Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

Zusammenfassung

Gefäßendothels steuert dicht Leukozyten Rekrutierung. Unzureichende Leukozyte Extravasation trägt zur entzündlichen Krankheiten des Menschen. Daher ist es notwendig, bessere Therapien für entzündliche Erkrankungen zu entwerfen, auf der Suche nach neuartigen regulatorischen Elemente der endotheliale Aktivierung. Hier beschreiben wir eine umfassende Methodik um neuartige endotheliale Regulatoren zu charakterisieren, die Leukozyten während einer Entzündung des Menschenhandels ändern können.

Zusammenfassung

Die endotheliale Schicht ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper durch viele verschiedene Kontrollfunktionen. Verordnung der Entzündungsreaktion durch die endotheliale Schicht unbedingt effizient bekämpfen schädliche Eingaben und Hilfe bei der Wiederherstellung der beschädigten Bereiche. Wenn die Endothelzellen, einer entzündlichen Umgebung, wie die äußere Komponente von Gram-negativen Bakterien Membran, Lipopolysaccharid (LPS), ausgesetzt sind sie zum Ausdruck bringen wasserlöslicher Pro-inflammatorischen Zytokinen, wie Ccl5, Cxcl1 und Cxcl10, und Auslösen der Aktivierung des zirkulierenden Leukozyten. Der Ausdruck der Adhäsionsmoleküle E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1 auf der endothelial Oberfläche ermöglicht darüber hinaus das Zusammenspiel und die Adhäsion der aktivierten Leukozyten, die endotheliale Schicht, und schließlich die Extravasation auf das entzündete Gewebe. In diesem Szenario muss die endotheliale Funktion streng reguliert werden, da übermäßige oder fehlerhafte Aktivierung bei der Rekrutierung von Leukozyten zu entzündlichen Erkrankungen führen könnte. Da viele dieser Erkrankungen eine wirksame Behandlung nicht verfügen, müssen neue Strategien mit Fokus auf die vaskuläre Ebene untersucht werden. Wir bieten umfassende Tests, die auf der Suche nach neuartigen endotheliale Regulierungsbehörden nützlich sind, die Leukozyten-Funktion zu ändern. Wir analysieren endotheliale Aktivierung durch verschiedene Techniken, einschließlich Konkretisierung Ziele beteiligt bei der Rekrutierung von Leukozyten (z. B., Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle) mit: Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion () RT-qPCR), Western-Blot, flow Cytometry und Adhäsion Assays. Diese Ansätze bestimmen die endotheliale Funktion im Zusammenhang mit entzündlichen und sind sehr nützlich für Screening-Tests um neuartige endotheliale entzündliche Regulierungsbehörden zu charakterisieren, die potenziell wertvoll für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien durchführen.

Einleitung

Die Entzündung ist eine positive biologische Reaktion gegen infektiöse Agenzien, mit dem großen Ziel, den Erreger zu eliminieren und geschädigtes Gewebe zu reparieren. Unter bestimmten Bedingungen, z. B. chronische Infektionen oder Autoimmunerkrankungen beheben Entzündungen nicht. Stattdessen gibt es eine anomale Reaktion mit kontinuierlicher Infiltration der Leukozyten, wodurch eine verlängerte Immunantwort, die führt zu Gewebeschäden, Fibrose, Verlust der Funktion, und die allgemeine, Behinderung und in einigen Fällen zum Tod des Patienten. Diese menschliche Störungen, katalogisiert als entzündliche Erkrankungen beinhalten alle die Blutgefäße für die Kontrolle der Leukozyte Extravasation^1,2.

