In - vitro - Methoden zum Vergleich der Zielbindungs und CDC Induktion zwischen Therapeutische Antikörper: Anwendungen in Biosimilarity Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den in vitro - Vergleich von zwei wichtigen funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindungs und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) Induktion. Die Verfahren wurden für eine Seite-an-Seite-Vergleich zwischen Referenz Rituximab und einem Rituximab biosimilar eingesetzt. Diese Assays kann während der Biosimilar Entwicklung oder als Qualitätskontrolle in der Produktion eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Therapeutische monoklonale Antikörper (mAbs) sind für die Behandlung von verschiedenen Pathologien, einschließlich Krebs, relevant. Die Entwicklung von biosimilaren mAbs von Pharmaunternehmen ist eine Marktchance, aber es ist auch eine Strategie zur Erhöhung der Arzneimittelzugänglichkeit und zur Verringerung der Therapiekosten. Die hier beschriebenen Protokolle beschreiben die Auswertung der Zielbindung und CDC-Induktion durch Rituximab in Daudi-Zellen. Diese beiden Funktionen erfordern unterschiedliche Strukturregionen des Antikörpers und sind für den durch Rituximab induzierten klinischen Effekt relevant. Die Protokolle erlauben den Seiten-zu-Seite-Vergleich eines Referenz-Rituximab und ein vermarktetes Rituximab-Biosimilar. Die ausgewerteten Produkte zeigten Unterschiede sowohl bei der Zielbindung als auch bei der CDC-Induktion, was darauf hindeutet, dass es physikalisch-chemische Unterschiede gibt und die Notwendigkeit, die Auswirkungen dieser Unterschiede in der klinischen Einstellung zu analysieren, hervorheben. Die hier berichteten Methoden sind in vitro einfach und kostengünstig/ Em> Modelle für die Bewertung der Aktivität von Rituximab Biosimilars. So können sie bei der Biosimilar-Entwicklung sowie bei der Qualitätskontrolle bei der Biosimilar-Produktion nützlich sein. Weiterhin können die vorgestellten Methoden auf andere therapeutische mAbs extrapoliert werden.

Einleitung

Therapeutische Antikörper sind rekombinante monoklonale Antikörper (mAbs) für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten entwickelt, einschließlich Krebs, Autoimmun- und chronischen Krankheiten, neurologische Störungen und andere ^1. Derzeit hat die FDA-Zulassung in mehr als 40 therapeutischen mAb gewährt, und mehr wird erwartet, dass der Markt in den kommenden Jahren zu erreichen.

Rituximab ist ein hochaffine chimäre monoklonale IgG1 - Antikörper für die Behandlung von CD20 ⁺ B-Zell - Non-Hodgkin-Lymphom zugelassen (NHL), CD20 ⁺ follikulärem NHL, chronischer lymphatischer Leukämie und Gelenkrheumatismus ^{2, 3.} Die Erkennung von CD20, die in B-Zellen überexprimiert wird, die von Rituximab Apoptose induziert; Komplementaktivierung; und antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) ^3. Die Patente dieser Droge in Europa ausgelaufen und in den USA im Jahr 2013 und 2016, beziehungsweise. So weltweit Pharmaunternehmen Rituximab Biosimilars entwickeln. Wie in jedem anderen Medikament für den menschlichen Verzehr, erfordern Biosimilars Zustimmung von Aufsichtsbehörden. Internationale Richtlinien zeigen , dass für mAbs, biosimilarity sollte durch einen Vergleich der physikalisch - chemischen Eigenschaften, Pharmakokinetik, Wirksamkeit und Sicherheit der neuen und Referenzprodukten ⁴ gezeigt werden.

