Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 ⁺ Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Zusammenfassung

Pluripotente Stammzellen haben die Fähigkeit, sich selbst in mehrere Linien erneuern und zu differenzieren, so dass sie eine attraktive Quelle für die Erzeugung von Pankreas-Vorläuferzellen zu machen, die für die Untersuchung von und zukünftige Behandlung von Diabetes verwendet werden kann. Dieser Artikel beschreibt einen vierstufigen Differenzierung Protokoll von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen zu erzeugen entworfen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen). Dieses Protokoll kann auf eine Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzellen (HPSC) Leitungen angelegt werden. Der Ansatz zu Pankreas-Vorläuferzellen erzeugen, ist hESCs zu unterscheiden, genau zu wichtigen Phasen der Pankreasentwicklung modellieren. Dies beginnt mit der Induktion der endgültigen Endoderm, die durch Kultivieren der Zellen in Anwesenheit von Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) und CHIR990210 erreicht wird. Eine weitere Differenzierung und Strukturierung mit Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) und Dorsomorphin erzeugt Zellen ähnlich dem hinteren foregut. Die Zugabe von Retinoicsäure-, NOGGIN, SANT-1 und FGF10 unterscheidet hinteren foregut Zellen in Zellen charakteristisch für Pankreas-endoderm. Schließlich führt die Kombination aus Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamid und NOGGIN zur effizienten Erzeugung von PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ Zellen. Durchflusszytometrie durchgeführt wird, die Expression von spezifischen Markern in wichtigen Phasen der Pankreasentwicklung zu bestätigen. Die PDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 pankreatischen Progenitoren am Ende der Stufe 4 sind in der Lage zur Erzeugung von reifen β - Zellen nach Transplantation in immundefizienten Mäusen und kann weiter unterschieden werden Insulin-produzierenden Zellen in vitro zu erzeugen. Somit ⁺ die effiziente Erzeugung von PDX1 / NKX6-1 ⁺ pankreatischen Vorläufern, wie in diesem Protokoll gezeigt, ist von großer Bedeutung , da sie eine Plattform stellt humane Pankreas - Entwicklung in vitro zu studieren und stellt eine Quelle von Zellen mit dem Potential zur Differenzierung zu β-Zellen, die ev konnteentually zur Behandlung von Diabetes verwendet werden.

Einleitung

Die Prävalenz von Diabetes nimmt und nach dem kanadischen Diabetes Association, wird geschätzt , dass mehr als 11 Millionen Menschen in Kanada sind Diabetiker oder prediabetic, mit 5-10% dieser Personen Typ - 1 - Diabetes (T1D) ¹ mit. T1D ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen verursacht wird, die in den Langerhans-Inseln befinden. Derzeit Personen mit T1D benötigen Insulin exogenen Quellen von ² leben. Trotz der Fortschritte in der Insulintherapie, weiterhin T1D Patienten eine schwierige Zeit haben, ihren Blutzuckerspiegel zu regulieren und auch weiterhin sowohl Hypo- und Hyperglykämie leiden. Eine vielversprechende Behandlungsform wiederherzustellen normoglycemia in T1D die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ist, die verwendet werden könnte , eine unbegrenzte Zufuhr von insulinproduzierenden β - Zellen sowohl in vivo und in vitro ³ zu erzeugen , ^{4, 5, 6, 7. HESCs zu ß-ähnlichen Zellen differenzier könnte es ermöglichen , Diabetes in vitro zu untersuchen, so dass für die Identifizierung neuer therapeutischer Targets für Typ - 2 - Diabetes und Zellen zur Transplantation in T1D Patienten.}

Der erfolgreichste Versuch, Insulin zu erzeugen Zellen aus hES - Zellen in vitro , ist die embryonale Ereignisse zu rekapitulieren , die ⁴ während des Pankreasentwicklung ^{auftreten, 5.} Dabei geht es um die Manipulation von unterschiedlichen Signalwege genau entscheidenden Phasen der Entwicklung der Bauchspeicheldrüse modellieren. Bauchspeicheldrüsenentwicklung beginnt mit der Induktion des definitiven Endoderms, die durch die Expression von CXCR4 und CD117 (c-KIT) ^{8, 9} gekennzeichnet ist. Präzise Regelung von definitive Endoderm Organisation für die Bildung des Darmrohr, erforderlich, die dann anterior-zu-posterior und ventral-dorsal Musterung unterzogen wird. Die dorsalen und ventralen Pankreas Knospen ergeben sich aus der Gegend des hinteren foregut, die die Pankreas- und Duodenal - Homeobox - Gen (Pdx1) zum Ausdruck bringt, die für Pankreas - Entwicklung ¹⁰ notwendig ist. Die dorsalen und ventralen Knospen Sicherung der Bauchspeicheldrüse zu bilden, die dann ¹¹ umfangreiche epithelialen Umbau und Erweiterung erfährt. Engagement für die endokrine und exokrine Linie wird durch die Erzeugung von multipotenten Vorläuferzellen (MPL) begleitet , die zum Ausdruck bringen, unter anderem Faktoren die Transkription Pdx1, Nkx6.1 und PTF1A ^{12, 13.} MPL , die endokrinen und duktalen Zellen werden weiterhin Nkx6-1 zum Ausdruck bringen , während PTF1A Ausdruck abnimmt. Im Gegensatz dazu verlieren exokrinen Linie Zellen expression von Nkx6-1 und PTF1A Ausdruck ¹² erhalten.