Die Endothelzellen spielen eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der Entzündungsreaktion durch Steuern, Handel mit Leukozyten. Wenn die endotheliale Schicht Entzündungsmediatoren wie LPS ausgesetzt ist, das ruhende Endothel aktiviert und drückt Pro-inflammatorischen Zytokinen (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) und Adhäsionsmoleküle (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1), gefallen Rekrutierung der zirkulierenden Leukozyten an der Infektionsstelle. Die Leukozyten, die dann durch die freigesetzten Zytokine grundiert zu vermitteln, Rollen und Interaktion mit der endotheliale Schicht durch die entsprechenden Klebstoff Gegenstücke: PSGL-1 bis Selektin, α4β1 Integrin VCAM-1 und αLβ2 Integrin ICAM-1. Zu guter Letzt migrieren der Leukozyten auf das Gefäßsystem in Richtung der Schwerpunkt der Entzündung³.

Die wichtige Rolle des Endothels bei der Regulierung der entzündlichen Reaktion wurde an Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, um auszudrücken, die LPS-Rezeptor, Abgabe-wie Empfänger 4 (TLR4), nur auf die Endothelzellen nachgewiesen. Diese endotheliale TLR4 Tiere wurden reagieren zu einer LPS-vermittelte Entzündung und die Infektion erzeugt nach der Inokulation von Bakterien zu erkennen, und folglich zu erreichen Infektion Auflösung und Überleben auf ähnlichem Niveau wie die Wildtyp-Mäusen-^{4 , 5}.

Für das Endothel reguliert Entzündungsreaktion Weg hat postuliert worden, dass die Hemmung in einigen Phasen der Leukozyten-Endothel-Interaktion bei der Reduktion von Trans-endothelialen Migration und eine bessere Prognose für führen würde entzündliche Erkrankungen. In der Tat wurden mehrere Strategien, die Ausrichtung auf die endotheliale Aktivierung und Leukozyten-Endothel-Interaktion entwickelt, Extravasation von Immunzellen zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen^6,7zu behindern.

In diesem Bericht beschreiben wir eine gründliche Gruppe von in-vitro- Techniken die endotheliale Aktivität als Reaktion auf den Entzündungsreiz LPS und ihre Rolle bei der Aktivierung von Leukozyten und Haftung auf die vaskuläre Schicht vollständig zu charakterisieren. Die Endothelzellen Modell in dieser Handschrift wurde Lunge Endothelzellen Mauslinie (MLEC-04), wie von Hortelano Et Al. beschrieben ⁸. the MLEC-04-Zell-Linie in der Literatur soll ein geeignetes System, endotheliale Aktivierung^9,10studieren validiert wurde. Basierend auf Forschungsinteressen, diese Ansätze können leicht extrapoliert werden zu jedem Endothelzellen oder Leukozyten Systeme und entzündlichen Profil. Sobald die endotheliale Parameter in den ausgewählten Bedingungen definiert sind, können das System neue Medikamente auf den vorgeschlagenen Experimente auszuwertende Kreislauf Aktivierung testen. Entzündlichen dabei die Endothel-Zellen getestet mit der Verbindung von Interesse können an die Kontrolle der Zellen verglichen werden, und alle sich daraus ergebenden Unterschiede informieren das Medikament prognostische Ergebnis auf Entwicklung und das Fortschreiten der Entzündung. Abschließend möchte ich sagen, schlagen wir einen relevanten System zur Charakterisierung neue Angriffspunkte, die Endothelzellen, die das Design neuartiger vaskulären-spezifische Therapien gegen entzündliche Erkrankungen beeinflussen können.

