Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Zusammenfassung

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Zusammenfassung

Anlagenteil Integrität Pflege ist wichtig für an der Zell-, Gewebe- detaillierten anatomischen Strukturen zu studieren oder sogar Organebene. Allerdings haben einige Pflanzenzellen starren Zellwände, zähen Fasern und Kristallen (Calciumoxalat, Siliciumdioxid, etc.) und mit hohem Wassergehalt , die stören oft Gewebeintegrität während des Schneidens Pflanzengewebe.

Diese Studie stellt eine einfache Hybrid-Cut Gewebe Schnittverfahren. Dieses Protokoll modifiziert eine Paraffinbasis Sektionieren Technik und verbessert die Integrität von Gewebeschnitten aus verschiedenen Pflanzen. Pflanzengewebe wurden in Paraffin eingebettet, bevor bei -16 ° C in einem Kryostaten sectioning. deutlich Sectioning bei niedrigen Temperaturen gehärtet, um die Paraffinblöcke, reduziert Reißen und Kratzen und eine verbesserte Gewebeintegrität. Dieses Protokoll wurde erfolgreich sowie widerspenstigen Gewebe wie reproduktives orga zu Kalziumoxalat-reiche Phalaenopsisorchidee Gewebe aufgetragenns und Blätter von Reis, Mais und Weizen. Darüber hinaus könnte die hohe Qualität von Gewebeschnitten von Hybrid-Cut in Kombination verwendet werden , mit in - situ - Hybridisierung (ISH) räumliche Expressionsmuster von Genen von Interesse bereitzustellen. Abschließend ist dieses Protokoll besonders nützlich für die widerspenstigen Pflanzengewebe mit einem hohen Kristall oder Silica-Anteil. Gute Qualität Gewebeschnitte ermöglichen morphologische und andere biologische Studien.

Einleitung

Die Paraffinbasis Schnittverfahren ist eine weit verbreitete Technik für anatomische Studien. Erhaltung der intakten Gewebes Anatomie ist wichtig für die morphologische und biologische Untersuchungen. Das Paraffin eingebettete Schnitte Technik ist vorteilhaft, da Paraffineinbettung Zell- und Gewebemorphologie behält. Zusätzlich Paraffinblöcke können bequem für längere Zeit gelagert werden. Allerdings, in Paraffin eingebettete Schnitte ist für Pflanzengewebe enthält, intrazellulär Kristalle nicht geeignet. Kristalle innerhalb der Zellen häufig Paraffin Bänder und Gewebe schädigen Integrität reißen während des Schneidens.

Im Gegensatz zu Paraffin Schneide ist Kryoschneiden relativ schnell und Abschnitte können ohne Fixierung, serielle Dehydratation oder Einbettmediums Infiltration ¹ erhalten werden. Kryoschnitte sind kompatibel mit vielen Anwendungen , wie der Immunhistochemie, Hybridisierung in situ, und Enzymhistochemie. Der andere Vorteil von Kryoschneiden istdaß dieses Verfahren geht nicht durch ein Spannungs Denaturierung Prozesse wie hohe Temperatur und chemischen Behandlungen werden so zelluläre Moleküle gut innerhalb der Gewebeabschnitte ² erhalten. Kryoschneiden ist im allgemeinen bevorzugt über Paraffinbasis für Studien in tierischen Geweben sectioning. Allerdings ist Kryoschneiden nicht die erste Wahl in Pflanzen, weil Gefriertemperatur manchmal Bildung von Eiskristallen verursacht, die die Qualität der Abschnitt Integrität beeinträchtigen. Obwohl osmoregulation wie Saccharoselösungen, Polyethylenglykol (PEG) oder Glycerin - ³ berichtet Kristall Eisbildung unter Gefrierbedingungen zu verringern, ist die Verbesserung geringer als optimal.

Zur Anpassung an unterschiedliche Umgebungen, verschiedene Pflanzen haben oft unterschiedliche Gewebebeschaffenheit und Pflanzenzellen entwickelt haben starren Zellwände, zähen Fasern zu bilden, und Kristalle ^4,5. Zum Beispiel sind unlösliche Kalziumoxalatkristallen und Kieselkörper relativ häufig inPflanzen ^6. Silicate Körper / Kristalle wurden berichtet wird, um Anlagenarchitektur erhalten, Geradheit, und Verhütung von Krankheiten oder Schädlings in Getreidepflanzen ^7-9.

Die Topf Orchideen und Schnittblumen Orchidee Markt floriert und es ist eine wachsende Branche. Phalaenopsis aphrodite (Phalaenopsis) ist einer der wichtigsten Export Zierpflanzen in Taiwan. Erhebliche Anstrengungen wurden unternommen , um die morphologischen und physiologischen Veränderungen der Blüten Prozesse in Phalaenopsisorchideen zu verstehen gemacht. Floral Spitzen von Phalaenopsisorchideen aus Achselknospen an der Blattbasis eingeleitet. Nach einer Zeit der kühlen Umgebungstemperatur (etwa eineinhalb Monate), Achselknospen vergrößern, brechen dormancy und ragen aus dem Blattbasis in jungen Blumenspitzen zu entwickeln. Um die physiologischen verstehen, zellulären und molekularen Prozesse der Spitze Initiation ist es wichtig, eine stabile anatomische Technik zu entwickeln, um Visualize Gewebe oder Marker in einer angemessenen Weise. Doch das Vorhandensein von allgegenwärtigen Kristalle in Orchidee Geweben, insbesondere in Achselknospen, macht anatomische Arbeit schwierig.

