine explizite Methode für ökologische (Wasser) Anwendung besteht in der Literatur verwendet wird, und dieses Protokoll ist das erste, ein Protokoll zu entgasen Wasser zu beobachten organismal Antwort zu beschreiben. Diese Technik und das Protokoll wurden für die direkte Anwendung für Wasser macroinvertebrates entwickelt; jedoch, kleine Fische, Amphibien und andere im Wasser lebende Wirbel leicht ersetzt werden könnte. Es ermöglicht die einfache Handhabung der Ebenen DO im Bereich von 2 mg / L bis 11 mg / L mit Stabilität für bis zu 5 min Tierbeobachtungszeitraum.Neben einer 5-minütigen Beobachtungsperiode begann Wassertemperaturen steigen und bei 10 min Ebenen zu instabil DO wurde zu halten. Das Protokoll ist skalierbar auf die Studie Organismus, reproduzierbar und zuverlässig, so dass für eine schnelle Umsetzung in Einführungslehrlabors und High-Level-Forschungsanwendungen. Die zu erwartenden Ergebnisse dieser Technik sollte Sauerstoff Änderungen Verhaltensreaktionen von Organismen betreffen, gelöst.

Einleitung

Gelöster Sauerstoff (DO) ist ein wichtiger physikalisch-chemischen Parameter wichtig, in eine Reihe von biologischen und ökologischen Prozesse in aquatischen Ökosystemen zu vermitteln. Exposures zu akuten und chronischen subletalen Hypoxie Wachstumsraten in bestimmten im Wasser lebenden Insekten zu verringern und das Überleben der Insekten reduzieren ¹ ausgesetzt. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine kontrollierte Verfahren zu schaffen, DO Ebenen im Strom Wasser zu beobachten, die Auswirkungen auf das Verhalten der Tiere zu manipulieren. Da alle aeroben Wasserorganismen "Überleben auf der Sauerstoffkonzentration reflektiert, um zu leben und zu reproduzieren abhängt, sind Veränderungen in der Konzentration von DO oft in Verhaltensänderungen von Organismen. Mehr mobilen wirbellosen Wassertieren und Fischen beobachtet wurden zu niedrige Sauerstoffkonzentrationen (Hypoxie) von der Suche nach Schauplätzen mit höheren DO ^2,3 zu reagieren. Für weniger mobile Wasserorganismen, zu Verhaltensanpassungen Aufnahme von DO erhöhen die einzig gangbare Option sein. Die Wasser Makroinvertebraten Reihenfolge der PlecOPTera (stonefly) wurde festgestellt , "Push-up" Bewegungen auszuführen , um die Strömung des Wassers zu erhöhen, und die Aufnahme von Sauerstoff, über ihre äußere Kiemen ^{4 - 6.} Diese adaptive Verhalten wurden in natürlichen Umgebungen und in Laborexperimenten beobachtet.

Labor Manipulation von DO in Wasser eröffnet bedeutende Möglichkeiten für Tierverhaltensstudien, aber erhebliche Lücken in methodischen Einsatz existieren. Zum Beispiel verwendet eine Studie große Aquarien , die physiologische Reaktionszeit von Forellenbarsch (Micropterus salmoides) zu hypoxischen Umgebungen mit Stickstoff folgende Vergasung zu bewerten, aber kaum Detail ist für die Methodik ⁷ gegeben. Eine weitere Studie durchgeführt , auf Zebrafisch (Danio rerio) beschrieben Stickstoffgas und einen porösen Stein Gas zu Wasser zu liefern und die DO des Wassers ⁸ zu reduzieren. Für die Chemie-basierte Anwendungen, Verfahren zur Entgasung von Lösungsmitteln verwenden spezialisierteGerät ^{9. - 11.} Sauerstoff aus Lösungsmittel zu entfernen, würde aber für den tierischen Verhaltensforschung nicht geeignet sein. Während diese Studien Methoden verwenden Sauerstoff aus Wasser zu entfernen, konnte keine beschreibenden Verfahren identifiziert werden, die für die Beurteilung des Verhaltens von Tieren in Reaktion erlauben würde, Veränderungen zu tun.