Dementsprechend sind die in solchen Vergleichen verwendeten Methoden müssen die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der mAbs, insbesondere solche mit klinischer Relevanz bewerten. Zu diesem Zweck werden in vitro - Tests zeigen mehrere Vorteile gegenüber den in - vivo - Experimenten (rezensiert in Chapman et al.) , ^5: i) In - vitro - Studien sind empfindlicher auf Unterschiede zwischen dem vorgeschlagenen biosimilar und das Referenzprodukt; ii) in vivo Studien müssen in entsprechenden Arten durchgeführt werden, die für viele mAbs sindnicht-menschliche Primaten; und iii) Da der Wirkmechanismus, der präklinischen Toxikologie und klinischen Wirkungen des Referenzprodukts , sind gut bekannt, in - vivo - Studien mit biosimilars nicht zusätzliche nützliche Informationen liefern. Dementsprechend ermöglicht die Europäische Union Guidance für Biosimilars Kandidaten klinische Studien in - vitro - Daten allein ⁶ basierend auf robustes einzugeben.

Hier präsentieren wir zwei schnelle, wirtschaftliche und einfache Tests , die die biologische Aktivität von Rituximab mit CD20 ⁺ kultivierten Zellen zu bewerten. Diese Assays können als Teil der Vergleichbarkeit Übung für Rituximab-Biosimilar Kandidaten aufgenommen werden.

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Protokoll

1. Bewertung der Zielbindung durch Durchflusszytometrie

1. Herstellung von biologischen Materialien und Reagenzien
   1. Stellen 500 ml RPMI-Kulturmedium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum (H-IFBS) ergänzt.
   2. Kultur Daudi Burkitt-Lymphom (Daudi) Zellen und Daudi GFP ⁺ Zellen unter Verwendung von RPMI und 75-cm ² Kulturflaschen. Pflegen die Kulturen bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchteten Atmosphäre , bis sie ausge 6 - 9 x 10 ⁵ Zellen / ml.
   3. Make 50 ml Färbepuffer durch Verdünnung 1/100 H-IFBS in PBS; Dieser Puffer wird bei 2 stabil - 8 ° C für mindestens einen Monat.
   4. Bereiten Sie die Testlösungen für die Referenz- und Biosimilar-mAb. Macht zehn 1: 2-Reihenverdünnungen (jeweils 500 ul) in Puffer Anfärben, ausgehend von 5 & mgr; g / mL.
   5. Verwenden Färbepuffer Human-IgG (Isotyp-Kontrolle) bis 5 & mgr; g / ml, und PE-Cy5 Maus-anti-human IgG (sekundärer Antikörper) an die con zu verdünnenVom Hersteller vorgeschlagene Zentrierung
   6. 4% Paraformaldehyd in PBS (Fixierungspuffer) vorbereiten.
2. Zielbindung
   1. Sammeln Sie die Daudi und Daudi GFP ⁺ Zellsuspensionen aus den 75-cm ² Kulturkolben und übertragen sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min.
   2. Die Zellen werden durch Zugabe von 5 ml PBS und Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 xg für 5 min gewaschen.
   3. Resuspendieren der Zellen in PBS und Durchführung einer Zellzahl und Lebensfähigkeitsanalyse mit Trypanblau. Verwenden Sie Kulturen mit Zelllebensfähigkeitsstufen ≥ 95% für die Analyse.
   4. Die Zellsuspension auf 4 x 10 ⁶ Zellen / ml mit kaltem Färbepuffer verdünnen.
   5. In 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 50 μl der Zellsuspension auf 100 μl der verschiedenen Testkonzentrationen der Referenz oder biosimilaren mAbs gegeben. Include-Replikate für jede experimentelle Bedingung.
   6. Vorbereiten zusätzlicher Rohre für dieIsotyp-Kontrolle (humanes IgG1 anstelle von Rituximab) und negative Kontrolle (sekundärer Antikörper ohne primäre Antikörper).
   7. Inkubieren bei 4 ° C für 20 - 30 min.
   8. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml PBS und die Zellsuspension bei 400 × g für 5 min bei 10 ° C zentrifugiert. Überstand verwerfen.
   9. Suspendiert die Zellen in 100 & mgr; l des sekundären Antikörpers und Inkubation für 20 - 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt.
   10. Wasche die Zellen zweimal mit PBS und suspendieren sie in 200 ul Fixierungspuffer.
   11. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.
       HINWEIS: Das Signal bleibt mehrere Tage stabil, wenn die Proben bei 4 ° C gelagert und vor Licht geschützt.
3. Datenerfassung
   1. Öffnen Sie zwei Punkt Plots auf einem Arbeitsblatt des Durchflusszytometers Betriebssoftware. Stellen Sie den FSC-A im Vergleich zu FSC-H in der ersten und der FSC-A im Vergleich zu SSA-A in der zweiten. Öffnen Sie ein Histogramm für das PE-Cy5-Kanal.
   2. In dem FSC-A im Vergleich zu FSC-H - Plot, stellt ein Tor (R1) Auswählen Singulett Ereignisse (1A).
   3. Stellen Sie die R1 Bevölkerung in dem FSC-A im Vergleich zu SSA-Einem Punkt-Plot und dann ein neues Gate machen (R2) Auswählen von Zielzellen (1B). Stellen Sie die R2 Bevölkerung in dem PE-Cy5 Intensitätshistogramm der Häufigkeitsverteilung der Zellen anzuzeigen.
   4. Stellen Sie die niedrigere Fluoreszenzintensität (FI) Grenze für den PE-Cy5 - Kanal die negativen und Isotypkontrolle (1C) verwendet wird .
   5. Acquire 10.000 Ereignisse innerhalb R2 aus der Probe mit der höheren Konzentration des Referenzproduktes. FI dieser Probe sollte die höchste erwartete (1C) sein.
   6. Erwerben Sie den Rest der Proben.
   7. Für jede Probe erhalten, die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in dem PE-Cy5-Kanal.
   8. Für die Proben mit der Referenz oder biosimilar mAb, die Berechnung die Differenz zwischen den Proben MFI und der der Isotyp-Kontrolle (ΔMFI).