Hier haben wir versucht, Abschnitt Integrität von widerspenstigen Pflanzengewebe zu verbessern, die als technisch anspruchs bisher angesehen wurden. Hier zeigen wir ein verbessertes Protokoll namens Hybrid-Cut. Es ist ein Paraffinbasis Schnittverfahren, das einen Kryostaten durchgeführt wird. Paraffinausgießstation löst mit hohem Wassergehalt in Pflanzengewebe. Sectioning bei niedrigen Temperaturen härtet der Paraffinblock, reduziert Kristall Problem zu reißen, und die Integrität Gewebe erheblich verbessert. Dieses Protokoll deutlich verbessert die Gewebeintegrität für widerspenstige Pflanzenproben.

Protokoll

1. Fixation and Embedding

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
      1. Hinzufügen , 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na ₂ HPO ₄ und 2,4 g KH ₂ PO ₄ in 800 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH ₂ O) und Einstellen des pH auf 7,4 mit HCl. In ddH ₂ O auf ein Gesamtvolumen von 1 l, fügen Sie dann 1000 ul Diethylpyrocarbonat (DEPC) und kräftig schütteln. Store PBS über Nacht bei Raumtemperatur und Autoklaven bei 121 ° C für 20 min am folgenden Tag.
   2. 1x PBS
      1. Verdünne das Lager 10x PBS bei Verhältnis 1:10 in ddH ₂ O zu einer Endkonzentration von 0,01 M Na ₂ HPO _4, 0,002 M KH ₂ PO _4, 0,003 M KCl und 0,13 M NaCl zu erhalten.
   3. Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel
      Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Bereiten Sie es unter einer Abzugshaube. Trag Handschuhe.
      1. Zur Herstellung von 250 ml PFA Fixativ, Wärme 100ml 1x PBS auf 70 bis 80 ° C und 1.750 & mgr; l NaOH hinzu. Dann wurden 10 g Paraformaldehyd hinzufügen und gründlich mischen, bis es gelöst. Legen Sie die Lösung auf Eis und dann der pH - Wert auf 7,2 mit H ₂ SO ₄ (260-270 & mgr; l für 100 ml) nach dem Abkühlen.
      2. Stellen Sie das Volumen auf 250 ml mit 1 x PBS, fügen 625 ul Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,25%. Nach Eintragen von 250 & mgr; l Triton X-100 und 250 & mgr; l Tween 20 die Infiltration der Fixierungsmittel zu erleichtern.
         HINWEIS: Die PFA Fixativ kann, ohne seine Fixierung Fähigkeit für einen Monat bei 4 ° C gelagert werden.
   4. Bereiten verschiedene Konzentrationen von Ethanol (30%, 50%, 70%, 85% und 95%) mit DEPC-behandeltem Wasser.
2. Pflanzenprobensammlung
   1. Achselknospen
      1. Verwenden Sie reifen Phalaenopsis - Orchideen Pflanzen im Vier-Blatt - Stadium. Entfernen Sie vorsichtig Blätter durch die Blatt reißen nach dem midrib mit den Händen.
      2. Mit einem scharfen Skalpell Töully Achselknospen aus der Basis des dritten und vierten Blattes auf der monopodial Schaft entfernen.
   2. Seed Probe
      1. Ernte reifen Orchidee Samenkapseln nach 4 Monaten nach der Bestäubung. Schneiden Sie Samenhülsen in Längsrichtung mit einem Skalpell. Schütteln Sie die Öffnung Samenschote vorsichtig und lassen Sie die trockenen Samen auf Filterpapier.
   3. Protocorm
      1. in einem Gewebekulturraum in einem 12 Stunden Lichtperiode und konstante Temperatur von 25 ° C Sow reifen Orchidee Samen auf einem 1 / 2x Murashige und Skoog-Agar-Platte, und zu wachsen. Beispiel grün Protocorm bei 7 Wochen nach der Aussaat.
   4. Protocorm artigen Körpern (PLB)
      1. Wachsen Orchidee PLBs auf T2 Regenerieren Agarplatten wie zuvor ¹⁰ und unter den gleichen Wachstumsbedingungen wie bei dem Schritt 1.2.3.1 beschrieben. Sammelt 10 PLBs in einer Höhe von 5 bis 8 mm.
   5. Blattprobe
      1. Sammeln Blattgewebe von einer reifen Orchidee Pflanze Phalaenopsis wie in Schritt1.2.1.1.
      2. Mit einem scharfen Skalpell ein kleines Stück Blattgewebe zu schneiden (7 mm Länge x 5 mm Breite) von der zweiten neu entwickelten Blatt.
   6. Root-Probe
      1. Unter Verwendung der gleichen Anlage in der 1.2.1.1 Schritt beschrieben, sezieren 1 cm Länge von Gewebewurzelspitze ein scharfes Skalpell.
