Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine schnelle Gleichgewichtsdialyse (RED) Methode zur Messung der Arzneimittelbindung an den Fall aus pulmonalen Tuberkuloseläsionen und Hohlräumen. Das Protokoll wird auch mit einer schaumigen Makrophagen-abgeleiteten Matrix verwendet, die ein wirksames Surrogat zum Fall ist.

Zusammenfassung

Die Tilgung der Tuberkulose-Krankheit erfordert Medikamentenregimen, die die Mehrfachschichten komplexer Lungenläsionen durchdringen können. Die Arzneimittelverteilung in den käsigen Adern von Hohlräumen und Läsionen ist besonders wichtig, weil sie Subpopulationen von drogenverträglichen Bakterien, die auch allgemein als persisten bezeichnet werden, beherbergen. Bestehende Methoden zur Messung der Arzneimittelpenetration bei Tuberkulose-Läsionen beinhalten kostspielige und zeitaufwändige in vivo- pharmakokinetische Studien, gekoppelt an bioanalytische oder bildgebende Verfahren. Die In-vitro- Messung der Arzneimittelbindung an Fallmakromoleküle wurde als Alternative zu solchen Techniken vorgeschlagen, da diese Bindung die passive Diffusion von Arzneimittelmolekülen durch den Fall beeinträchtigt. Die schnelle Gleichgewichtsdialyse ist ein schnelles und zuverlässiges System zur Durchführung von Plasmaprotein- und Gewebebindungsstudien. In diesem Protokoll haben wir eine schnelle Gleichgewichts-Dialyse (RED) -Gerät verwendet, um die Arzneimittelbindung an Homogenate von caseum zu untersuchen, das excis istAus den Läsionen und Hohlräumen von Tuberkulose-infizierten Kaninchen. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Surrogatmatrix aus lipidbeladenen THP-1-Makrophagen erzeugt, um anstelle von caseum zu verwenden. Dieser Fall / Surrogat-Bindungstest ist ein wichtiges Instrument in der Tuberkulose-Wirkstoffforschung und kann angepasst werden, um die Arzneimittelverteilung bei Läsionen oder Abszessen, die durch andere Krankheiten verursacht werden, zu untersuchen.

Einleitung

Die Behandlung der pulmonalen Tuberkulose-Krankheit erfordert eine effektive Verteilung der Medikamente in verschiedene Arten von Läsionen. Nekrotische Läsionen und Hohlräume enthalten käsige Zentren, die Subpopulationen von drogenverträglichen oder "persistenten" Bakterien beherbergen. ^{1 , 2} Die Kavitationserkrankung ist mit minderwertigen Heilungsraten und schlechter Prognose verbunden. ^{3 , 4} Frühere Studien haben gezeigt, dass mit Hilfe von quantitativen und bildgebenden Techniken die Fähigkeit, in den Fall zu dringen, signifikant von einer Medikamentenklasse zur anderen variiert. ^{5 , 6} Diese Methoden erfordern jedoch die Verwendung von Tierinfektionsmodellen, die langsam und langwierig sind. Ein in vitro- Assay, der die Arzneimittelbindung an ex vivo caseum misst, wurde entworfen. Diese Bindung wurde gefunden, um umgekehrt mit der Arzneimittelpenetration in käsigen Granulomen zu korrelieren und ist daherAls prädiktives Werkzeug verwendet. ⁷

Gleichgewichtsdialyse gilt als der Goldstandardansatz für Plasmaprotein-Bindungsstudien. Die RED-Vorrichtung (Rapid Equilibrium Dialyse) bietet ein schnelles, einfach zu bedienendes und zuverlässiges System zur Durchführung solcher Assays. ⁸ Das Gerät besteht aus zwei Komponenten: Einweg-Einweg-Einsätze bestehend aus 2 Kammern, die durch einen vertikalen Zylinder mit halbdurchlässiger Membran getrennt sind; Und wiederverwendbare Basisplatten, die bis zu 48 Einsätze zu einem Zeitpunkt aufnehmen können. Die Dialysemembran hat einen 8 kDa-Molekulargewichts-Cutoff (MWCO), der sich ideal für Arzneimittel-Makromolekül-Bindungsstudien eignet. Das hohe Flächen-zu-Volumen-Verhältnis des Membranabteils ermöglicht eine schnelle Dialyse und Äquilibrierung. Sowohl die Einsätze als auch die Basisplatte wurden für eine minimale unspezifische Bindung validiert. Die Kombination der RED-Vorrichtung mit bioanalytischen Techniken liefert genaue Schätzungen der ungebundenen Fraktionen von Arzneimitteln in pLASMA. ^{8, 9}