Protokoll

1. Endothelial Cell Culture

1. 1. Mantel 100 mm Gewebekultur Platten mit 2,5 mL Gelatine Gewebekultur behandelt Platten Lösung (autoklaviert, 0,1 % Gelatine in destilliertem Wasser) für 30 min bei 37 ° C; dies kann in das erforderliche Format gut extrapoliert werden. Aspirieren Sie die Gelatine-Lösung und Platten in der Gewebekultur-Haube an der Luft trocknen lassen.
2. Gewebe Kulturbedingungen
   1. pflegen die MLEC-04-Zellen in einem biologischen Brutmaschine (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO ₂). Wachsen die Zellen in komplette Medien Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F-12) ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin (P/S).
   2. Der Zellen zählen, indem Sie die Standardmethode der Neubauer-Kammer und die 100 mm Gelatine-behandelten Platten in 10 mL komplette Medien, bei einer geringen Dichte von 2-11 x 10 ⁴ Zellen/cm ² MLEC-04 Zellen hinzufügen. Zellen 1:3 zu teilen, wenn sie Confluence erreichen.
      Hinweis: Dies tritt in der Regel nach zwei bis drei Tagen in der Kultur.
   3. Subkultur der Zellen durch das Waschen der Platten mit 10 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 % Trypsin, 5 mM EDTA) und inkubieren Sie für 3 min bei 37 ° c
   4. Die Trypsin-EDTA-Reaktion zu stoppen und die suspendierten Zellen durch Zugabe von 10 mL komplette Medien zu erholen. Spin-down der Zellen (300 X g, 5 min), den Überstand verwerfen, entsprechend der zelluläre Pellet in komplette Medien und Subkultur Aufschwemmen.

2. LPS-Behandlung und Mediatoren

1. Platte MLEC-04 Zellen in komplette Medien an Sub-Mündung in den folgenden-well-Format: 7 x 10 ⁵ Zellen/gut auf 6-Well Platten und 2,5 x 10 ⁵ Zellen/Brunnen auf 96-Well Platten.
2. Brüten die Kultur für 6 h in einer Zelle Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO ₂). Wechseln Sie die Zellen zu unvollständige Medien (DMEM-F12, P/S) und lassen Sie über Nacht (ON), synchronisieren und die Zellaktivität zu verringern.
3. Entfernen Sie das Medium und testen Sie neuartige pharmakologische Substanzen durch Inkubation der Endothelzellen mit (oder ohne) das Medikament in Frage (z.B. DT ¹⁰) verdünnt in den unvollständigen Medien (30 min, 37 ° C); 1,4 mL hinzufügen/sowie für 6-Well-Platte oder 0,14 mL/gut für 96-Well Platten).
4. Fordern die Zellen durch die Inkubation Medien (100 ng/mL, Endkonzentration) für den Zeitraum in jedem Assay LPS hinzufügen. PBS als ein Steuerelement verwenden.