   7. Junge Spike
      1. Mit einem scharfen Skalpell junge Spike Gewebe aus dem Spitzenteil der Blütenstiel 10 cm in der Länge zu schneiden.
   8. Blütenknospe
      1. Excise eine kleine Blütenknospe von 5 mm im Durchmesser von Orchideenblütenstiel. Schneiden Sie ein Teil der Blütenknospe Gewebe in Längsrichtung (3 mm Dicke).
   9. Blattgewebe und Ährchen Gewebe von Getreide
      1. Cut 1 cm Länge Blattspreite Gewebe aus den ersten neu entwickelten Blätter von Reis, Weizen und Maispflanzen.
      2. Sammle 10 Ährchen aus Pflanzen (Reis, Weizen und Mais) einen Tag vor der Blüte.
3. Fixierung
   1. Fix Pflanzenproben sofort, indem sie in einem Glasszintillationsröhrchen mit 15 ml eiskaltem PFA Fixativ zu übertragen.
   2. Wenden Sie ein Vakuum (~ 720 mm Hg), um Pflanzenproben in einem 4 ° C kühlen Raum. Halten Sie das Vakuum für 15 bis 20 min (kleine Bläschen sollten aus den Proben freigesetzt werden). Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die meisten der Gewebe nach der Freigabe des Vakuums zu versenken. Halten Sie das Vakuum über Nacht und lassen Sie die Vakuum langsam am nächsten Tag.
4. Entwässerung
   HINWEIS: Verwenden Sie die gleiche Fläschchen aus der Fixierung durch die Infiltration Schritte. Gießen oder eine Pipette, um die Lösung in dem vorherigen Schritt abfließen und mit 15 ml neue Lösung in die Phiole zu ersetzen. Je nach Beschaffenheit des Gewebes, zu behandeln härtere Gewebe wie Orchidee Achselknospe, Samen, Protocorm und PLB und die Ährchen von Reis, Weizen und Mais für eine längere Zeit; Behandlung weicher Gewebe wie Orchideenblütenknospe, jung Spitze, Blatt und Wurzel, und das Blatt von Reis, Weizen und Mais für eine kürzere Zeit.
   1. Nach der Fixierung tauchen für 10 Minuten auf Eis, um die Probe in 15 ml 1x PBS.
      1. Dehydratisieren Proben in 15 ml Ethanolreihe bei Raumtemperatur wie folgt: 30% Ethanol für 30 min, 50% Ethanol für 30 min, 70% Ethanol für 1 h, 85% Ethanol für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, 95% Ethanol für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, und 100% Ethanol zweimal für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe.
         HINWEIS: Pflanzenproben in 70% Ethanol bei 4 ° C mehrere Monate gelagert werden.
5. Paraffin Infiltration
   1. Infiltrieren Proben mit 15 ml Ethanol und Xylolersatz Gemisch 54 min jeweils für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, bei Raumtemperatur wie folgt: Ethanol / Xylolersatz (2: 1, v / v), Ethanol / Xylolersatz (1 : 1, v / v), Ethanol / Xylol-Ersatz (1: 2, v / v) und reines zweimal Xylolersatz. Achtung: Xylol ist giftig. Führen Sie diesen Schritt in Abzug durchführen.
   2. Infiltrieren Probe in dem Fläschchen mit 15 ml Xylolersatz und Paraffingemisch in einem Ofen bei 60 ° C, über Nacht für härtere Gewebe und für 60 min für weichere Gewebe, wie folgt: Xylolersatz / Paraffin (2: 1, v / v), Xylolersatz / Paraffin (1: 1, v / v), und Xylolersatz / Paraffin (1: 2, v / v).
   3. Infiltrieren Probe mit 15 ml reinem Paraffin zweimal täglich und Inkubation in einem Ofen bei 60 ° C.
   4. Wiederholen Sie Schritt 1.5.3 am nächsten Tag.
6. Gewebeeinbettung
   1. Schalten Sie die Kraft des Gewebeeinzentrum 1 Stunde im Voraus das Wachs in dem Paraffinbehälter zu schmelzen, bevor Gewebe in einem Paraffinblock eingebettet ist.
   2. Warm up der Metallformen (Größe der Basis 3,3 cm Länge x 2 cm Breite) auf der Warmhalteplatte bei 62 ° C, und gießen Sie ca. 13 ml geschmolzenem Wachs in die Form Basis.
   3. Übertragen einer Gewebeprobe aus dem Abschnitt 1.5.4 in die Form mit erwärmter Zange und richten Sie sie in die gewünschte Position.
   4. Bewegen Sie die Formvorsichtig auf die Kühlplatte und lassen, bis das Wachs verfestigt wird.