Dieses Verfahren im folgenden beschrieben ist der Versuch, vollständig ein Protokoll für die Manipulation von DO Wasser beschreiben durch Stickstoffgas. Ferner wurde diese Methode zu beobachten Beziehungen zwischen stonefly Verhalten (pushups) entwickelt und tun, dass in Freshman-Ebene biologischen Labor eingesetzt wurde. Einer der wichtigsten Vorteile dieser Methode ist, dass es leicht in einem Labor mit gemeinsamen Glaswaren und Materialien zugänglich für die meisten sekundären und Hochschulen durchgeführt werden kann. Das Protokoll ist auch leicht anpassbar, so dass für den Einzelnen, das Verfahren zu skalieren, die Ziele für die Forschung oder Lehre Anwendungen dargelegt zu erfüllen.

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Protokoll

Hinweis: Dieses Experiment nicht Wirbeltiere verwendet haben und deshalb keine Genehmigung erforderlich war von Juniata College Institut für Animal Care und Verwenden Committee. Doch für den Einzelnen diese Methode für die Verwendung mit Wirbeltiere Anpassung sollte IACUC Genehmigung beantragt werden.

1. Gebiet Probenentnahme

1. Ermittlung und Bewertung von Potentialfeldstellen für die Fähigkeit, zu speichern zu sammeln und Transport Steinfliegen schnell mit einer maximal empfohlenen Zeit bei dem Transport von 1 Stunde Zeit bei dem Transport zu minimieren.
2. Führen Sie Kick-net Sampling auf dem ausgewählten Feld Website folgende Standard Kick-net Verfahren genug mal ¹² mindestens 35 Steinfliegen zu sammeln.
3. Sammeln Sie 50 l Strom Wasser und Felsen mit einem maximalen Durchmesser von 2 cm aus Strömen.
4. Platzieren Sie Aquarien in einem Kühlschrank auf die Temperatur des Stroms Website eingestellt. Verteilen Sie an den Strom-Site in Aquarien und füllen mit 4 l Strom Wasser pro Aquarium gesammelt Felsen. Platzieren Sie 20-30 Gesammelt Steinfliegen pro Aquarium und legen Sie einen sprudelnden Stein in ein Aquarium Sprudler in jedem Tank angebracht und schalten Sie bubblers kontinuierlich an das Wasser Raumluft hinzuzufügen.
5. Lassen Sie die Steinfliegen an die neue Umgebung in den Aquarien für eine 48 Stunden-Zeitraum einzustellen.

Abbildung 1 für gelösten Sauerstoff Manipulation ein. (A) 1) Montage für Kupferrohr zu männlichen -Schlaucholive 2) Position der Stopper Dichtung zu prüfen , um sicherzustellen , gut Dichtkolben. (B) 1) 2 L Seitearm Kolben mit 1,9 l Wasser 2) Gasrohr und Luftsprudler (blau) für den Einsatz in Einblasen von Stickstoff und Raumluft sprudelnden gefüllt bzw. 3) Stickstofftank und geeicht Werte 4) 2 - l - Kolben gefüllt mit 0,4 l Wasser mit Vakuumröhre unter Wasser 5) Oxi - Meter. Bitte klicken Sie hier , um diesehen eine größere Version dieser Figur.

