Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Zusammenfassung

Immunolabeling Methoden für die unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli in das sich entwickelnde Gehirn Zebrafisch Analyse werden hier beschrieben, die sind breit anwendbar auf andere Gewebe. Das erste Protokoll beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling stabile und dynamische Mikrotubuli. Das zweite Protokoll stellt eine Methode zum Bild und speziell im Entstehen begriffenen Mikrotubuli zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Mikrotubuli (MTs) sind dynamisch und fragile Strukturen, die schwierig zu Bild in Vivo, insbesondere in vertebrate Embryonen sind. Immunolabeling Methoden werden hier beschrieben, um verschiedene Populationen von MTs in den Entwicklungsländern Neuralrohr des Zebrafish Embryos zu analysieren. Während der Fokus auf Nervengewebe befindet, ist diese Methodik breit anwendbar auf andere Gewebe. Die Verfahren sind für früh zur Mitte-Somitogenesis-Embryonen (1 Somiten zu 12 Somiten), aber sie zu einer Reihe von anderen Stufen mit relativ geringfügigen Anpassungen sind optimiert. Das erste Protokoll stellt eine Methode zur Bewertung der räumlichen Verteilung der stabile und dynamische MTs und eine Quantitative Analyse dieser Populationen mit Bildverarbeitungs-Software. Dieser Ansatz ergänzt vorhandene Tools Bild Mikrotubuli Dynamik und Verteilung in Echtzeit, mit transgenen Linien oder transiente Expression tagged Konstrukte. Solche Werkzeuge sind in der Tat sehr nützlich, aber sie nicht ohne weiteres zwischen dynamischen und stabilen MTs unterscheiden. Die Möglichkeit, Bild und analysieren diese ausgeprägte Mikrotubuli Populationen hat wichtige Implikationen für Verständnis Mechanismen Zelle Polarisation und Morphogenese. Das zweite Protokoll beschreibt eine Technik, um im Entstehen begriffene MTs gezielt zu analysieren. Dies wird erreicht durch die Erfassung der de Novo Wachstumseigenschaften der MTs im Laufe der Zeit nach Mikrotubuli Depolymerisation mit dem Medikament Nocodazole und eine Erholungsphase nach Medikament auswaschen. Diese Technik noch nicht auf das Studium der MTs in den Zebrafish Embryos angewendet, sondern ist ein wertvoller Test zur Untersuchung der in Vivo -Funktion von Proteinen in die Mikrotubuli Montage verwickelt.

Einleitung

Mikrotubuli (MTs) sind Polymere von α und β-Tubulin, die in linearen Protofilaments zusammenbauen, von denen mehrere kombinieren, um eine hohle Röhre^1,2bilden. MTs sind polarisierte Strukturen, mit schnell wachsenden plus enden und minus enden, die an die Centrosome oder andere Mikrotubuli-organizing Center (MTOC)³verankert sind langsamwüchsig. De novo MT-Bildung wird durch Keimbildung bei der γ-Tubulin-Ring-Komplex (γ-TURC), bietet eine Vorlage für MT Montage⁴eingeleitet. In einer bestimmten Zelle können zwei Populationen von MTs, die wiederum über unterschiedlich unterschieden werden. Dynamische MTs erforschen ihre zelluläre Umgebung durch den Wechsel zwischen Phasen von Wachstum und Schrumpfung in einem Prozeß bekannt als dynamische Instabilität⁵. Im Gegensatz zu dynamischen MTs stabile MTs nicht wachsen und haben eine längere Halbwertszeit als dynamische MTs⁶.

Jahrzehntelanger Forschung in Zellbiologie hat eine anspruchsvolle Reihe von Tools zur Untersuchung MT Struktur und Funktion zur Verfügung gestellt und führte zu einen großen Körper des Wissens über diese Zellskelett Elemente. Zum Beispiel MTs spielen eine zentrale Rolle bei der Einrichtung und Wartung der Zellpolarität, die nicht nur auf ihre innere Polarität, sondern auch für die differenzielle subzelluläre Verteilung der Stall im Vergleich zu dynamischen MTs^7, ist ⁸. dagegen weit weniger versteht sich über MT Architektur und Funktion in komplexere dreidimensionale (3D) Umgebungen, z. B. vertebrate Embryos, teilweise wegen der Herausforderung von imaging-MT Zytoskeletts mit hoher Auflösung. Trotz dieser Einschränkung die jüngsten Generation der GFP exprimierenden transgene Linien dieses Label MTs oder transiente Expression fluoreszent markiert MT Marker erhöht hat unser Verständnis von der dynamischen Veränderungen, die MTs zu unterziehen und ihre zellulären und Rolle des Zebrafish Embryos. Das Gesamtnetz der MT kann abgebildet in transgenen Linien in die Tubulin ist entweder direkt beschriftet⁹ oder Tubulin Polymere mit MT-assoziierte Proteine indirekt gekennzeichnet sind Doublecortin-Like-Kinase (Dclk) oder Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Andere Linien (und Konstrukte) erzeugt wurden, die Bewertung der MT innere Polarität durch gezielt beschriften MT plus enden aktivieren oder Centrosome verankert minus enden^{11,12,13, 14}. die Macht dieser Werkzeuge liegt in der Fähigkeit, MT Dynamik im Leben, zu studieren Organismen zu entwickeln. Solche Studien haben gezeigt, zum Beispiel die räumliche und dynamische Verteilung der MTs in bestimmten Zellpopulationen, die Ausrichtung der mitotischen Spindeln im Gewebe Morphogenese (ein Indikator für die Ebene der Zellteilung), durchläuft die Polarität des MT-Polymers Bezug auf Prozesse wie Zelle Dehnung und Migration, und MT Wachstumsrate von Komet Geschwindigkeit^9,13,15bestimmt. Die Begrenzung dieser Werkzeuge ist, dass sie nicht ohne weiteres zwischen stabiler und dynamischer MT Bevölkerungsgruppen diskriminieren.