2. Die Gewebe Sectioning

1. Paraffinschnittverfahren
   1. Machen Sie eine Wachsbasis durch eine Einbettungskassette auf der Oberseite einer Form (gleiche Größe im Abschnitt 1.6.2) das Aussetzen, füllen mit geschmolzenem Wachs und entfernen Sie die Form, nachdem das Wachs verfestigt wird.
      HINWEIS: Die Einbettungskassette wird eine Wachsbasis bilden die Probe Paraffinblock zu verankern.
   2. Schneiden Sie den Paraffinblock in eine geeignete Form und Größe, und legen einige Wachsstücke auf einem flachen Spatel. Erhitzen Sie das Wachs Stücke einen Spiritusbrenner, bis das Wachs schmilzt und setzen es dann um das geschmolzene Wachs auf dem Wachsbasis in Abschnitt 2.1.1 um den Block zu halten. Klemmen Sie es in dem Mikrotom.
   3. Legen Sie eine neue Klinge auf das Mikrotom, und stellen Sie den Winkel bis 5 Grad, um die Schnitte in das Mikrotom zu erleichtern.
   4. Schneiden Sie die Probe Paraffinblock in dünne Scheiben (10 & mgr; m), wie zuvor ¹¹ beschrieben.
   5. Hybrid-Cut-Methode sectioning
      1. Schneiden Sie die Probe Paraffinblock von Schritt 1.6.4 auf eine Säule mit einer Trapezfläche an der Spitze auf eine geeignete Größe mit einer Rasierklinge.
      2. Fügen Sie etwas optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) zur Mitte des Kryostaten Bühne. Bringen Sie den Paraffinblock zu dem Kryostaten Bühne und dann orientieren schnell den Gewebeblock in die gewünschte Position.
      3. Übertragen Sie die Paraffinblock / Stufe zu einer Kryostatkammer. Lassen Oktober für 10 min auf Schnellgefrier bar bei -42 ° C zu verfestigen. Sie nicht den Block während der Erstarrung von OCT (2C) zu bewegen.
      4. Lassen Sie den Kryostaten Adapter und Kammertemperatur abkühlen bis zu -20 ° C und -16 ° C jeweils vor dem Paraffinblock / Stufe mit dem Kryostaten Adapter befestigen. Abschnitt Geweben bis 10 um in der Dicke.
      5. Pick-Gewebeschnitte mit einer Pinzette. Schwimmer in den Abschnitten über 800 & mgr; l DEPC-behandeltem Wasser in einem Poly - L - Lysin coated Rutsche und bei 42 ° C, um die Dias auf einer heißen Platte übertragen.
      6. Lassen Sie die Abschnitte bei 42 ° C auf DEPC-behandeltem Wasser zu glätten. Verwenden Sie Filterpapier, um das Wasser vom Rand abfließen.
      7. Berg Gewebe auf dem Schlitten durch den Schieber auf einem 42 ° C heißen Platte über Nacht platzieren.

   3. Gewebefärbung

   1. Entparaffinierung
      1. Sammeln Sie die Folien von der heißen Platte und legen Sie sie in einem Färbebank. In 150 ml Xylol in einem Färbeküvette in Dunstabzug und tauchen Sie das Rack in Xylol für 5 min.
   2. Rehydrierung
      1. Bereiten verschiedenen Konzentrationen von Ethanollösungen (100%, 95%, 70%, 50% und 30%) in DEPC-behandeltem Wasser und füllt 150 ml Lösung in verschiedene Färbeschalen, respectively.
      2. Rehydrieren der Proben durch eine Reihe von Ethanolkonzentration abnimmt, wobei jeder Schritt für 3 min bei Raumtemperatur. Die Objektträger in der Färbebank ein Gefäß in ein anderes Gefäß mit different Ethanolkonzentrationen: 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, 50% Ethanol und 30% Ethanol.
      3. Nach Rehydrierung, tauchen die Proben in ddH ₂ O 3 min.
   3. Hämatoxylin-Färbung
      1. Stain Gewebeproben von Gewebeschnitten in Hämatoxylinlösung für 1,5 min eingetaucht wird.
      2. Spülen kurz in ddH ₂ O , enthaltend 1 bis 2 Tropfen 12 N Salzsäure (HCl) für ein paar Sekunden, und dann kurz waschen in ddH ₂ O.
   4. Entwässerung
      1. Dehydratisieren der Proben durch eine Reihe von zunehmenden Ethanolkonzentrationen für 3 min bei Raumtemperatur: 30% Ethanol, 50% Ethanol, 70% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol. Deaktivieren Sie die Proben mit Xylol in der Abzugshaube für 5 min.
   5. Montage
      1. Drop-in geeigneter Weise 600 ul Xylol-basierten Montagemedium auf Folie. Vorsichtig ein Deckglas über die Probe. Vermeiden Sie Luftblasen bilden Bilder von guter Qualität zu erhalten.
      2. Lassen Sie die Folien über Nacht trocknen an der Luft. Beachten Sie die Probe unter einem Mikroskop am nächsten Tag.
         Hinweis: Die Bilder wurden bei 25X bis 400X Vergrßerung erfasst abhängig von der Größe der Proben.

