Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Zusammenfassung

Die Beurteilung der synaptischen Proteinzusammensetzung und -funktion stellt eine wichtige Herausforderung in der Neurowissenschaft dar. Allerdings ist es nicht einfach, die Neurotransmission, die in Synapsen auftritt, zu bewerten, da sie durch dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen und Phosphorylierungsereignisse stark reguliert wird. Dementsprechend ist es, wenn eine Methode verwendet wird, um synaptische Transmission zu studieren, ein wichtiges Ziel, diese vorübergehenden physiologischen Modifikationen zu bewahren. Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt. Mit anderen Worten beschreibt das Protokoll eine biochemische Methodik zur Durchführung der Proteinanreicherung aus präsynaptischen, postsynaptischen und extrasynaptischen Kompartimenten. Zuerst werden Synaptosomen oder synaptische Terminals aus Neuronen gewonnen, die alle synaptischen Kompartimente mit einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten enthalten. Bemerkenswert ist die Qualität dieser ersten synaptischen Membranvorbereitung cRituell Anschließend wird die Isolierung der verschiedenen subsynaptischen Kompartimente mit leichter Solubilisierung unter Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei unterschiedlichen pH-Bedingungen erreicht. Dies ermöglicht eine Trennung durch Gradienten- und Isopycnic-Zentrifugationen. Schließlich wird die Proteinanreicherung an den verschiedenen subsynaptischen Kompartimenten ( dh vor-, post- und extrasynaptischen Membranfraktionen) mittels Immunoblotanalyse mittels gut charakterisierter synaptischer Proteinmarker ( dh SNAP-25, PSD-95 und Synaptophysin, ), So dass eine direkte Bewertung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins ermöglicht wird.

Einleitung

Die synaptische Übertragung beruht auf der physischen Integrität der Synapse, ein Konzept, das schon 1897 von Foster und Sherrington ¹ vorgesehen war. Daher ist das Verständnis der Verteilung der Schlüsselneurotransmission-Komponenten ( z. B. Ionenkanäle, Rezeptoren usw. ) unerlässlich, um die synaptische Funktion sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Zuständen aufzuklären. Die Elektronenmikroskopie (EM) hat enorm zur aktuellen ultrastrukturellen Vorstellung von Prototypen des zentralen Nervensystems (ZNS) beigetragen. Auf diese Weise hat EM die Unterschiede zwischen prä- und postsynaptischen Dichten, die durch eine Spalte mit einem ziemlich gleichmäßigen Abstand (~ 25 nm) getrennt sind, fein festgelegt. Interessanterweise weist die postsynaptische Apparatur eine relativ kontinuierliche, elektronendichte Verdickung unterhalb ihrer Plasmamembran, die sogenannte postsynaptische Dichte oder PSD ^{2 auf} . Umgekehrt, bei der präsynaptischen Apparatur, eine bemerkenswerteE diskontinuierliches Cytomatrix-Netzwerk ist gerade unterhalb der Plasmamembran angeordnet, was für die Ausrichtung und das Andocken von synaptischen Vesikeln auf die aktive Zone der Plasmamembran wesentlich ist. Daher stellt EM den goldenen experimentellen Ansatz dar, um die Verteilung von Proteinen innerhalb strukturell konservierter ZNS-Synapsen zu untersuchen. Jedoch ist die Information, die durch Elektronenmikrographien bereitgestellt wird, statisch. In der Tat zeigen akkumulierende Beweise, dass in vivo Synapsen extrem dynamisch sind und so dramatische strukturelle Veränderungen bei anhaltender synaptischer Übertragung erleben. Darüber hinaus können sich die Morphologie und Zusammensetzung der Synapsen in verschiedenen ZNS-Regionen und bei der Entwicklung, Reifung, Alterung und der Entwicklung neuropathologischer Zustände ändern. Insgesamt stellt ein Protokoll zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten in physiologischen Zuständen gehören, ein wertvolles Werkzeug für eine umfassendere Untersuchung der synaptischen Funktion dar.