Zeichnung aus der reichen Zelle Biologie Literatur, werden Immunolabeling Methoden, um stabile und dynamische MTs des Zebrafish Embryos Bild hier beschrieben, sind die Verwendung von transgenen Linien ergänzen. Der weit verbreiteten Einsatz solcher Immunolabeling Methoden in der Zebrabärbling wurde durch die Schwierigkeit MT Integrität zu bewahren, während des Verfahrens Fixierung etwas behindert. Protokoll Nr. 1 beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling insgesamt, dynamisch, und stabile MTs in Querschnitte der entwickelnden Zebrafisches Hinterhirn. Darüber hinaus ist eine einfache Methode, die Verwendung von kommerziell verfügbaren Software beschrieben, um diese MT-Populationen zu quantifizieren. Stabile MTs unterscheiden sich von dynamischen MTs basierend auf mehrere post-translationalen Modifikationen von α-Tubulin, wie Acetylierung und Detyrosination, die auf stabile MTs über Zeit^16,17ansammeln. Im Zebrafish Embryos tritt Acetylierung auf ciliary und axonalen MTs aber nicht auf stabile Interphase MTs¹⁸, die Nützlichkeit dieses Markers auf eine Teilmenge der stabilisierten MTs zu begrenzen. Im Gegensatz dazu scheint Detyrosination auf allen stabilen MTs im Zebrafish Embryos¹⁸auftreten. Diese Post-translationale Modifikation stellt die Carboxy-Terminal Glutaminsäure α-Tubulin (Detyrosinated Tubulin)¹⁸ und mit Anti-Glu-Tubulin¹⁹detektiert werden. Obwohl Detyrosination bevorzugt auf stabile MTs auftritt, zeigt experimentelle Beweise, dass dieser Post-translationale Modifikation zurückzuführen, sondern als eine Ursache für MT Stabilität¹⁶. Die gegenseitige MT Bevölkerung, bestehend aus dynamischen MTs zeichnet sich mit einem Antikörper, anti-Tyr-Tubulin, erkennt, dass speziell die Tyrosinated Form von α-Tubulin¹⁹. Nach Immunolabeling mit diesen Markern und konfokale Bildgebung kann die Quantitative Analyse von MTs (Länge, Anzahl und relative Häufigkeit) in definierten Regionen des entwickelnden Neuralrohrs durchgeführt werden. Eine optimierte Methode ist hier für die Durchführung dieser Analyse mit 3-d-Bildverarbeitung Software zur Verfügung gestellt. Diese Methode kann auf Fragen bezüglich Morphogenese und der Einrichtung oder Reifung der Zelle Polarität²⁰angewendet werden. In der Tat, die Ausarbeitung von polarisierten Arrays von stabilen MTs begleitet viele entwicklungspolitische Veranstaltungen, darunter Photorezeptor Morphogenese²¹, Epithelisierung von Zellen in den Entwicklungsländern Neuralrohr¹⁸ und Axon Bildung⁸.

Protokoll Nr. 2 beschreibt eine in-Vivo -Adaption eines Zelle Biologie Assays MTs Analyse während ihrer Versammlung Phase (Keimbildung/Anchorage und Wachstum)^22,23. Im Entstehen begriffenen MTs sind kernhaltige an die Centrosome und anschließend an subdistal Anhängsel der Mutter Zentriol²³verankert. Eine Methode, um entstehende MT nachwachsen nach Depolymerisation analysieren wird beschrieben. Dieses Protokoll enthält Informationen über die Nocodazole Behandlung, MTs, das Medikament Auswaschung Verfahren und der Nachbehandlung Erholungsphase depolymerisieren. MT nachwachsen wird in regelmäßigen Abständen überwacht.s Post Auswaschung von Immunolabeling mit Markierungen für insgesamt MTs (anti-β-Tubulin) neben Marker für die Centrosome (anti-γ-Tubulin) und Kern (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)), nach den allgemeinen Verfahren, die im Protokoll Nr. 1beschrieben. Der MT Depolymerisation Schritt dieses Protokolls ist wichtig, da es ermöglicht die Beurteilung der de Novo MT Wachstum als Erweiterung der bereits vorhandenen MTs. Diese Technik unterscheidet sich somit von anderen veröffentlichten Verfahren, MT Wachstumsraten (in Abwesenheit der Depolymerisation) zu messen, durch die Verwendung einer plus Spitze Markers wie Ende bindende Protein 3 verschmolzen zu grün fluoreszierendes Protein (EB3-GFP), wie im Tran Et Al.gezeigt, 2012-¹¹. Darüber hinaus dieser Assay eignet sich besonders für die Analyse von Embryonen in de Novo MT Baugruppe defekt wie die zuvor gemeldeten NEDD1 Mutanten in der Rekrutierung von γ-Tubulin, das Centrosome beeinträchtigt ist, was zu unvollständig Bildung des Neuralrohrs und neuronale Defekte²⁴.