   4. In Situ Hybridization

   1. Probe-Synthese
      1. Klon Phalaenopsis aphrodite Actin genspezifischen codierende Sequenz unter Verwendung der Primer 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'und 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (242 bp PCR - Amplikon zu erhalten) und CyclinB1; 1 - Gen - spezifischen Kodierungssequenz unter Verwendung der Primer 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 ' und 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(um 327 bp PCR - Amplicon) , wie ¹² beschrieben.
      2. Ligieren die spezifischen codierenden Sequenzen in Vektoren (zB pGEMT) nach dem Protokoll des Herstellers.
      3. Erzeugen Digoxigenin (DIG) markierte Sense und Antisense-Sonden unter Verwendung von SP6 / T7 DIG RNA Labeling Kit nach Herstelleranweisungs.
   2. In situ Hybridisierung
      1. Schneiden Sie die ^2. und ^3. Achselknospe Gewebeschnitt (10 & mgr; m Dicke) erzeugt , um die Hybrid-Cut - Verfahren, und montieren Scheiben auf beschichtete Folie.
      2. Entparaffinieren Gewebeschnitte in Xylol (siehe 3.1.1), rehydrieren Konzentrationen von Ethanol (siehe 3.2.2) und Verdau mit 2 mg / ml Proteinase K bei 37 ° C für 30 min in abnimmt.
      3. Führen in situ Hybridisierung gemäß dem Protokoll vorher beschriebenen ^11,13 mit einigen Modifikationen, dh mit Hybridisierungstemperatur für Actin als 59 ° C und 60 ° C für CyclinB1;. 1 Hybridisieren Objektträger mit 40 ng DIG-markierter RNA - Sonde.
      4. Verwenden Nitroblautetrazolium / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl - phosphat (NBT / BCIP) -Lösung Hybridisierungssignale zu erfassen , wie ¹¹ beschrieben.

Ergebnisse

Hybrid-Cut Verbessert die Integrität von Gewebeschnitten

die Anatomie der reproduktiven Blüthenbau zu verstehen, ist wichtig, um die zugrunde liegende Mechanismus der Blütenbildung in Orchideen für die Untersuchung. Allerdings macht die Akkumulation von intrazellulären Calcium - Oxalat - Kristalle in Phalaenopsisorchideen solche Studien , die eine anspruchsvolle Aufgabe. Um die Probleme im Zusammenhang mit umgehen , indem Kristalle während des Schneidens verursacht Reißen (Abbildung 1), entwickelten wir ein System , das wir Hybrid-Cut genannt. Dieses Protokoll verbindet traditionelle Paraffineinbettung und Kryoschnittes Techniken. Wir testeten erste Hybrid-Cut in Achselknospen von Phalaenopsis - Orchideen , weil sie für die Gewebesteifigkeit und hoher Kristallgehalt berüchtigt sind. Axillary Knospe Gewebe in 4% wurde PFA (siehe Protokoll, Schritt 1.3). Nach Serien Ethanol-Dehydratisierung und Paraffinwachs infiltration, die Achselknospe in einem Paraffinblock eingebettet. Der Block wurde auf eine geeignete Größe zugeschnitten vor (2A) sectioning. Eine kleine Menge der OCT wurde dann in der Mitte des Kryostaten Stufe (2B) aufgebracht ist . Der Paraffinblock wurde dann auf die Stufe über Oktober haftete. Die Stufe wurde in einem Kryostat für 10 min inkubiert vollständigen Verfestigung der OCT zu ermöglichen , bevor sectioning (2C) , und dann Kryoschnitt wurde in einem -16 durchgeführt ° C Kammer (2D).

Als Vergleich wurde ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthält, Schnitte regelmäßigen Mikrotom ausgesetzt. Wie in 1A gezeigt, schwere Einreißen der Paraffin Bändern wurde nach Mikrotom Schnitte beobachtet. Die Gewebeintegrität und Zellstruktur wurde ebenfalls beeinträchtigt (1B). Hybrid-Cut, auf der anderen Seite,hergestellt intakte Gewebeschnitte (3A) mit konservierten strukturellen Integrität (3B).