2. Versuchsanordnung

1. Auf einer Tischplatte, eine Verbindung zu dem Seitenarm eines 2 L Seitearm Kolben mit einem Standard - walled Vakuumröhre als (1 in Abbildung 1B) dargestellt ist.
2. Füllen Sie den Kolben, der mit 1,9 l von Strom Wasser aus 3 l Kunststoff-Behältnissen mit einem gesammelten Strom Wasser im Kühlschrank bis 12 ° C eingestellt.
3. Der Kolben und Schläuche auf einem Tablett groß genug, um ein Eisbad um den Seitenarm-Kolben zu halten, ohne den Blick auf den Kolben Innen verdunkeln und das Tablett mit Eis füllen.
4. Bohren zwei 3 mm Löcher mit einem Durchmesser in einem Gummistopfen den Durchgang von 1) ein Kupferrohr zu ermöglichen , das Gas in das Gefäß und 2) die Sonde eines DO - Meter in das 2 L Seitenarm-Kolben (1 in Figur 1B zu liefern) .
5. Bilden einen seitlichen Einschnitt von der Kante des Stopfens zu einem der Löcher Aufsitzen des Drahts der DO-Sonde in den Stopfen zu erlauben.
6. Schließen Sie einen Koppler mit einem 3 mm männlichen Schlauchbarb zu einem Stück von 2 mm Durchmesser Kupferrohr (1 in 1A). Sicherzustellen, dass dieses Rohr lang genug ist, innerhalb von 10 cm von dem Boden des Kolbens zu erreichen, um, während sie durch den Anschlag erreicht.
7. Setzen Sie das Rohr mit Kupplers obwohl das zweite Loch in dem Stopfen, bis die Länge von der Unterseite des Stopfens genug ist, zu erreichen, um innerhalb von 10 cm von dem Boden des Kolbens.
8. Schließen Sie eine 0,75 m Länge, dünnwandige Polyethylen Gasrohr mit einem Durchmesser von 3 mm an den Koppler auf dem Rohr.
9. Schieben Sie sowohl die DO-Sonde und Kupferrohr in den Kolben und Dichtung den Kolben mit dem Stopfen.
10. Check für eine sichere Abdichtung zwischen dem Stopfen und dem Kolben sowie eine eng anliegende Passung zwischen dem Rohr und dem Sondendraht innerhalb des Stopfens.
11. Füllen Sie einen 1-Liter-Kolben mit 0,4 l Leitungswasser und setzen neben dem Tablett mit dem Eisbad und Vakuumflasche.
12. Tauchen Sie die Polyethylenrohr aus dem großen Vakuumflasche in das Wasser des Kolbens 1 L kommt. Sichern Sie dieRohr mit einem Band, so dass es durch das Experiment untergetaucht bleiben.
13. Schließen Sie den 3 mm Durchmesser Gasleitung von der Vakuumflasche in ein Aquarium Raum-Luftsprudler. Beginnen Sie mit dem Wasser in der 2-Liter-Kolben auf Blase, die durch im Aquarium Sprudler Verstopfung, die Raumluft und Sauerstoff zum Wasser führt.
14. Überwachen Sie die DO-Konzentration und Temperatur des Wassers mit dem DO-Meter für 5 Minuten oder bis ein Gleichgewicht von DO ist innerhalb der Kammer so eingestellt, dass eine geringe Änderung in DO auftritt.

3. Prüfung der Stabilität des Versuchsanordnung

1. Testen Sie jede Einrichtung für DO Stabilität vor der Zugabe von Steinfliegen.
2. In drei oder vier Steine ​​in die 2-Liter-Kolben, so dass Steinfliegen Substrat für pushups förderlich sind.
3. Beginnen Sie eine Probe Manipulation von DO durch das Gasrohr aus Wäscher zu trennen und es an das Stickstoffgasleitung anzubringen.
4. Beginnen Stickstoff bei 20 Kubikfuß pro Stunde sprudeln (CFH) für etwa 40sec bis 1 min.
5. Sobald die DO innerhalb von 0,5 mg / L der Zielkonzentration abgesunken ist, reduzieren die Strömung zu 15 CFH und damit die Konzentration auf das Ziel zu verringern.
6. Cease Stickstoffstrom, sobald die Zielkonzentration erreicht ist.
7. Verwenden Sie das Aquarium Raum-Luftsprudler, die Konzentration auf die Zielkonzentration zurückzukehren, wenn die DO unter dem Ziel ab.
8. Wenn die DO während der Prüfung eines Set-up dann prüfen, das Wasservolumen noch bei 1,9 L und kein Wasser hat sprudelte heraus, Wassertemperatur stabil ist und sich nicht ändert, und Dichtungen an allen Armaturen zu sein scheinen, dicht und verschlossen instabil ist.
9. Sobald drei Versuche durchgeführt wurden, und der Experimentator hat das Vertrauen in die Fähigkeit DO zu kontrollieren, heften sich an der Sprudler und Blase die Gasleitung wieder ins Gleichgewicht.
10. Blase zum Gleichgewicht durch die 3 mm Durchmesser Gasleitung in das Aquarium Bubbler Anbringen und Starten der Zugabe von Raumluft, um das Wasser, bis die Konzentration vonSauerstoff im Wasser nicht erhöht oder nicht für 3 Minuten ändern.
11. Einmal im Gleichgewicht zu stoppen sprudeln und die Kolben entsiegeln.