Protokoll

Ethik-Anweisung: die Verfahren beschrieben folgen der University of Maryland Baltimore County Tierbetreuung Leitlinien.

1. Analyse des stabilen und dynamische MTs verwenden Immunolabeling (Protokoll 1)

1. manuelle Dechorionation von Embryonen vor der Fixierung
   1. erhalten frisch Embryonen von überschüssigem Wasser gießt hervorgebracht und dann sammeln überzählige Embryonen in einem Kunststoff Petrischale (siehe Tabelle der Werkstoffe).
   2. Entfernen Sie jeglichen Schmutz aus dem System Wasser und Transfer Embryonen, ein neues Gericht mit Embryo Medium gefüllt (siehe Tabelle der Materialien) um sicherzustellen, dass die Embryonen in einer sauberen Umgebung zu entwickeln.
   3. Ermöglichen die Embryonen zu entwickeln, um die gewünschte Stufe in einem temperierten Inkubator auf 28,5 ° c
   4. Ort-Embryonen, die jünger als 24 h nach Befruchtung (hpf) in eine Glasschale vor Dechorionation.
      Hinweis: Dechorionate Embryonen vor der Fixierung, schnelle Durchdringung der Fixiermittel und bewahren MT Integrität zu maximieren. Verwendung Embryo Medium anstatt Wasser zu den zusätzlichen Ca ^{2 +} während der Dechorionation erforderlich.
   5. Entfernen Sie manuell die Chorions aus Embryonen während in Petrischale, mit feinen Pinzette unter dem sezierenden Mikroskop.
      1. Kneifen ein kleines Gebiet in der Runde, transparente Chorion, die den Embryo mit ein paar Zangen und sanft auseinander ziehen Zange erstelle ich einen Bruch in der Membran umgibt.
      2. Vergrößern die Eröffnung von neugierigen zart auf den geplatzten Chorion mit Pinzette. Achten Sie darauf, den Embryo mit der Zange zu berühren, da es platzen könnte.
2. Fixierung der inszenierten Embryonen
   1. Transfer inszeniert, Dechorionated Embryonen bis 1,5 mL Zentrifuge Röhren. Entfernen Sie so viel Embryo Medium wie möglich mit einem Glas Pasteurpipette.
      Hinweis: Führen Sie Fixierung und Droge-Behandlungen auf jung (Mitte-Somitogenesis) Embryonen vor der Bildung der neuronalen Zentren Vermittlung Schmerzempfindung, erfordern keine Additonal Verfahren zur Schmerzlinderung während der Euthanasie. Entwicklungsstadien sind definiert im Kimmel Et Al., 1995 ²⁵. Die 4. und 5. und 11. / 12. Somiten Etappen wurden verwendet, um Bilder für die Zahlen 2 und 3 zu erhalten.
   2. Bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) HT Baugruppe Puffer (MAB) Fixativ (siehe Tabelle der Materialien) durch die Kombination von 1 mL 8 % PFA pro 1 mL 2 X MAB und Zugabe von 2 µL 100 % Triton x-100 pro 1 mL Gesamtvolumen.
      Achtung: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Lösungen mit PFA und Triton x-100, die hautreizende sind.
   3. Fix Embryonen in 1 mL 4 % PFA/MAB Fixiermittel für 5 min bei 28,5 ° C. Aspirat Fixativ mit einer Pipette mit 1 mL frisch Fixativ zu ersetzen, und 3 h bei Raumtemperatur (RT) auf einer Wippe inkubieren.
      Hinweis: Proben müssen behoben werden schnell auf ihre biologische Temperatur (28,5 ° C Zebrafisch) temperaturabhängig MT Depolymerisation zu verhindern.
3. Aspirieren Fixiermittel und 1 mL 1 x Tris gepufferte Kochsalzlösung mit NP40 (TBS-NP40) Puffer. Schütteln Sie sanft bei RT auf ein Rocker drei Mal für 5 Minuten. Speichern von Embryonen bei 4 ° C in 1 mL frisch 1 X TBS-NP40 für nicht mehr als 7 Tage.
   Achtung: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Lösungen mit NP-40, hautreizend.
4. Berandungen Embryonen für Immunolabeling
   1. Hitze RT 4 % niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose Einbettung Medium in einem geschlossenen Behälter, bis die Lösung klar mit einer Heizplatte wird eingestellt auf 50 ° C in der Nähe einen sezierenden Mikroskop . Halten Sie den Behälter geschlossen zwischen Proben und beheizt die einbettende Prozeß (Schritte 1.4.4-1.4.6).
   2. Transfer Embryonen von 1,5 mL Röhren in einer Petrischale mit einer Glaspipette Zentrifugieren und füllen Sie es mit 1 X TBS-NP40.