Hier beschreiben wir diese Art von komplementärem experimentellen Ansatz, der die präparative biochemische Anreicherung der verschiedenen synaptischen Membranfächer ermöglicht - nämlich extra-, vor- und postsynaptische Membrandomänen. Dieses Membranfraktionierungsverfahren, das zuerst von Philips et al . (2001) ⁴ beruht auf einer pH-Verschiebung, die die in der prä- und postsynaptischen Apparatur auftretenden adhäsiven Wechselwirkungen schwächt. Zunächst ist es durch die Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei pH 6,0 möglich, den Adhäsionsübergang zu erkennen, der die prä- und postsynaptische Apparatur hält und der von der extrasynaptischen Membrandomäne gehalten wird, die solubilisiert ist und somit aus den synaptischen Kontakten extrahiert werden kann. Anschließend schwächt die Erhöhung des pH-Werts von 6,0 auf 8,0 in Gegenwart von milden Reinigungsmitteln die Festigkeit des adhärenten Übergangs, der die präsynaptische aktive Zone fest an die postsynaptische Dichte gebunden hält. Daher ist das präsynaptische Fach soLubilisiert und kann von der postsynaptischen Dichte getrennt werden, die meistens erhalten bleibt, weil die Konzentration des verwendeten Waschmittels ihre Solubilisierung nicht begünstigt ⁴ . Interessanterweise kann die Fraktionierungseffizienz, eventuell höher als 90%, durch verschiedene subsynaptische Marker bestätigt werden: i ) synaptosomal assoziiertes Protein 25 (SNAP-25) aus der präsynaptischen aktiven Zone; Ii ) Synaptophysin aus der extrasynaptischen Fraktion ( dh außerhalb der aktiven Zone und einschließlich Mikrosomen); Und iii ) postsynaptisches Dichteprotein 95 (PSD-95), aus der postsynaptischen Dichte. Bemerkenswert ist, dass diese Hirnmembranfraktionierungsmethode erfolgreich eingesetzt wurde. Dementsprechend war es möglich, die subsynaptische Lokalisierung verschiedener Rezeptoren, wie alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren ⁵ , Adenosin-A ₁ -Rezeptor (A ₁ R) ⁶ präzise zu bestimmen ,Adenosin-A _2A -Rezeptor (A _2A R) ⁷ , Adenosintriphosphat (ATP) P2-Rezeptoren ⁸ , Nikotinacetylcholinrezeptor-Untereinheiten ⁹ und Parkinson-assoziierter Rezeptor GPR37 ¹⁰ . Eine Reihe von Beschränkungen kann jedoch eine angemessene Beurteilung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins behindern. So beschreiben wir in diesem Verfahren nicht nur das gesamte Protokoll vollständig, sondern auch einige kritische Punkte, wie die relativ große Menge an benötigtem Gewebe, die geringe Proteinausbeute und die zwingende Anforderung, die Effizienz zu validieren Jede Trennung vor der Durchführung des definierten Experiments.

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Protokoll

Alle tierversuchenden Verfahren wurden von der Universität von Barcelona Ausschuss für Tiernutzung und Pflege (CEEA) unter Einhaltung der Richtlinien, die im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ¹¹ und nach der Europäischen Gemeinschaft, das Gesetz 86/609 / CCE, FELASA und ARRIVE Richtlinien. So sind Mäuse in Standardkäfigen untergebracht, mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser und werden unter kontrollierten Standardbedingungen (12 h dunkler / leichter Zyklus ab 7:30 Uhr, 22 ° C Temperatur und 66% Feuchtigkeit) gehalten.

1. Erhalten von Maus-Gehirn-Synaptosomen mit einem diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten

Anmerkung: Diese Methode wurde zuvor gemeldet ¹⁰ .