2. Bewertung von CDC

1. Vorbereitung von biologischen Materialien und Reagenzien
   1. Bereiten Sie Zellkulturmedium und Kultur Daudi und Daudi GFP ⁺ Zellen vor, wie oben beschrieben (Schritte 1.1.1 - 1.1.2).
      HINWEIS: Zusätzlich benötigt der CDC-Assay serumfreies RPMI.
   2. Verdünnen Sie normales menschliches Serum-Komplement (NHSC) 1: 2 mit serumfreiem RPMI. 2,5 ml vorbereiten.
   3. 1 ml wärmeinaktiviertes (30 min / 56 ° C) NHSC 1: 2 mit RPMI verdünnen lassen.
   4. Bereiten Sie Sätze von Testlösungen für die Referenz- und Biosimilar-mAbs in serumfreiem RPMI vor. Mischen Sie zehn Verdünnungen (jeweils 200 μl) von 1 bis 0,025 μg / ml.
2. CDC-Assay
   1. Sammeln Sie die Daudi und Daudi GFP ⁺ Zellen aus den Kulturen und quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit (siehe Schritte 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Bereiten Sie eine Zellsuspension mit 4 x 10 ⁵ Zellen / ml in serumfreiem RPMI vor.
   3. Hinzufügen50 & mgr; l Zellsuspension auf 50 & mgr; l jeder Referenz- oder Biosimilar-mAb-Testkonzentration in 96-well-konischen (V) -Botom-Mikroplatten. Include-Replikate für jede experimentelle Bedingung.
   4. Vorbereiten zusätzlicher Vertiefungen für die Negativkontrolle ( dh ohne mAb), Basal-Todeskontrolle ( dh hitzeinaktiviertes NHSC in Gegenwart von mAb) und Färben einer positiven Kontrolle ( dh Zellen, die 50 μl 70% EtOH ausgesetzt sind).
   5. Inkubieren Sie die Zellen für 20 - 30 min bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchteten Atmosphäre.
   6. Füge 50 μl NHSC (verdünnt 1: 2) zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere die opsonisierten Zellen für 2,5 h bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchteten Atmosphäre. Verwenden Sie Hitze-inaktivierte NHSC in der Basal Tod Kontrolle Brunnen.
   7. Zentrifugieren bei 400 xg für 5 min bei 10 ° C. Den Überstand verwerfen.
   8. Die Zellen werden durch Zugabe von 150 & mgr; l PBS und Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 min bei 400 × g und 10 ° C gewaschen. DiDen Überstand zertrümmern.
   9. Färben Sie die Proben mit 7-Aminoactinomycin (7-AAD), wie zuvor beschrieben ^{7 , 8} .
   10. Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer am selben Tag.
3. Datenerfassung
   1. Öffnen Sie zwei Dot-Plots auf einem Arbeitsblatt der Durchflusszytometer-Betriebssoftware. Setzen Sie diese Plots wie in den Schritten 1.3.1 - 1.3.3 ( Abbildung 2A-B ). Erstellen Sie eine dritte Kurve, die ein Punkt-Diagramm für GFP gegenüber 7-AAD auf der R2-Population ist.
   2. Definieren Sie die adäquaten FI-Grenzwerte mit den Daudi-Zellen, Daudi-GFP ⁺ -Zellen und der Todes-Positivkontrolle ( Abbildung 2C ).
   3. Für jede Probe den Prozentsatz der 7-AAD ⁺ Zielzellen messen. Erwerben Sie mindestens 5.000 Veranstaltungen von R2.
   4. Berechnen Sie die spezifische mAb-induzierte Zytotoxizität durch Subtraktion des Prozentsatzes von 7-AAD ⁺ in der Basal-Todeskontrolle aus dem Prozentsatz, der in den Proben mit unterschiedlich gefunden wirdent Konzentrationen von mAbs (2D).