Obwohl ursprünglich Plasmaproteinbindung zu messen, das RED-Gerät wird in mehreren Gewebebindungsstudien verwendet worden, unter Verwendung von Homogenaten. ^{10, 11} in diesem Protokoll messen wir Medikament caseum Bindung, die nekrotische Ablagerungen von den nekrotischen Läsionen und der Hohlräume tuberculosis infizierten Kaninchen ausgeschnitten. Die azelluläre und nicht-vaskuläre Natur des käsigen Materials macht es leicht in eine homogene Suspension zu homogenisieren, die mit dem Assay kompatibel ist.

Da caseum ist mühsam herzustellen und schwer zu bekommen, wird das Protokoll auch für die Verwendung mit einer Surrogat-Matrix validiert, die von schaumigen Makrophagen hergestellt wird. THP-1 Monozyten abgeleiteten Makrophagen werden mit Ölsäure induziert, um mehrere Lipidkörper ansammeln, die sie geben ihre ‚schäumenden‘ Aussehen. Diese Lipid-beladenen Zellen werden geerntet undverarbeitet, um eine Matrix zu erzeugen, die wir als Ersatz verwenden, um caseum. Diese Studie hat gezeigt , dass die Drogen Bindung an diese Surrogat Matrix korreliert gut mit zu caseum Bindung, effektiv den in vivo nachahmt Prozess, die Arzneimittelpenetration in dem käsigen Kern von Granulomen und Hohlräumen verhindert.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Use Committee des NIAID (NIH), Bethesda, MD durchgeführt. Alle Studien mit M. tuberculosis wurden in einem Labor mit Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt.

1. Kaninchen Infektionsmodell und Caseum Sammlung

1. Infect Neuseeland weiße Kaninchen mit M. tuberculosis einen nasen nur Aerosol - Belichtungssystem unter Verwendung von wie oben beschrieben. ^{12, 13} erlauben die Infektion für 12-16 Wochen fortzuschreiten. Sedate die Kaninchen, die mit 35 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin intramuskulär, euthanize die Kaninchen mit 0,22 ml / kg Pentobarbital-Natrium und Phenytoin-Natrium intravenös und mit den necropsies fortzufahren.
2. Mit einer Pinzette und Skalpell entfernen Lunge aus der Brust cavity. Von jedem Lungenlappen, seziert aus einzelnen Hohlräumen und großen nekrotischen Granulome mit einem Skalpell. Vorsichtig abkratzen caseum aus dem Hohlraum und Granulom Wänden. Wiegen, aufnehmen und speichern Proben in 2 ml Röhrchen mit Schraubverschluss bei -20 ° C bis zur Verwendung.
3. Gamma-Bestrahlung der infektiösen caseum Proben bei 3 MegaRad auf Trockeneis sie uninfectious und sicher für den Einsatz in einem BSL-2 Labor zu machen.