   3. Entfernen Sie die große Eigelb Zellen aus Somitogenesis Embryonen (4-5 und 11-12 Somiten) in der Petrischale mit feinen Pinzette unter die Vergrößerung des einen sezierenden Mikroskop- ²⁶. Halten Sie den Embryo durch die Rute Knospe mit einem paar der Zange und ziehen Sie die Eigelb-Zellen mit dem anderen Paar um das Hinterhirn Gewebe zu erhalten. Die de-Dotter Embryonen auf eine Fläche von der Petrischale frei von Eigelb übertragen.
      Hinweis: Einbetten Embryonen in der Agarose-gefüllte Form einzeln zu verhindern vorzeitige Verhärtung der LMP-Agarose.
   4. Füllung ein 12 x 5 mm x 3 mm auch der speziellen Form mit 200 µL geschmolzen LMP Agarose mit einer Mikropipette. Führen Sie die Schritte 1.4.5.-1.4.6. schnell (innerhalb von 20 s die Form zu füllen), Embryo einzubetten, bevor die LMP-Agarose, RT abkühlt und erstarrt.
   5. Feine Pinzette verwenden, um eine de-Dotter durch den Tailbud aus der Petrischale mit der Agarose-gefüllte Form zu seinem konischen Ende unter dem sezierenden Mikroskop Embryotransfer.
   6. Einsatz feine Pinzette, den Embryo in die Form zu orientieren, so dass der Vibratome in der gewünschten Fläche schneidet. Erstellen Sie Querschnitte durch den Embryo orientieren, so dass das Hinterhirn Gewebe mit der dorsalen Oberfläche zugewandte Kante und seine Vorderfläche zugewandten Ende spitz zulaufenden Bereich parallel zur Länge der Form verläuft. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.4-1.4.6 für die restlichen Embryonen.
   7. Zulassen der Agarose einbetten um für 5 min bei RT zu festigen
   8. Erzeugen 40 µm Abschnitte der höchsten Achse von der Agarose eingebettet Embryonen (Schritte 1.4.1-1.4.7) mit einem Vibratome mit der speziellen Schale gefüllt mit 1 x TBS-NP40. Übertragen Sie Abschnitte von Interesse auf einer 24-Well-Platte in 500 µL 1 x TBS-NP40 mit feinen Pinzette. Legen Sie in den Abschnitten von nur einem Embryo pro Bohrloch.
      Hinweis: Siehe ¹⁸ für weitere Details verweisen. Sicherstellen Sie, dass Abschnitte hydratisiert auf alle Zeiten in mindestens 250 µL Puffer und Rock bei niedriger Drehzahl (10-25 u/min) für die verbleibenden Schritte zur Trennung bleiben von Agarose Einbettung zu verhindern. Waschmittel in die Sperrung zu präsentieren und Waschlösungen sollte verringern die Oberflächenspannung des flüssigen Mediums und Eintauchen der Abschnitte. Kontrollieren Sie die Abschnitte in den Vertiefungen während und nach allen Manipulationen bleiben. Seien Sie vorsichtig, versehentlich verwerfen Abschnitte bei Waschungen zu verhindern.
5. Entfernen den Puffer und 500 µL Lösung zu blockieren. Rock für mindestens 1 h bei RT
   Hinweis: Verwenden Sie eine blockierende Lösung, die enthält 5 % Seren von Wirtsarten von jedem Sekundärantikörper verwendet werden (siehe Tabelle der Werkstoffe).
6. Inkubation in 300 µL Primärantikörper verdünnt in blockierende Puffer für 36-72 h bei 4 ° C auf einer Wippe. Waschen zweimal in 600 µL 1 x TBS-NP40 auf einer Wippe für jeweils 30 min bei RT
   Hinweis: Doppel-Label Abschnitte durch Inkubation im primären Antikörper gegen insgesamt MTs (anti-β-Tubulin oder anti-α-Tubulin) und stabile MTs (Anti-Glu-Tubulin) oder dynamische MTs (Anti-Tyr Tubulin). Wählen Sie primäre Antikörper, die aufgeworfenen Fragen in verschiedenen Wirtsarten, wenn α-Tubulin Bevölkerung doppelte Kennzeichnung für insgesamt und posttranslational modifiziert werden. Siehe Tabelle der Materialien für Antikörper-Verdünnungen.
7. Inkubation in 300 µL Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper verdünnt in blockierende Puffer auf ein Rocker für 16-24 h bei 4 ° C im Dunkeln. Waschen zweimal in 600 µL 1 x TBS-NP40 auf einer Wippe für jeweils 30 min bei RT