3. Biosimilarity Analyse

1. Geben Sie die Konzentration und Reaktionswerte in eine Grafik-Software.
2. Erzeugung von Diagrammen und berechnen nicht-lineare Regressionen mit den folgenden Überlegungen: i) die Log-Transformation der mAb-Konzentration als „X“; ii) die variable Steigung mathematische Modell (Y = minimale Antwort + (maximale Reaktion - minimale Antwort) / 1 + 10 ^ ((LogEC ₅₀ -x) * Hill slope)); und iii) begrenzen die unteren Werte auf Null, da die basale Antwort subtrahiert wurde.
   HINWEIS: Die Kurven mit einer symmetrischen S-Form erwartet.
3. Vergleichen Sie die beide nicht-lineare Anpassungen mit einer globalen Passform mit einem F-Test (viele Grafiksoftwareprogramme enthalten diese Funktion).
   HINWEIS: Solche Tests herzustellen als der Nullhypothese , dass die maximale Reaktion, logEC ₅₀ und der Hill - Anstieg das gleiche für die zwei Datensätze sind, die die ÜbereinstimmungenBiologische Frage soll behandelt werden.

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Ergebnisse

Unter Verwendung der oben beschriebenen Protokolle, und die Zielbindungs ​​CDC Induktion von Referenz Rituximab wurden parallel mit denen einem biosimilar Rituximab hergestellt und im Handel erhältlich in Asien verglichen.

In Daudi - Zellen, CD20 in einer konzentrationsabhängigen Weise (Figur 1D) gebunden beide mAbs. Nicht-lineare Regressionen von Bindungsdaten zeigten ein R ² von 0,978 und 0,...

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Diskussion

Der Patentablauf eines therapeutischen mAb fördert die Entwicklung von Biosimilars. So besteht ein Bedarf an einfachen Methoden, die Unterschiede in den klinisch relevanten Aktivitäten dieser Produkte identifizieren können. CD20 ⁺ kultivierte Zellen wurden für die Bewertung von zwei wichtigsten funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindung und CDC-Induktion eingesetzt. Die frühere Aktivität erfordert die Erkennung von CD20 durch die Fab-Region des mAb, während letztere hauptsächlich von der W...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.