4. Stonefly Push-up-Experiment

1. Teilen die Gesamtzahl der Steinfliegen durch die Anzahl der Beobachter die Anzahl der Versuche zu bestimmen, durchzuführen.
2. Bestimmen verschiedene DO Niveaus zwischen 2 und 10 mg / L der Verhaltensreaktion von Steinfliegen (Anzahl der pushups) zu bewerten.
3. Richten Sie einen Kolben pro Versuch und fügen Sie eine gleiche Anzahl von Steinfliegen, da es Beobachter in den Kolben (4 Steinfliegen in diesem Entwurf), legen Sie die Sonde und Rohr zurück in den Kolben, dann wieder verschließen die Flasche mit dem Gummistopfen.
   Hinweis: Eine anfängliche Sauerstoffkonzentration von 10 mg / l wurde als der erste Beobachtungspunkt gewählt, da es die DO-Konzentration des Stromes aus war, wo die Steinfliegen abgetastet wurden.
4. Sobald das Wasser bei 10 mg / l ist durch folgende Schritte sprudelnden 2,10-2,11, notieren Sie die Startwassertemperatur und damit dieSteinfliegen zum Gesteinssubstrat in dem Kolben zu befestigen.
5. Stellen Sie immer nur ein Beobachter einen einzelnen stonefly zu sehen genaues Zählen von Push-up-Verhalten zu gewährleisten, die die Auf- und Abwärtskörperbewegung durch die stonefly ausgestellt ist.
6. Zählen und notieren Sie die Anzahl der Push-ups beobachtet über den Verlauf einer 3-minütigen Beobachtungsperiode.
7. Manipulieren auf die nächste experimentelle DO Ebene DO und wiederholen 3 min Beobachtungszeitraum für die zusätzlichen experimentellen Ebenen.
   Hinweis: In diesem experimentellen Design wurden drei verschiedene DO Stufen bewertet.

5. Statistische Analyse

1. Verwendung der statistischen Analyse durchschnittliche Anzahl der Push-ups über die vier Steinfliegen über eine Gruppe für eine bestimmte DO-Studie durchzuführen.
2. Nutzen Sie die kostenlose R statistische Berechnungen Software ¹² eine Varianzanalyse (ANOVA) auf die Anzahl der Push-ups und die DO - Konzentrationen mit der Reihenfolge der einzelnen Versuchs auszuführen (DO - Ebene) und Temperatur als covariates. Analysiert DO als diskrete Pegel eines einzelnen Faktors.
3. Verwenden Sie einen Anderson-Darling - Normalitätstest auf Residuen für ¹³ Normalität zu überprüfen.
4. Führen Sie eine lineare Regression auf die Daten, die durch die mittlere Anzahl von Push-ups gegen DO-Konzentrationen aufgetragen.

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Ergebnisse

Sechs Versuche der beschriebenen Einrichtung wurden von 24 Studenten im ersten Jahr Studenten in einem Lehrlaborbedingungen ausgeführt, um die Anzahl der Push-ups Steinfliegen in Reaktion auf unterschiedliche Sauerstoffkonzentration in Wasser durchführen zu quantifizieren. Die durchschnittliche Anzahl der Push-ups innerhalb einer DO - Ebene durchgeführt und innerhalb jeder Studie wurde gepoolt plotten Push-ups gegen den DO - Ebene in Abbildung 2. Eine ANOVA wurd...

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Diskussion

Kritische Schritte
Dieses Verfahren stellt eine einfache und effiziente Art und Weise müssen in einer Laborumgebung zu manipulieren Verhaltensstudien auf Wasserorganismen durchzuführen. Wir fanden es mehrere wichtige Schritte / Positionen zu sein, bewusst zu sein, wenn dieses Experiment durchführen, die auf die Ergebnisse in direktem Zusammenhang. In einem Versuch, ist es entscheidend, den Kammerdruck zu vermeiden Änderungen des Partialdruckes von Gasen über dem Wasser, und anschließende DO Schwankungen auf...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter flask 2 L	Pyrex	5340
Rubber Stopper size 6	Sigma-Aldrich	Z164534
Nalgene 180 Clear Plastic Tubing	Thermo Scienfitic	8001-1216
Whisper 60 air pump	Tetra
Standard flexible Air line tubing	Penn Plax	ST25
0.25 inch Copper tubing	Lowes Home Improvement	23050
Male hose barb	Grainger	5LWH1
Female Connector	Grainger	20YZ22
Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter	Extech	407510
Nitrogen gas	Matheson TRIGAS
Radnor AF150-580 Regulator	Airgas	RAD64003036