   Hinweis: Wickeln Sie die Multi-gut Schale mit Sekundärantikörper in Folie ab diesem Zeitpunkt und nach jeder Manipulation abschrecken zu verhindern. Wählen Sie sekundäre Antikörper, die mit der Host-Immunglobulin an den Primärantikörper reagieren. Wählen Sie Sekundärantikörper Fluorophore, die separate, nicht überlappende Emissionsspektren haben. Siehe Tabelle der Materialien für Antikörper-Verdünnungen.
8. Die Embryonen in 500 µL DAPI-Lösung auf einer Wippe für 30 min bei RT. Wash dreimal in TBS-NP40 rocken bei RT 5 min inkubieren.
   Hinweis: Nukleare Kennzeichnung bietet zellulären Kontext für die MT-Quantifizierung durchgeführt im Schritt 1.12.
9. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel mit Anti-Fade-Agent in der Mitte einer Folie staubfrei. Verwenden Sie feine Pinzette Abschnitte auf der Montage mittlerer Tröpfchen übertragen. Statt einem staubfreien Deckgläschen auf die Probe. Speichern von Folien an einem trockenen, dunklen und kühlen Ort, eingewickelt in Alufolie, bis Bildgebung erfolgt.
   Hinweis: Kreisen die Abschnitte auf der Rückseite der Folie mit einem Fine-bestückte permanent-Marker vor Bildgebung wird dazu beitragen, um Abschnitte zu identifizieren, wenn Sie das Mikroskop verwenden.
10. 1. Mount Abschnitte auf einer invertierten Laserscanning confocal Mikroskop durch die Anbringung der Folie auf die Bühne mit dem Deckglas mit Blick auf das Ziel Confocal Imaging. Bestimmen der geeigneten Optics (Ziel, Laser und Kanaleinstellungen erlangen und offset) auf einen Steuerschieber und konsistent zwischen Proben ²⁷ aufbewahren. Vermeiden Sie Übersättigung die Pixel um Datenverlust zu verhindern.
    2. Z-Stapel konfokale Bilder mit Kanal-Einstellungen für die ausgewählten Sekundärantikörper Fluorophore erfassen und Speichern der Bild-Dateien- ²⁷. Z-Stapel für jeden Abschnitt zu erwerben.
       Hinweis: Replizieren die Parameter verwendet, um die Bilder in den Abbildungen 2 und 3 zu erwerben, mithilfe der folgenden Erwerb Einstellungen: Modus = XYZ; Objektiv Vergrößerung = 63 X Öl Immersion-Objektiv; Objektive numerische Apertur = 1,4; Z-Schritt = 0,1 µm; Z-Tiefe = 16.23 µm. verwenden Sie die folgenden Kanaleinstellungen: DAPI Anregung mit 20 % UV-Bereich Laser, Emissionsbereich Filter = 430-480 nm, Photomultiplier (PMT) Gewinn = 525 V und PMT Offset =-1.72 %; 448 nm Fluorophor (siehe Tabelle der Materialien) Anregung mit 20 % 488 nm Laser, Emissionsbereich Filter = 493-573 nm, PMT Gain = 689 V und PMT Offset = -0,2 %; 594 nm Fluorophor Anregung mit 32 % 594 nm Laser, Emissionsbereich Filter = 608-706 nm, PMT Gain = 768 V und PMT Offset = -6,8 %.
    3. Rohdatendateien mit einmaligen, beschreibenden Dateinamen speichern und erstellen Sie eine Kopie für die Bearbeitung in Bildanalysesoftware.
11. Zusammenstellung von Z-Stacks für die Anzeige von maximal Projektionen
    1. mit öffentlichen Bereich 3-d-Bildanalyse-Software (z. B. ImageJ) Kopie der Daten-Datei zu öffnen. Scheck, der jeden Kanal als individuelle Bildsequenz (Z-Stapel) angezeigt wird.
    2. Bild Kanäle mithilfe der folgenden Menüfolge aufgeteilt: “ Bilder/Farbe/Split Kanäle ”.
    3. Schaffen eine zusammengefügte Bild durch die Überlagerung der Kanäle von Interesse mithilfe der folgenden Menüfolge: " Bilder/Farbe/Merge Kanäle. " wählen Sie die 594 nm, 488 nm und DAPI-Kanäle falsche rot, grün und blau, beziehungsweise sein. Überprüfen Sie " Create Composite " und wählen Sie " OK " ²⁸.
       Hinweis: Lassen Sie den DAPI-Kanal, um besser vermitteln Detail speziell für MTs in eine maximale Projektion wie in Abbildung 2 und 3, mit nur falsche Farben für die anderen beiden Kanäle auswählen.
    4. Den zusammengeführten Z-Stapel prüfen und notieren Sie sich die Anfangs- und Endfarbe Positionen der inneren beste Z-Ebenen für alle sichtbaren Kanäle. Die äußeren Z-Ebenen, die in der Regel suboptimal Signal aufgrund der unebenen Oberflächen des Abschnitts zu entlassen. Beziehen sich auf ²⁹ Einzelheiten verweisen.