Der Transkriptionsfaktor Nkx6-1 hat eine Schlüsselrolle in der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, vor allem während der Differenzierung von endokrinen Vorläuferzellen Zellen zu ß. Wie zuvor beschrieben, Deletion Nkx6-1 zu einer Beeinträchtigung der Bildung von β - Zellen während der Pankreas - Entwicklung ^14. Daher sind sowohl in vitro als auch in vivo insulinproduzierenden β - Zellen zu erzeugen erfordert die effiziente Induktion von Nkx6-1.

Kürzlich entwickelten wir ein Protokoll zur effizienten PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ Pankreas - Vorläufern aus hPSCs erzeugen. Diese HPSC abgeleiteten Pankreas - Vorläufern erzeugen reifen β - Zellen nach Transplantation in immundefizienten Mäusen ^3. Die Differenzierung Protokoll kann in 4 unterteilt werden Stufen charakteristisch: 1) endgültige Endoderm Induktion, 2) hinteren foregut Musterung, 3) Pankreas-Spezifikation und 4) NKX6-1 Induktion. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte des gerichteten Differenzierung.

Protokoll

1. Herstellung von Lösungen und Medien

HINWEIS: Bereiten Sie alle Medien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Medien muss sofort hergestellt und verwendet werden. Reagenz Details sind in der Werkstoff - Tabelle zur Verfügung gestellt.

1. Differenzierung Medien
   1. Bereiten Sie Tag 0 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml Activin A, 10 ⁴ M MTG.
   2. Bereiten Sie Tag 1-2 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 100 ng / ml Activin A, 10 ⁴ M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml Ascorbinsäure.
   3. Bereiten Sie Tag 3-5 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 1% B27, 10 ⁴ M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
   4. Vorbereitung Tag 6-7 Differenzierungsmedium: DMEM mit 1% Glutamin, 1% B27, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM Retinsäure, 50 ng / ml NOGGIN.
      HINWEIS: RetinoicSäure sollte zuletzt zu den Medien hinzugefügt werden und Medien sollten vor Licht geschützt werden oxidativen Abbau ¹⁵ zu verhindern.
   5. Bereiten Sie Tag 8-12 Differenzierung Medium: DMEM mit 1% Glutamin, 1% B27, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM Nicotinamid.
2. Bereiten FACS-Puffer: 10% FBS in PBS, minus Calcium und Magnesium.

2. HESC Differenzierung

HINWEIS: HESC werden aufgetaut, passagiert und erweitert auf bestrahlte embryonalen Maus - Fibroblasten in Gegenwart eines KOSR basierte Medien , ergänzt mit ¹⁶ bFGF. HESCs sind bereit für die Differenzierung, wenn die Zellen 80-95% Konfluenz erreichen. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Kolonien groß sein , mit definierten Grenzen und einer "kuppelartigen" Struktur (1A). Alle Zellkultur wird in Flachboden-Gewebekultur behandelten Platten, beschichtet mit 0,1% Gelatine durchgeführt. Typischerweise werden die Zellen in 6 angebaut oderPlatten mit 12 Vertiefungen, in Medienvolumen von 2 ml oder 1 ml.

1. Am Tag 0 beginnen Differenzierung durch die KOSR basierte Medien mit Tag 0 Differenzierungsmedium ersetzt.
2. An den Tagen 1 und 2, sanft die Platte schütteln alle toten Zellen aus der Monoschicht zu entfernen, bevor Absaugen. Ersetzen Sie mit Tag 1-2 Differenzierung Medien.
3. Am Tag 3 Ernte Zellen für die Durchflusszytometrie. Wenn die Zellen mehr als 90% CXCR4 ⁺ / CD117 ⁺ ausdrücken, gehen 2.4 zu treten.
4. An den Tagen 3 und 5, vorsichtig auf die Platte schütteln alle toten Zellen von der einschichtigen vor dem Absaugen zu entfernen. Ersetzen Sie mit Tag 3-5 Differenzierung Medien.
5. An den Tagen, 6 und 7, mit Tag 6-7 Differenzierung Medien ersetzen.
6. An den Tagen 8, 10 und 12, ersetzen mit Tag 8-12 Differenzierung Medien.
7. Am Tag 13, für die Durchfluss Ernte Zellen Zytometrie PDX1 und NKX6-1 Ausdruck zu bestimmen.