3. Bewertung der transkriptionellen Profil auf aktiviert Endothelium von RT-qPCR

1. MLEC-04 Samenzellen an Sub-Mündung in 6-Well Kultur Platten (7 x 10 ⁵ Zellen/Na). 6 h (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO ₂) inkubieren und fahren Sie anschließend mit Serum Hunger (inkubieren ON).
2. Entfernen Sie das Medium und die Endothelzellen Kulturen mit der Droge von Interesse in die unvollständigen Medien (30 min, 37 ° C inkubieren) verdünnt; 1,4 mL hinzufügen/sowie für 6-Well-Platte (30 min, 37 ° C) zu behandeln (oder nicht behandeln).
3. Fordern die Zellen durch Zugabe von 100 ng/mL LPS zu den inkubierten Medien (wie in Schritt 2.3 beschrieben) und inkubieren Sie für 6 h. stoppen die Reaktion durch Waschen zweimal mit kaltem PBS und Platten bei-80 ° C bis Probenverarbeitung.
4. RNA-Extraktion
   1. tauen die Platten und fügen Sie 1 mL/Well RNA-Extraktionspuffer (38 % Phenol und 0,8 M Guanidinium erfolgt; siehe Tabelle Materialien). Lassen Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT) unter Unruhe und sammeln Homogenat in 1,5 mL Tuben.
   2. Fügen Sie 200 µL Chloroform und schütteln sanft für 15 S. Inkubation für 3 min bei RT und Zentrifuge (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
   3. Transfer wässrigen Phase zu einer anderen 1,5 mL-Tube. Überstürzen Sie RNA durch Zugabe von 500 µL Isopropanol gefolgt von eine 10 min Inkubation bei RT und dann Zentrifugation (11.600 x g, 4 ° C).
   4. Den Überstand verwerfen und waschen Sie die Pellets mit 75 % Ethanol von Vortex Agitation und anschließend Zentrifugieren (7.500 x g, 4 ° C).
   5. An der Luft trocknen die Pellets und solubilisieren RNA in 25 µL reine H ₂ O durch Inkubation für 10 min bei 55 ° c halten RNA bei-80 ° C bis Probenverarbeitung.
5. Menge und Reinheit der RNA
   1. quantifizieren die RNA-Konzentration durch Messung der Extinktion der Probe bei 260 nm in einem Spektrophotometer (siehe Tabelle der Werkstoffe).
   2. Maßnahme bei 230 nm und 280 nm auf die RNA-Reinheit bestimmen.
      : Hinweis das Verhältnis bei 260/280 Protein oder Phenol Kontamination. Ein Verhältnis in der Nähe von 2 ist akzeptabel. Das Verhältnis bei 260/230 kennzeichnet EDTA, Kohlenhydrate oder Phenol Verunreinigungen. Zulässig sind Werte zwischen 2.0-2.2.
6. RNA checking Integrität
   1. Run 2 µg Gesamt-RNS und einer RNA ladder auf einem 1,5 % denaturierenden Agarosegel; auf einem Gel-Dokumentationssystem visualisieren (siehe Tabelle der Werkstoffe).
      : Hinweis ein 2:1 Verhältnis von klar und scharf 28 s und 18 s rRNA Bands eine intakte RNA. Teilweise abgebaut RNA löst als ein verschmiert aussehen.
7. RT-qPCR
   1. synthetisieren die komplementäre DNA (cDNA) aus einer einzigen gestrandeten RNA nach Standard-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) ¹¹.
8. Evaluate Genexpression durch RT-qPCR
   1. bereiten das Reaktionsgemisch für jede Probe: Mix 2 µL cDNA, 7 µL fluoreszierende Verbindung, 300 nM nach vorn Grundierung und 300 nM rückwärts-Primer (Tabelle 1) in einem Endvolumen von 13 µL und 96-Well-Reaktion-Platte hinzufügen (siehe Tabelle der Werkstoffe).
   2. Dichtplatte mit optischen selbstklebende Abdeckung, Zentrifuge (300 X g, 1 min) und die Reaktion auf eine Real-Time PCR System laufen (hot-Start-95 ° C für 20 s gefolgt von 40 Zyklen: 95 ° C für 3 s und 60 ° C für 30 s) (siehe Tabelle der Werkstoffe).
   3. Analyse der Ergebnisse durch relative Quantifizierung der vergleichenden Methode 2 ^-ΔΔCt mit dem Housekeeping-Gene-Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) oder sauren ribosomale Phosphoprotein P0 (36B4) ¹² .