    5. Visualisieren den zusammengeführten Z-Stapel als ein einziges 2-D-Bild durch eine maximale Intensität Projektion des Z-Stack mithilfe den folgenden 3D-Bild Analyse Menü Reihenfolge ausführen: " Bilder/Stack/Z-Projekt " geben Sie die Anfangs- und Endposition der inneren besten Z-Ebenen aus Schritt 1.11.3 als die " Slice Start " und " Stop-Scheibe, " bzw.. Wählen Sie " Max Intensität " als Projektionstyp und klicken Sie auf " OK ". Beziehen sich auf ²⁸ für weitere Details verweisen.
12. Kennzeichnung analysieren MT
    1. der kommerziellen 3D Bildanalyse-Software zu öffnen. Wählen Sie " Bibliothek erstellen " und geben Sie einen beschreibenden Namen für die Image-Bibliothek. Klicken Sie " anlegen. " ziehen Sie raw-Bilddateien aus dem confocal Mikroskop in die Bibliothek generiert. Größere Dateien erfordern mehr Zeit, um zu übertragen.
    2. Wählen Sie eine Datei zu analysieren. Wählen Sie " erweitert Fokus " aus der " Ansicht " Menü das Kanal zusammengeführt Bild im Hauptfenster anzeigen.
    3. Anpassen der Schnittstellenüberwachung, indem Sie die Schieberegler für jeden Kanal auf links oder rechts ziehen, bis das Hintergrundsignal reduziert wird und das echte Signal robust ist. Beachten Sie, dass jeder Kanal zeigt eine true-Signal für das Molekül gekennzeichnet (z. B. DAPI-Kanal zeigt längliche oder mitotische Kerne aber nicht Auto-Fluoreszenz aus dem Zytoplasma oder Agarose).
    4. Wählen Sie die " Freehand Region von Interesse (ROI) " Werkzeug und skizzieren des Interessenbereichs analysiert werden. Wählen Sie die " Aktionen " Registerkarte "gefolgt von " auf Auswahl zuschneiden " um das Bild zu beschneiden. Speichern Sie zugeschnittenes Bilddatei unter einem neuen Namen. Klicken Sie auf die " Messungen " Registerkarte, um das Protokoll für das Filtern von bestimmten Objekten relevant für die 3-d-Analyse zu erstellen.
    5. Drag " Objekte finden Sie " in das Protokoll-Fenster. Benennen Sie das erste Protokoll " DAPI. " den DAPI-Kanal in dem Dropdown-Menü auswählen. Ziehen Sie die folgenden Einstellungen auf das DAPI-Protokoll und legen Sie sie unten " Objekte finden " in der folgenden Reihenfolge (Tabelle 1): " füllen Sie Löcher in ObjectsŔ " Separate ObjectsŔ berühren " Objekte durch SizeŔ ausschließen " Ausschließen, nicht berühren, ROIs ".
       Hinweis: Das Ziel der Einstellungen in Tabelle 1 sind zuerst festlegen einer Schwelle, die Signale verwirft dessen Verteilung und Größe sind nicht konsistent mit der Größe der Objekte, die analysiert wird. Zum Beispiel ein Signal nicht groß genug, um einen Kern, wenn Kerne zählen zu beseitigen.
    6. Führen die Sequenz (Schritt 1.12.9), montieren Sie die restlichen Filter für β-Tubulin und andere Markierungen mit den Einstellungen in der Tabelle 1.
    7. Select " Maßnahme " am unteren Rand jedes Protokoll. Wählen Sie " Intensität und Volumen-Messung " und " Skelett Länge " für alle Tubulin Kennzeichnung, sondern nur die erstere für das DAPI-Signal.
    8. Zeichnen einen ROI in der Region gemessen werden. Beobachten Sie die Messungen unter den " Zusammenfassung " tab, nachdem die Software die Region verarbeitet. Kopieren Sie die Daten und speichern Sie sie auf eine praktikable Tabellenkalkulation, wie in Tabelle 2. Erstellen Sie eine Backup Kopie der Kalkulationstabelle für die spätere Analyse.
    9. Wählen Sie Messungen von Interesse (z. B. Länge der MT-Bündel, Anzahl der MT-Bundles/Kern, wie Sie mit verschiedene Markierungen) in der Tabellenkalkulation und analysieren, um die Durchschnittswerte für jede Gruppe zu bestimmen.
       Hinweis: Die durchschnittliche MT-Bündel-Länge = die Summe der ' Skelett Länge für β-Tubulin bedeuten ' für jedes Embryo dividiert durch die Gesamtzahl der Embryonen. Finden Sie in Zeile 20 der Tabelle 2. Das Arbeitsblatt so formatieren, dass Variablen und experimentellen Gruppen leicht grafisch dargestellt werden.