Die Anwendung der Hybrid-Cut zu verschiedenen Geweben von P. Aphrodite

Um die Ansprechbarkeit von Hybrid-Cut zu testen, die wir getestet verschiedenen Geweben von Phalaenopsis Orchideen. Es ist oft schwierig Abschnitte von Samen mit Integrität gute Gewebe weil der gehärteten Samenschalen zu erhalten. Unter Verwendung dieses Protokolls, detaillierten Strukturen der Samen wurden nach sectioning (4A) aufbewahrt. Wie in 4A, Eiweißkörper gezeigt, ¹⁴ die gemeinsamen Speicherprodukte werden konnte eindeutig identifiziert werden . Hybrid-Cut arbeitete auch erfolgreich und zeigte die detaillierte Strukturen des Sprossapikalmeristem des einmonatigen alten Protocorm (die gekeimten Struktur aus einem Samen) (4B) undProtocorm-like-Körper (PLB, 4C). Die intrazellulären Kristalle wurden in Abschnitte von PLB. Phalaenopsisorchideen haben dicke und saftigen Blätter beobachtet und sie führen Crassulacean-Metabolismus (CAM) -Typ Photosynthese ^15. Der Querschnitt der Blattspreite zeigte große Mesophyllzellen und Gefäßbündel enthält Xylem und Phloem (4D). Paar stomatal Öffnungen wurden auf der abaxial Blattoberfläche während der Tageszeit (4D) beobachtet. In der Tat entwickelte CAM - Pflanzen Kohlenstoff Gewinn zu maximieren , sondern gleichzeitig den Wasserverlust durch ihre Stomata öffnen in der Nacht unter trockenen Bedingungen ^15,16 minimieren. Die Wurzel Apikalmeristems von P. aphrodite ist in 4E gezeigt. Die Wurzelspitze Zellen erschien eine beträchtliche Anzahl von Kristallen enthalten, die nach dem Schneiden (4E) erhaltene sehr gut waren. Längsschnitte der jungen Blumen Spikes versehen informatIonen über die Architektur der jungen Blumen primordials (4F). Außerdem Kelchblätter, Blütenblätter, labellum und pollinia deutlich von dem Längsschnitt der jungen Blütenknospen identifiziert werden konnten, die eine Differenzierung in dieser 5 mm Blütenknospe (4G) abgeschlossen haben. Beachten Sie, dass Kristalle in den Kelchblättern der jungen Blütenknospen angesammelt wurden. Kurz gesagt, funktioniert dieses Protokoll konsequent Gewebeintegrität zu erhalten und intakte Morphologie ermöglicht anatomische und mögliche zelluläre Studien produziert.

Hybrid-Cut Behält Gewebeintegrität in Getreidekulturen

Wir auch Hybrid-Cut auf Getreide wie Reis, Weizen und Mais getestet, hohem Silica - Anteil ^17,18 enthalten. Wie in 5 gezeigt, wurden die Gewebeintegrität von Querschnitten von Reis, Weizen und Maisblätter wesentlich durch die Hy verbessertebrid-Cut-Verfahren. Xylem, Phloem, Mesophyllzellen, Stomata und bulliform Zellen, die der Blattspreite unkontrolliert ins Rollen Wasserverlust zu vermeiden, wurden aus Abschnitten von Reisblättern eindeutig identifiziert werden. Der Kranz Anatomie, Mesophyllzellen und Gefäßbündel des Maisblatt ^19,20 wurden eindeutig identifiziert. Es war interessant eine hohe Dichte von Stomata auf zu finden sowohl die adaxial und abaxial Seiten Maisblättern (Abbildung 5). Das Verhältnis von adaxial und abaxial Stomata von 0,7 in Mais wurde bisher ²¹ berichtet. Darüber hinaus arbeitete dieses Protokoll auch erfolgreich die detaillierte Morphologie der Zellen von Ährchen aus Reis, Weizen und Mais (Abbildung 6) zu liefern. Ährchen sind dafür bekannt, reichlich Kieselsäure ⁹ enthalten. Normalerweise, das führt zu Schwierigkeiten bei der Durchführung von Gewebe Schnitte.

In Situ Hybridization

Genomic und transkriptomischen Ansätze werden häufig die Funktionen von Genen zu annotieren verwendet. Die Bereitstellung der räumlichen Verteilung der Transkripte der Gene von Interesse in Entwicklungs- oder ökologischen Rahmenbedingungen ist wichtig , neue Einblicke in die möglichen Funktionen der Gene hinzuzufügen. In-situ - Hybridisierung (ISH) entwickelt wurde , Genexpressionsmuster auf der Ebene der Gewebe ¹¹ zu lokalisieren ^22-25. Zusätzlich kann ISH bieten zellulären und in einigen Fällen subzellulären, Auflösung von mRNA Verteilung in mehrzelligen Organismen ^26. Während der ISH, ist RNA und Gewebeintegrität wesentlich zuverlässige räumliche Informationen über das ausgewählte Transkript zu erhalten. Wir testeten ISH das Hybrid-Cut - Protokoll Aktin - Gen (PATC157348) kloniert wurde unter Verwendung der Primer 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'und 5' AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3 'zu bekommen 242 bp PCR - Amplikon Cyclin B1:.. 1 (PATC146999) Genspezifischen codierende Sequenz unter Verwendung der Primer 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'Und 5' ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '327 bp PCR-Amplikon zu erhalten. Nach ISH, Actin und Cyclin B1: 1 - Genexpression wurde in junge und reife Achselknospen überwacht (Abbildung 7). Beide Gene wurden in meristematischen Zellen von ^2. und ^3. Achselknospen ausgedrückt, mit stärkeren Signalen in 3 ^rd Achselknospen detektiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass Hybrid-Cut gute Anatomie behalten und räumliche Genexpressionsmuster liefern.