2. In - vitro - Erzeugung von Caseum Surrogate von THP-1 - Zellen

1. Wachsen THP-1 Monozyten in RPMI 1640-Medium (2 mM L-Glutamin und 10% fötales Rinderserum) in T175 Zellkulturflaschen (80 ml / Kolbe). Inkubieren der Kolben in einer 5% CO ₂ -Atmosphäre bei 37 ° C für 3-4 Tage.
2. Zentrifugieren der Kultur aus einer T175-Kolben in zwei 50 ml konischen Röhrchen bei 150 × g für 5 min. Überstand verwerfen und suspendiert das Pellet in 10 ml RPMI 1640 Medien.
3. Pipette 5 & mgr; l dieser Kultur in ein 1,5 ml-Röhrchen mit 45 & mgr; l tRypan blau. Gründlich mischen durch Pipettieren. Übertragung 10 & mgr; l zu einem Hämozytometer und zählen die Anzahl der lebensfähigen THP-1-Monozyten (ungefärbten) ein Lichtmikroskop (Vergrßerung 10X) verwendet wird. Berechnen Sie die Anzahl der lebenden Zellen pro ml der Kultur. Verdünne mit RPMI - Medium auf die Enddichte von 1,25 x 10 ⁶ Zellen / ml.
4. Last 40 ml der Kultur auf einer großen Zellkulturplatte (50 x 10 ⁶ Zellen / Platte). Werden 40 & mgr; l von 100 & mgr; M PMA (Phorbol-12-Azetat-myristate13 in Ethanol hergestellt) und lassen Zellen über Nacht in dem Inkubator haften.
   HINWEIS: Endgültige Konzentration von PMA ist 100 nM.
5. Verdünnte reine Ölsäure (OA) (0,89 g / ml) in Ethanol zu einer Konzentration von 0,1 M (dh 31,7 uL OA in 968,3 & mgr; l Ethanol). Man verdünnt diese Lösung in frischem vorgewärmtem RPMI Medium auf eine Konzentration von 10 mM. Man verdünnt diesen OA Suspension auf 0,4 mM (endgültige Arbeitskonzentration) in RPMI-Medium vorgewärmt auf 37 ° C.
6. Entfernen Sie die vorhandenen Medien und nichtAdhärierten Zellen aus den Zellkulturplatten und fügen sanft 40 ml 0,4 mM OA zu den THP-1-Makrophagen (THP-M) hinzu. Inkubieren bei 37 ° C im Inkubator über Nacht.
7. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung, um das Vorhandensein zahlreicher Lipidkörper-Einschlüsse in jedem THP-M visuell zu bestätigen. Entfernen Sie alle RPMI-Medium aus den Zellkulturplatten und waschen Sie die adhärenten Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Verwendung einer 50 ml serologischen Pipette.
   HINWEIS: Lipidkörper erscheinen als kleine, klare, sphärische Strukturen im Cytoplasma des THP-M.
8. Füge 40 ml 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS zu jeder Platte hinzu. 15 min bei 37 ° C inkubieren.
9. Lösen Sie die schaumigen Makrophagen (FM) durch wiederholtes Pipettieren über die Oberfläche der ganzen Platte mit einer 10-mL serologischen Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 50-ml-Kegelrohr und drehen Sie sie bei 150 xg für 5 min.
10. Das Zellpellet wird in 10 ml PBS (dritter PBS-Wäsche) a resuspendiertNd Übertragung auf eine vorgewogene 15-ml-konische Rohre. Spinne bei 150 xg für 5 min. Den Überstand sorgfältig mit einer serologischen Pipette abspülen und entsorgen.
11. Betrachten Sie die FM-Pellets zu 3 Gefrier-Tau-Zyklen, um die Zellen zu lysieren und sie bei 75 ° C für 20-30 min zu inkubieren, um Proteine ​​in der Matrix zu denaturieren. Die Pellets bei -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.

3. Rapid Equilibrierung Dialyse (RED) Assay

1. 10 mM Stammlösungen aller Testverbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereiten. Verdünnen Sie zu 500 μM Arbeitslösungen in DMSO vor jedem Assay.
2. Wiegen Sie die Röhre mit dem Fallum Surrogat Pellet. Subtrahiere das Gewicht des leeren Rohres, um das Gewicht des Pellets allein abzuleiten. Füge 2-3 Metallperlen pro Röhrchen hinzu und unter Verwendung eines Gewebehomogenisators bei 1.200 Hüben / min für 1 min den Fallum oder die Surrogatmatrix in PBS (1: 9 w / v) zu stören, um 10x verdünnte Suspension jeder Matrix zu erreichen.
3. Spike 6,5 μl der 500ΜM-Lösung der Testverbindung in 643,5 & mgr; l des Homogenats, um die Endkonzentration von 5 & mgr; M (& le; 1% DMSO) zu erreichen und zu verwirbeln.
4. Legen Sie die ROT-Einsätze in die Grundplatte. Füge 200 μl der drogenspiked Matrix in die Spenderkammer (roter Ring) jedes RED-Inserts und 350 μl PBS in jede Empfängerkammer ein. Vorbereiten von 3 Einsätzen für jede Testverbindung (dreifache Proben). Siegelplatte mit einer Klebeplatte abdichten und bei 37 ° C auf dem Thermomixer bei 200 U / min (1 xg) für 4 h inkubieren.
5. Nach der Inkubation mischen Sie den Inhalt der Spender- und Empfängerkammern vorsichtig 2-3 mal auf und ab. 20 μl Aliquote von Homogenat aus den Spenderkammern pipettieren und 20 μl sauberes PBS in ein 1,5 mL Röhrchen (1: 1) zugeben. In ähnlicher Weise pipettieren Sie 20 μl Aliquots von PBS-Proben aus den Empfängerkammern und fügen Sie 20 μl sauberes Homogenat (Matrix-Matching) hinzu. ⁸
   HINWEIS: Matrix-Matching eliminiert die neFür 2 separate Kalibrierkurven (in Homogenat und PBS) für die quantitative Analyse. Der Inhalt der Spenderkammer kann im Laufe der Zeit sedimentieren. Den Inhalt vor dem Entfernen von Aliquoten vorsichtig mischen.