2. De Novo MT-Montage-Assay (Protokoll Nr. 2)

1. Konstrukt und Test der Multi-gut durchströmten Apparat ( Abbildung 1) 2 Tage vor dem Experiment.
   Hinweis: Der Apparat ermöglicht gleichzeitige Auswaschung von mehreren experimentellen Gruppen nach Nocodazole Behandlung mit Lieferungen aus Tabelle der Materialien. Silikon-Versiegelung erfordert mindestens 24 Stunden Trocknungszeit bevor es keine Toxizität der Embryonen gefährdet.
   1. Eine 50 mL Zentrifugenröhrchen in zwei Hälften geteilt längs, mit Hilfe einer Schablone oder Bandsäge.
   2. Cut 7 Halbkreise mit einem Radius von 3 cm aus 70 µm Nylon mesh und einpassen fest in eine Zentrifuge die Hälfte der Split Rohr. Kleben Sie Halbkreise in die Zentrifugenröhrchen parallel zu den 10 mL Abstufung Markierungen mit Aquarium-Safe Silikon-Versiegelung. Lassen Sie das Gerät für 2 Tage trocknen und spülen durch Einweichen in ein Becherglas mit Wasser für 2-3 h.
   3. Linie oberste (Gewinde) Ende der geschnittenen Zentrifugenröhrchen mit Knetmasse, so dass die Höhe der Flüssigkeit im Durchflussverfahren Gerät beibehalten eine Tiefe von ¼ Zoll ( Abbildung 1, 2 und 3 Ansichten hat).
   4. Vorbereitung der Auswaschung Apparat durch den Kolben aus einem 50-mL-Spritze entfernen und Einfügen von 12 Zoll von feinen Schlauch in die Spitze. Drücken Sie den Schlauch so weit wie es geht und um das Gelenk mit Modelliermasse versiegeln.
   5. Vornässen des Netzes mit Embryo Medium damit die Flüssigkeit durch das gesamte durchströmten Gerät laufen. Winkel des Geräts auf Eis so dass Flüssigkeit in allen Abteilen bündelt aber noch leert sich der Vorderseite befindet sich die Ton-Felge. Mit einem Ring-Ständer, aussetzen der Auswaschung Apparat über dem Durchfluss-Gerät auf dem Eis ( Abbildung 1).
   6. Chill 200 mL Embryo Medium auf Eis und gießen Sie genug in den Apparat auswaschen, damit alle Luftblasen gelöscht werden und der Durchfluss ca. 7 mL/min einstellen der Durchflussmenge durch Änderung der Höhe der Spritze ist.
2. Enzymatisch Dechorionate Embryonen
   1. machen eine funktionierende Lösung von unspezifischen Protease durch Verdünnen von 1 mL 10 mg/mL nicht-spezifische Protease Lager in 20 mL Embryo Medium.
   2. Chemische Dechorionation Perform an Embryonen 1 h vor dem Timepoint wenn sie erwartet werden, um die gewünschte Entwicklungsstufe zu erreichen. Digest Chorions indem Embryo Medium aus 100 mm Petrischalen mit inszeniert, Embryonen und das Hinzufügen von 20 mL unspezifische Protease Arbeitslösung.
   3. Embryonen Inkubation bei 37 ° C für 5 min.
      Hinweis: Nicht mehr als 5 min oder verwenden eine höhere Konzentration von unspezifischen Protease Lösung, sonst werden die Embryonen fallen auseinander einmal behandelt mit Nocodazole.
   4. Schnell, unspezifische Protease pipette und Gerichte mit ca. 25 mL Embryo Medium nachfüllen. Einmal zu wiederholen.
   5. Mit einer 1-mL Glaspipette, Transfer Embryonen jünger als 24 hpf Glas Geschirr um sie vor Beschädigungen zu schützen.
   6. Komplette Dechorionation von Chorions mit einer feinen Pinzette, manuell zu entfernen, wie in Schritt 1.1.5 beschrieben.
   7. Legen Sie Glas Petrischalen mit Dechorionated Embryonen in einem Inkubator 28,5 ° C für mindestens 30 Minuten, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreichen.
3. Depolymerize die vorhandenen MTs
   1. bereiten eine funktionierende Lösung von 5 µg/mL Nocodazole durch die Kombination von 50 µL 1 mg/mL Lager Nocodazole mit 10 mL Eis kalt Embryo Medium.
      Achtung: Benutzen Sie Handschuhe beim Umgang mit Nocodazole, hautreizend.
   2. Austausch der Embryo Medium der Nocodazole behandelten Gruppe mit 10 mL kalte Nocodazole funktionierende Lösung. Legen Sie Petrischalen auf Eis, für einen angemessenen Zeitraum für die Entwicklungsphase (z. B. 1 h für 4-5 Somiten Embryonen). Beiseite unbehandelten Kontrolle Embryonen in einer Petrischale auf Eis neben Auswaschung Proben im Schritt 2.3.4.1 behoben werden.
   3. Transfer Embryonen mit einer Feuer-poliert 1-mL-Glas-Pipette auf den Durchfluss-Apparat, mit getrennten Fächern für jede Versuchsgruppe. Starten der Nocodazole auswaschen durch strömenden Eis kalt Embryo Medium in die Top 50 mL Spritze.
      Hinweis: Verwenden Sie mindestens 30 Embryonen pro Versuchsgruppe. Versuchsgruppen könnte darin bestehen, der Kontrolle Embryonen oder eine Vielzahl von Morpholino oder RNA injiziert Embryonen. Die Auswaschung wird insgesamt ca. 150 mL des Embryos Medium alle 8-10 min. auswaschen hinzugefügt werden der Nocodazole erfordern, während Sie weiterhin MT Wachstum mit Eis zu hemmen. Halten die Embryonen auf Eis ist essentiell für den Erfolg des Assays, denn MTs bei kalten Temperaturen instabil sind und Kälte die Entwicklung im frühen Embryo verzögert.
   4. Erlauben MTs regrow nach 20 min der Auswaschung bei RT durch die Übertragung der Embryonen auf Glas Petrischalen mit warm (28,5 ° C) Embryo Medium mit einem Feuer poliert 1 mL Glaspipette. Einen Timer gestartet wird, sobald die Embryonen transferiert werden.
      1. Fixieren die Kontrolle und Auswaschung Embryonen bei 1 min, 5 min und 10 min von ca. 10 Embryonen in einem 1,5 mL Pipettieren Zentrifugieren Rohr gefüllt mit 1 mL 4 % PFA/MAB Fix (28,5 ° C) und gemäß den Anweisungen in Schritt 1.2.3.
4. Proben vorbereiten, für Immunolabeling, wie in beschrieben 1.3-1.5 Abschnitte.
5. Immunolabel schwimmende Abschnitte und Bild Embryonen als in Abschnitten 1.6-1.10 mit folgenden Änderungen Primärantikörper Spezifikationen beschrieben: Einsatz 1: 500 Kaninchen Anti-γ-Tubulin und 1: 200 Maus Anti-β-Tubulin.
6. Prozess und Bilder mit 3-d-Bildanalyse-Software zu analysieren, wie unter Schritt 1.12.