Abbildung 1: Traditionelle Paraffin Abschnitt verursacht schwere Zerreißen von Gewebe Ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthielt , wurde regelmäßig Mikrotom Schnitte unterzogen.. Arges Reissen der Paraffin Bänder wurde nach traditionellen Mikrotom Schnitte (A) beobachtet . Die Gewebeintegrität und Zellstruktur wurde auch (B) beeinträchtigt werden . Die Pfeile zeigen die starke Abreißen des Gewebeschnitts. Pfeilspitze zeigt die Kristallkörper. Maßstabsbalken 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Hybrid-Cut Schnittverfahren Ein Achselknospe Gewebe wurde in PFA fixiert und Gewebe wurden dehydriert, infiltriert mit Paraffinwachs und in einem Paraffinblock eingebettet. Der Paraffinblock wurde auf eine geeignete Größe (A) getrimmt. Optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) wurde in der Mitte des Kryostaten Stufe (B) aufgetragen. Der Paraffinblock wurde in den Oktober auf dem Kryostaten Stufe angebracht. Bei niedriger Temperatur, der Paraffinblock wurde in den Kryostaten Stufe über OCT (C) eingehalten werden . Gewebeschnitte wurden in der Kryostatkammer bei -16 ° C (D) geschnitten. Maßstabsbalken repräsentieren 0,5 cm (A) und 1 cm (BD). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Hybrid-Cut Verbessert Abschnitt Integrität Ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthielt , wurde auf Hybrid-Cut ausgesetzt sectioning (A) und das Hybrid-Cut - Verfahren hergestellt Abschnitte mit ausgezeichneten Gewebeintegrität (B).. Die Pfeilspitze zeigt die endogene Kristallkörper in der Achselknospe Gewebe eingebettet. Maßstabsbalken 100 um.rget = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Anwendung von Hybrid-Schnitt auf verschiedene Gewebeschnitte von Phalaenopsis - Orchideen Verschiedene Orchidee. Gewebe wurden unter Verwendung der Hybrid-Cut - Verfahren, wie im Längsschnitt Orchideensamen , die im reifen Stadium (A), im Längsschnitt Protocorm (B), Längsschnitt von Protocorm artigen Körpern (PLB) (C), Querschnitt im Schnitt von Blattspreite (D), Längsschnitt Wurzel (E), Längsschnitt der jungen Blumenspitze (F) und Längsschnitt der jungen Blütenknospen (G). Gewebeschnitte wurden durch Hämatoxylin gefärbt. SC, Samenmantel; PB, Proteinkörper; M,meristem; MP, Mutter PLB; DP, Tochter PLB; Ad, adaxial Blattoberfläche; Ab, abaxial Blattoberfläche; St, Stomata; MC, Mesophyll-Zelle; VB, Gefäßbündel; RC, Wurzelkappe; fb, Blütenknospe; Se, Kelchblatt; Pe, Blütenblatt; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, Kallus. Pfeilspitzen zeigen Kristalle. Maßstabsbalken stellen 20 & mgr; m (AE) und 200 & mgr; m (FG). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5:. Hybrid-Cut Behält Blattgewebe Integrität in mehreren Getreidesaaten Vergleich von Blattgewebe der traditionellen Paraffin - Verfahren (linkes Feld) und die Hybrid-Cut - Technik in dieser Studie (rechte Tafel) entwickelt worden ist . Bilder zeigen Blattquerschnitte von Reis, Weizen und Mais. MC, Mesophyll-Zelle; Ph, Bast; St, Stomata; BC, bu lliform Zelle. Die Pfeile zeigen das Abreißen von Gewebeschnitt. Pfeilspitzen zeigen Kieselkörper. Die blaue gestrichelte Kreise zeigen Kranz Anatomie in C4-Mais. Maßstabsbalken 20 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6:. Hybrid-Cut Behält Ährchen Gewebeintegrität in mehreren Getreidesaaten Vergleich der Gewebeintegrität von Ährchen Abschnitte zwischen traditionellen Paraffin und Hybrid-Cut Methoden. Die Pfeile zeigen das Abreißen von Gewebeschnitt. Pfeilspitzen zeigen Kieselkörper. Maßstabsbalken 20 & mgr; m (Reis), und 200 & mgr; m (Weizen und Mais). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7: In - situ - Hybridisierung von Actin und CyclinB1; 1 Expressionsmuster in den Achsel Bud von Phalaenopsis - Orchideen Gewebeschnitten des ^2. Achselknospen und ^3. Achselknospe wurden die Hybrid-Cut - Verfahren hergestellt werden.. Insgesamt 40 ng Actin und CyclinB1; 1 DIG-markierten Sonde wurden für die Hybridisierung verwendet. Die Sense-Sonde wurde als negative Kontrolle verwendet. Die Pfeile zeigen die Fortpflanzungs meristem der Achselknospe. Maßstabsbalken 100 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Pflanzenzellen haben starren Zellwände, zähen Fasern, Kristalle und hohem Wassergehalt, die Gewebe Zerreißen Probleme bei Pflanzengewebe Schnitte verursachen. Obwohl Paraffinbasis Sektionieren häufig für Pflanzengeweben verwendet wird, zerreißen die endogene Kristalle oft das Pflanzengewebe während des Schneidens (Abbildung 1). Aufgrund der von Natur aus hohen Wassergehalt innerhalb der Pflanzenzellen, Kryostat-basierte Schnitte verursacht häufig gebrochene Zellen und rissig Gewebeschnitten.