4. LC-MS Quantifizierung und Datenanalyse

1. Fügen Sie 160 μl 1: 1 Methanol: Acetonitril mit 500 ng / ml Diclofenac oder 10 ng / ml Verapamil (interner Standard) zu jedem Röhrchen hinzu und verwirbeln Sie, um Proteine ​​auszufällen. Zentrifugieren bei 10.000 xg für 5 min, um den Niederschlag zu sedimentieren und die Überstände in 96-Well-Tiefbrunnen-Platten zur Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) zu überführen. ⁷
2. Erstellen Sie Kalibrierkurven von 1-1.000 nM für jede Testverbindung, während Sie die gleiche Matrixzusammensetzung wie die obigen Proben halten. Quantifizieren Sie die Konzentration der Testverbindung in Proben aus den Spender- und Empfängerkammern nach einer LC-MS-Methode.
3. Berechnen Sie den ungebundenen Bruch ( f _u ) of die Droge in verdünnter Matrix unter Verwendung von Gleichung 1. Berechne des f _u in unverdünnter Matrixgleichung unter Verwendung von 2 (D = Verdünnungsfaktor von 10). ¹⁴
   
   
4. Überprüfen Sie die Wiederherstellung (Massenbilanz) jeder Verbindung unter Verwendung von Gleichung 3 zu identifizieren Verbindungen mit Stabilität / Stoffwechsel / nicht-spezifische Bindungsprobleme.
   HINWEIS: Wiederherstellung fällt typischerweise zwischen 70% und 130%. ¹⁵
   

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll haben wir Hunderte von Tuberkulose Medikament Entwicklung Verbindungen für ihre vorhergesagte Effizienz bei Eindringen Fallum getestet. Abbildung 1 zeigt die Grundkonzepte des ROTEN Assays. Die Dialysemembran der RED-Inserts ermöglicht es, dass ungebundene kleine Moleküle vom Spenderbrunnen zum Empfänger gut diffundieren und schließlich ein Gleichgewicht zwischen beiden Kompartimenten erreichen. Kleine Moleküle, die an Makromoleküle wie Protei...

Diskussion

Pulmonary nekrotische Läsionen und Hohlräumen bei Tuberkulose-infizierten Patienten enthalten Subpopulationen von Bakterien, die zur medikamentösen Behandlung recalcitrant sind. Die käsigen Kerne dieser Strukturen sind besonders verantwortlich, diese persisters in einer extrazellulären Umgebung für die Beherbergung. ¹⁶ günstige Verteilung von antibakteriellen Mitteln in diese entfernten Standorte wird angenommen , dass eine wichtige Determinante der Tuberkulose Wirksamkeit von Medikamenten...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White Rabbits	Covance	-
HN878 Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution	Virbac	710101
THP-1 monocytic cell line	ATCC	ATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented	Fisher Scientific	T-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Oleic acid	Fisher Scientific	ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate	Fisher Scientific	PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box	Fisher Scientific	PI-89809
Pierce RED insert removal tool	Fisher Scientific	89812
Adhesive plate seal	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)	Life Technologies	10010-049
DMSO	Sigma	472301
Acetonitrile	Sigma	34998
Methanol	Sigma	34860
Verapamil hydrochloride	Sigma	V4629
Diclofenac sodium salt	Sigma	93484
Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher Scientific	15-250-061
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers	Fisher Scientific	22-600-100
Upright Light Microscope	Leica	DM1000
Binary Liquid Chromatography system	Agilent	1260	Multi-compenent
Mass spectrometer	AB Sciex	4000