Ergebnisse

Analyse der stabile und dynamische MTs mit immunolabeling
In Protokoll Nr. 1ist die Verteilung der MT Sub-Populationen während der frühen (neuronale Kiel) und späten Neuralrohr (neuronale Stab) Entwicklungsstadien offenbart, mit Glu-Tubulin und Tyr-Tubulin als Marker für stabile und dynamische MTs, beziehungsweise. Dynamische MTs überwiegen in dem Hinterhirn Stadium der neuronalen Kiel (4-5 Somiten) (Abbildung 2

Diskussion

Derzeit gibt es viele Methoden für imaging-MT-Dynamik in der frühen Entwicklung der Zebrafisch, von live Imaging tagged Moleküle bis hin zu Immunolabeling der Gewebe^11,12,13,14behoben. MTs in einer einzelnen Zelle in dynamischen oder stabile Staaten existieren können, zwar Epithelisierung ein Prozess in dem MTs schrittweise im Laufe der Zeit stabilisiert werden. Mit Hilfe von Markern für s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose			Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized.
Kpipes	Sigma	P7643
NaCl	Sigma	S7653
Tris-HCl	Sigma	T3253-500G
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
NP-40	American Bioanalyticals	AB01424
EGTA	Sigma	E3889-25G
MgCl2	Sigma	M2670-500G
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher	BP1605
Triton-x	American Bioanalyticals	AB02025
Anti-Fade mounting medium	Invitrogen	P10144
Mouse anti-β-tubulin	Developmental studies Hybridoma Bank	E7	1/200
Rabbit anti-γ-tubulin	Genetex	GTX113286	1/500
Rabbit anti-α-tubulin	Genetex	GTX108784	1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin	Millipore	AB3201	1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin	Millipore	ABT171	1/500
Mouse anti-centrin	Millipore	04-1624	1/1000
Goat 488 anti-rabbit	Thermofisher	A11008	1/500
Goat 594 anti-rabbit	Thermofisher	A11012	1/500
Goat 594 anti-mouse	Thermofisher	A11005	1/500
Goat 488 anti-mouse	Thermofisher	A11001	1/500
Vibratome	Vibratome	1500
Forceps	World Precision Instruments	555227F
100 mm petri dish	Cell treat	229693
35 mm petri dish	Cell treat	229638
50 ml falcon tube	Fisher	14-432-22
Woven nylon mesh 70 um	Amazon.com	B0043D1SZG
Micropipette	Gilson	F123602
Glass pipette	Fisher	NC-999363-9
Aquarium sealant	Amazon.com, by MarineLand	Silicone Sealer 1 oz (Tube)
Ring stand	Fisher	14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID	Cole-Parmer	WU-06417-21
Modeling clay	Amazon.com	Sargent Art 22-4000	Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp	Fisher	02-215-466
60ml syringe	Fisher	14-820-11
Embryo medium (E3)			34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.
Blocking Solution			50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6)			155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4)			160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software	PerkinElmer	Volocity (V 6.2)
Dry block heater	VWR	12621-108	Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope	Leica	MZ12
Confocal Microscope	Leica	SP5
Flat embedding mold	emsdiasum.com	BEEM 70904-01
Public domain image processing software	NIH	ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number