In der vorliegenden Studie wird eine kombinierte Paraffineinbettung und Kryoschnittes Protokoll Hybrid-Cut genannt wurde entwickelt und gute Qualität Gewebeschnitte wurden erhalten. Dieses Protokoll löst das Problem mit hohem Wassergehalt assoziiert durch Paraffineinbettung Einführen und verringert die Reißwirkung durch während des Schneidens (Abbildung 3) Paraffinwachs bei niedriger Temperatur aushärtet. Daher ist dieses modifizierte Protokoll vorteilhaft entweder über Paraffinbasis Sectioning oder Kryoschneiden Pflanzengewebe Integrität zu bewahren.

Dieses Manuskript zeigt , dass die Hybrid-Cut - Verfahren bewahrt Gewebeintegrität in vielen Geweben von Phalaenopsis - Orchideen wie Achselknospe, Samen und PLB, etc., die ein hohes Maß an Kristallen (Abbildungen 3-4) enthalten. Darüber hinaus ist dieses Protokoll zugänglich Getreidekulturen wie Fortpflanzungsorgane und Blätter von Reis, Mais und Weizen , die mit hohem Siliciumdioxidgehalt (Abbildungen 5-6) enthalten. Vermutlich kann dieses Protokoll angewendet werden, um Pflanzen zu holzig hohe Faser enthält.

In der Regel gründlich Festsetzung Gewebe ist sehr wichtig für Hybrid-Cut. Wir fanden , dass Formaldehyd-Alkohol-saure Säure (FAA) Fixiermittel besser ist als PFA die Gewebeintegrität von einigen widerspenstigen Geweben wie axial Knospen, Wurzeln, etc. Allerdings, PFA funktioniert besser als FAA bei der Erhaltung der RNA - Integrität zu erhalten. Daher wird empfohlen, PFA zu behebenProbe für die in - situ - Hybridisierung (ISH) Arbeit. Das hier beschriebene Protokoll wird für RNA ISH Experiment entworfen. Daher wurden alle Reagenzien hergestellt RNA-Abbau zu vermeiden, durch RNase Kontamination durch DEPC Behandlung beseitigt werden. Wenn Hybrid-Cut Abschnitt ist für anatomische Studien, regelmäßige Umkehrosmose (RO) Wasser und die davon abgeleiteten Puffer oder Reagenzien sind akzeptabel.

Reduktionsprobengröße und der Dicke auf weniger als 3 mm ist für die Infiltration hilfreich. Außerdem sind zunehmende Tauchzeit zur Entwässerung und Infiltration für harte Textur Gewebe notwendig. Begrenzung dieses Protokoll könnte Probleme aufgrund von unzureichender Fixierung verursacht, Dehydrierung und Infiltration der Probe. Daher Einstellung der Verarbeitungszeit für jeden Schritt ist entscheidend für gute Qualität Paraffinblock zu erzeugen. Normalerweise braucht härtere Gewebe längere Bearbeitungszeit als weicher Gewebe.

Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Hybrid-Cut erfolgreich in Kombination wi gearbeitetth ISH räumliche Verteilung der ausgewählten Transkripten (Figur 7) bereitzustellen. Zusammenfassend ist dieses Protokoll für die Untersuchung der Pflanzenanatomie und stellt eine gewebespezifische RNA Karte der ausgewählten Gene nützlich. Zusätzlich kann es andere molekulare Studien wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay, Fluoreszenz - in situ - Hybridisierung (FISH) und Immunfärbungstechniken angewendet werden. Im Ergebnis ist dies eine verbesserte Gewebeschneide Protokoll sowohl nützlich und hilfreich für Forscher in Pflanzengemeinschaften.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embedding Center model EC780-1	CSA
Microtome model RM2255	Leica
Cryostat model CM 1950	Leica
Axio Scope A1 microscope	Zeiss
Murashige & Skoog medium including vitamins	Duchefa Biochemia	M0222.0050
RNase free surface decontaminant	Apex	10-228
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Bio Basic Inc.	D801154
Sodium chloride (NaCl)	MDBio, Inc.	101-7647-14-5
Potassium chloride, crystal (KCl)	J.T. Baker	7447-40-7
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	7778-77-0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	16005
Sodium hydroxide (NaOH)	Showa	19430160
Sulfuric acid (H2SO4)	Sigma-Aldrich	7664-93-9
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	111-30-8
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20)	J.T. Baker	9005-64-5
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100)	J.T. Baker	9002-93-1
Glass scintillation vials	Newastar	DG60805-00020
Desiccator vacuum	Violet Bioscience Inc.	TS-402030
Rotary vane pump RZ2.5	Vacuubrand	36149406
Ethanol	J.T. Baker	64-17-5
Sub-X	Leica Surgipath	3803670	Xylene substitute
Paraplast Plus	Leica Surgipath	39602004	Tissue embedding paraffin
SUPERFROST micro slide glass	Matsunami	S7441
FSC 22 Clear	Leica Surgipath	3801480	Optimal Cutting Temperature compound (OCT)
Xylenes, Purified	Leica Surgipath	3803665
Hematoxylin	Merck	HX305311
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Micromount	Leica Surgipath	3801731	Mounting medium
pGEM T-easy vector	Promega	A1360
Proteinase K	Roche	3115879001
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit	Roche	11175025910
NBT/BCIP stock solution	Roche	11681451001