3. Ernte Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

1. Distanzieren Zellen mit1x Handels Trypsinlösung nach dem Protokoll des Herstellers und inkubieren bei 37 ° C für 3 min.
2. Entfernen Sie kommerzielle Trypsin-Lösung und resuspendieren einzelne Zellen in 1000 ul FACS-Puffer mit 30 ul DNase I.
3. Filterzellen unter Verwendung einer 35 & mgr; m Nylon-Mesh-Zelle Sieb und in ein Reaktionsgefäß.
4. Zentrifuge Zellen bei 455 xg für 5 min. Vorbereitung der Zellen für entweder live oder feste Färbung.

4. Die Färbung für die Durchflusszytometrie

1. Ablauf Vorbereitung für Live - Färbung am Tag 3
   1. Die Zellen in 1000 ul FACS-Puffer. Transfer 200 ul (ungefähr 1-3 x 10 ⁵ Zellen) in zwei Vertiefungen einer 96-Well - Platte (für beide ungefärbten und gefärbten Proben).
   2. Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
   3. Fleck mit primär-konjugierte Antikörper, CXCR4: APC und CD117: PE (siehe M aterialien Tabelle) für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.
   4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
   5. Resuspendieren Proben in 100 & mgr; l FACS-Puffer.
   6. Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
   7. Resuspendieren jede Probe werden in einem Gesamtvolumen von 300 bis 500 & mgr; l FACS-Puffer auf 1 ml Mikroröhrchen oder 5-ml-Rundbodenröhrchen.
   8. Führen Proben auf dem Durchflusszytometer ^17. Wenn Proben nicht sofort ausgeführt werden, lagern bei 4 ° C vor Licht geschützt.
2. Ablauf Vorbereitung für feste Färbung am Tag 13
   1. Resuspendieren des Zellpellets in kommerziellen Fixierung / Permeabilisierung Lösung 24 h bei 4 ° C.
   2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 455 g für 5 min. Resuspendieren in 400 ul Perm / Wash-Lösung.
   3. Übertragung von 200 & mgr; l der Probe (etwa 0,5-1 × 10 ⁶ Zellen) zu two Vertiefungen einer 96-Well-Platte (für IgG-Steuerung und PDX1 / NKX6-1 Färbung). Zentrifuge bei 931 × g für 2 min.
   4. Resuspendieren der Zellpellets in 100 & mgr; l Perm / Wash - Lösung Anti-PDX1 und anti-NKX6-1 primären oder Isotyp - Kontrolle - Antikörper (siehe Materialien Tabelle) enthält. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
   5. Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. Resuspendieren Proben in 100 ul Perm / Wash-Lösung.
   6. Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
   7. Resuspendieren der Proben in 100 ul Perm / Wash enthaltenden lichtgeschützt Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 Std.
   8. Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
   9. Resuspendieren Proben in 100 ul Perm / Waschlösung.
   10. Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
   11. Vertreteressen Schritt 4.2.9 und 4.2.10.
   12. Resuspendieren jede Probe werden in einem Gesamtvolumen von 300 bis 500 & mgr; l FACS-Puffer auf 1 ml Mikroröhrchen oder 5-ml-Rundbodenröhrchen.
   13. Führen Proben auf dem Durchflusszytometer ^17. Wenn Proben nicht sofort ausgeführt werden, lagern bei 4 ° C vor Licht geschützt.

Ergebnisse

Effiziente Erzeugung von Pankreas - Vorläufern beruht auf dem Wachstum und Aufrechterhaltung des undifferenzierten durch die genaue Zugabe spezifischer Signalmoleküle während der Differenzierung Protokoll gefolgt Zellen, wie in der schematischen Darstellung in Figur 1A veranschaulicht. Am Tag 0 sollte undifferenzierten Zellen 80-95% konfluent sein und Kolonien sollten definierten Kanten (1A) aufweisen. Während der Stufe 1 wird die Medien erscheinen w...

Diskussion

Erfolgreich Erzeugung NKX6-1 ⁺ Pankreas - Vorläufern aus hPSCs in vitro beruht auf der Verwendung von hochwertigen Kulturen von hPSCs und gerichtet Differenzierung , die genaue Regelung spezifischer Signalwege beteiligt , die wichtige Entwicklungsstadien während der Pankreasentwicklung bestimmen. Obwohl dieses Protokoll kann verwendet werden , robuste Expression NKX6-1 in einer Vielzahl von HPSC Linien zu induzieren , wie zuvor ³ gezeigt, effiziente NKX6-1 Erzeugung die folg...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD  Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419