1. Bereiten Sie frischen Isolationspuffer (IB), pH 7.4; 2 M Saccharose; 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl ₂ ; Und 0,1 mM CaCl & sub2 _; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis.
2. SaFünf Mäuse durch zervikale Versetzung beenden Entkapseln und schnell das Gehirn eines jeden Tieres entfernen. Die Hirnregion von Interesse (dh den Hippocampus, 0,25-0,35 g frisches Gewebe) zerlegen und in eine 5 mL Potter-Elvehjem-Glasröhre auf Eis mit 1 mL IB geben.
3. Homogenisieren des Gewebes mit einem Homogenisierungsrührer (10 Hübe bei 700-900 Umdrehungen pro Minute), vorzugsweise in einem Eisbad, um die Probenwärme auszuschließen.
4. Das homogenisierte Gewebe (1 ml) in ein 15 ml-Röhrchen geben, das 6 ml 2 M Saccharose und 2,5 ml 0,1 mM CaCl ₂ bei 4 ° C enthält. Mischen Sie langsam durch Umkehren der Röhre.
   Anmerkung: Die Zugabe von Calcium ist wesentlich für die Aufrechterhaltung der adhäsiven Wechselwirkungen zwischen Organellen und damit zur Erhaltung der Struktur der verschiedenen "Dichten".
5. Die Lösung wird in ein 12-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und langsam 2,5 ml 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl ₂ auf die Oberseite jedes Röhrchens gegeben, um den Saccharosegradienten zu bilden.
   Hinweis: Beschriftung der Position oF die Gradientenschnittstelle auf dem Zentrifugenröhrchen mit einer permanenten Markierung.
6. Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln.
7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 3 h bei 100.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge. Füllen Sie den Rotor vollständig mit allen Stahlträgern aus (ggf. leer).
8. Verwerfe die oste Schicht, die Myelin enthält. Mit einer Pasteurpipette den weißen Ring zwischen der 1,25-M- und 1-M-Saccharose-Interphase entsprechend der Synaptosomenfraktion sammeln.
9. Verdünnen Sie die Synaptosomen mit 9X ihr Volumen mit IB in einem Zentrifugenröhrchen.
10. Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln.
11. Die Röhrchen für 30 min bei 15.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge zentrifugieren.
12. Den Überstand verwerfen und thE-Pellet mit 1,1 ml IB-Lösung. 100 μl dieser synaptosomalen Lösung sammeln und 5 min bei 11.000 x g und 4 ºC zentrifugieren.
13. Das synaptosomale Pellet in 5% igem Natriumdodecylsulfat (SDS) resuspendieren und diese Probe bei -20 ºC aufbewahren.
    Anmerkung: Diese Probe entspricht der gesamten Synaptosomenfraktion für die weitere Western-Blot-Analyse. Die verbleibende synaptosomale Fraktion (~ 1 ml) kann entweder bei -20 ºC bis zur Verwendung oder zur nachfolgenden subynaptischen Fraktionierung eingefroren werden. Die Synaptosomen oder gereinigten Synapsen repräsentieren zwischen 1 und 2% des gesamten Hippocampusvolumens ¹² .

2. Vor-, Post- und Extrasynaptische Isolation

1. 2x frischen Solubilisierungspuffer, pH 6,0, vorbereiten; 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0; Solubilisierungspuffer, pH 8,0; Und 0,1 mM CaCl & sub2 _; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis.
   Hinweis: Der pH-Wert dieser Lösungen sollte genau seinY angepasst, um eine gute subsynaptische Fraktionierung zu erreichen.
2. Die 1-ml-resuspendierte synaptosomale Fraktion (siehe Schritt 1.12) mit 5 ml 0,1 mM CaCl ₂ langsam verdünnen.
3. Füge das gleiche Volumen (5 ml) eiskaltes 2x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, hinzu und inkubiere für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis.
   Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 6,0 alle Plasmamembranproteine ​​löst, bewahrt es Proteine ​​innerhalb der synaptischen Kontakte oder Übergänge ( dh vor- und postsynaptische Strukturen) ⁴ .
4. Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit äquivalenten Volumina von 0,1 mM CaCl ₂ und 2x Solubilisierungspufferlösung, pH 6,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlträger und mit ihren Verschlussdeckeln.
5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge. Der entstehende Überstand stellt die extrasynaptische Fraktion dar,Und das Pellet entspricht den synaptischen Übergängen ( dh vor- und postsynaptischen Fraktionen).
6. Konzentrieren Sie den Überstand, der die extrasynaptische Fraktion enthält, auf ein endgültiges 200 & mgr; l Volumen unter Verwendung eines 15 ml 10 k Filterrohrs, das bei 4000 × g und 4 ºC zentrifugiert wurde.
7. Die resultierende konzentrierte extrasynaptische Fraktion (200 ul) mit 5 Volumina (1 ml) vorgekühltem (-20ºC) Aceton über Nacht bei -20ºC abfließen.
8. Am nächsten Tag wird die extrasynaptische Fraktion für 30 min bei 18.000 x g und -15 ° C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation den Acetonüberstand verwerfen und das Pellet trocknen, um jegliche Spur von Aceton zu entfernen.
9. Schließlich wird das Pellet, das die extrasynaptischen Proteine ​​enthält, mit 200 & mgr; l 5% SDS resuspendiert. Sonde das Pellet, falls erforderlich.
10. Ohne sie zu stören, das Pellet sorgfältig mit den vor- und postsynaptischen Fraktionen mit 2 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, abwaschen. Verwerfe den Puffer
11. ResuspendierenDas Pellet mit 10 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 8,0, unter Verwendung einer Glaspasteurpipette.
    Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 8,0 die präsynaptische Spezialisierung löst, bewahrt es die unlösliche postsynaptische Dichte ⁴ .
12. Inkubieren Sie die Suspension für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis.
13. Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit 1x Solubilisierungspufferlösung, pH 8,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlstützen und mit ihren Verschlussdeckeln.
14. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge; Der resultierende Überstand entspricht der präsynaptischen Fraktion und dem Pellet der postsynaptischen Fraktion.
15. Verarbeiten Sie den Überstand, der die präsynaptische Fraktion enthält, wie in den Schritten 2.6-2.9 beschrieben.
16. Resuspendieren des Pellets mit postsynaptischen Fraktion mit 200 μl 5% SDS. Sonde das Pellet, ichF erforderlich

3. Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot, um die Membranfraktionierung zu validieren

1. Bestimmen Sie die Menge an Protein in jeder Fraktion ( dh die Gesamt-, Extra-, Pre- und Post-Synaptic-Fraktionen) unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Protein-Assays.
2. Nehmen Sie 20 μg Protein aus jeder Fraktion und verdünnen Sie es auf ein Endvolumen von 50 μl in SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenpuffer. 5 min bei 100 ºC kochen.
3. Trennen Sie die Proteine ​​durch SDS-PAGE-Elektrophorese 10%, mit einem 4% konzentrierenden Gel unter reduzierenden Bedingungen. Elektrophorese bei konstanter Spannung von 80 V, bis der Farbstoff in das untere Gel eintritt und dann die Spannung auf 120 V erhöht.
4. Übertragen Sie die Proteine ​​auf eine PVDF-Membran und blockieren Sie mit IB-Blockierlösung für 45 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln.
5. Inkubieren der Membran über Nacht bei 4 ºC mit dem angegebenen primären Antikörper ( dh anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, Anti-Synaptophysin oder Anti-GPR37) verdünnt in IB-Blockierungslösung unter kontinuierlichem Schütteln.
6. Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen primären Antikörper zu eliminieren.
7. Inkubieren mit dem angegebenen sekundären Antikörper für 90 min in dunklen Bedingungen bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln.
8. Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen sekundären Antikörper zu eliminieren.
9. Inkubieren Sie die Membran mit chemilumineszierendem Substrat (bereiten Sie die Mischung unter dunklen Bedingungen vor und folgen Sie dem 1: 1-Anteil der Lösung A und B, die vom Hersteller bereitgestellt wird).
10. Analysieren Sie die Membran in einer Chemilumineszenz-Detektionsvorrichtung.

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Ergebnisse

Die beschriebene Methodik wurde weitgehend für die subsynaptische Analyse von neuronalen Proteinen im Allgemeinen und für die Isolierung und biochemische Charakterisierung der synaptischen Rezeptoren ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} insbesondere verwendet. Interessanterweise zeigt das hier dargestellte repräsentative Ergebnis die Nützlic...

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Diskussion

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,316,211,211
CaCl2	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	2,112,211,210
MgCl2·6H2O	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,313,961,210
Protease inhibitor cocktail Set III	Millipore, Darmstadt, Germany	535140
Trizma Base	Sigma, St. Louis, MO, USA	T1503
Tris-HCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,236,541,209
Triton X-100	Sigma, St. Louis, MO, USA	X100
SDS	Sigma, St. Louis, MO, USA	L3771
Glycerol	Sigma, St. Louis, MO, USA	G5516
Bromophenol Blue	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,311,651,604
Dithiothreitol	Sigma, St. Louis, MO, USA	D0632
Tween 20	Sigma, St. Louis, MO, USA	P2287
Non fat dry milk
NaCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,216,591,211
KCl	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,314,941,210
KH2PO4	Merck	4873
Na2HPO4	Pancreac Química SL, Barcelona, Spain	1,316,781,211
Basic 20 pH	Crison, Alella, Spain
Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer	VWR, Radnor, PA, USA.
Ultra-Clear Tubes (14x89mm)	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona	344059	Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.
Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	UFC901008
Centrifuge 5430R	Eppendorf, Hamburgo, Germany
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250	Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600	GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain
Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm	VWR, Radnor, PA, USA	612-1702
Compact Balance EK-610	A&D, Tokyo, Japan
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA
SuperSignal west pico chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
GR 200 Precision Balance	A&D, Tokyo, Japan
Anti-GPR37	Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.		Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin	Abcam, Cambridge, United Kingdom		Primary antibodies diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Secondary antibody diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.		Secondary antibody diluted 1:30,000