4. Endotheliale Aktivierung mittels Durchflusszytometrie zu bewerten

1. die MLEC-04-Zellen, die nach den in Abschnitt 2 beschriebenen Bedingungen zu behandeln und Werten Sie die Änderungen in die Endothelzellen Oberflächenproteine von Durchflusszytometrie.
2. Trennen die Zellen nach 6 h der LPS Stimulation mit der beschriebenen Trypsin-EDTA-Verfahren Schritt 1.2.3 und waschen mit den unvollständigen Medien bei 4 ° c
3. Zählen die Zellen mit der Neubauer-Kammer-Methode und 10 x 10 ⁴ Zellen in u-Boden-96-Well-Platten. Zentrifuge (300 X g, 5 min) und entsorgen Überstand durch eine 180° Einrasten des Handgelenks von oben nach unten und schnelle Wiederherstellung in seine Ausgangsstellung.
4. Fügen Sie 50 µL der ausgewählte Antikörper in den unvollständigen Medien (10 µg/mL, Endkonzentration) verdünnt, um die Zellen und inkubieren (30 min, 4 ° C).
5. Waschen die Zellen zweimal wITH die unvollständigen Medien nach dem Verfahren gemäß Schritt 4.3 und inkubieren Sie mit 50 µL 10 µg/ml des entsprechenden sekundären Antikörpers gekoppelt an FITC oder eine ähnliche Konjugat (30 min, 4 ° C in einem dunklen Raum).
6. Die Zellen einmal mit den unvollständigen Medien, gefolgt von einem PBS waschen waschen. Die Zellen mit 300 µL PBS mit 1 mL Pipette Tipps zu erholen und in Cytometry Röhren.
7. Bewerten die Proben in der Flow-Zytometrie-System (siehe Tabelle der Materialien). Die Zell-Population durch die nach vorne und Seite Streuung Parameter anpassen. Tor der Bevölkerung von Interesse. Passen Sie Tore, basierend auf der negativen Kontrolle von Zellen inkubiert mit Isotype Steuerung an. Analysieren Sie die Ergebnisse als der Anteil der positiven Zellen oder bedeuten Fluoreszenz Intensität ⁸.

5. Endotheliale Aktivierung durch Western Blot auswerten

1. Samen des Endothels an Sub-Mündung in Kultur 6-Well-Platten (7 x 10 ⁵ Zellen/Na) und mit LPS zu behandeln, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Die entzündlichen Proteinexpression analysieren, indem Sie das folgende Protokoll der western-Blot.
2. Stoppen die LPS-Stimulation zu unterschiedlichen Zeitpunkten verschiedene Aspekte der endothelialen Antwort aufzuklären:
   1. festzustellen, die entzündliche Proteine Profil nach 6 h der LPS Stimulation.
   2. Bestimmen die Zelle alle 15 min über einen Zeitraum von 60 min.
3. In beiden Fällen beenden die Reaktion durch Waschen zweimal mit kaltem PBS und speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis Probenverarbeitung.
4. Lyse der Zellen und Proteingewinnung
   1. fügen Sie 200 µL Lyse Puffer in jede Vertiefung (1 % nichtionische Tenside, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, Natrium-Chlorid-150 mM, 30 mM Natrium Pyrophosphat, 50 mM Natriumfluorid, 2,1 mM Natrium Orthovanadate an pH 7.6, ergänzt mit Protease-Inhibitor cocktail) (siehe Tabelle der Werkstoffe).
   2. Inkubieren für 15 min bei 4 ° C unter schütteln, kratzen Brunnen mit einer Pipettenspitze und sammeln das Homogenat in 1,5 mL Tuben.
   3. Zentrifugieren der Rohre bei 11.600 x g bei 4 ° c
   4. Überstand in sauberen 1,5 mL Röhrchen bei-80 ° C bis zur Verarbeitung lagern.
5. Maßnahme die Proteinkonzentration von Bicinchoninic Acid Assays nach Standard-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) ¹³.
6. Lösen die 30 µg Gesamt-Protein lysate für jede Probe, indem die Standardtechnik der 0,1 % Dodecyl Natriumsulfat, 10 % Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ¹⁴. Proben laufen, mit 10 mM β-Mercaptoethanol (reduzierenden Bedingungen) oder ohne (nicht-reduzierenden Bedingungen) abhängig von der Antikörper verwendet, um das Protein des Interesses zu erkennen.
7. Übertragen die getrennten Proteine aus dem Polyacrylamid-Gel auf einem Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Transfer Membrane mit 0,45 µm Porengröße mit Standardverfahren.
8. Nach Transfer, waschen Sie die Membran zweimal mit PBS, 0,1 % Polysorbat-20 (PBS-T) und unspezifischen Bindungsstellen durch Zugabe von 20 mL 2 % BSA in PBS-T für erkannten Phosphoproteine oder 5 % fettfreie Trockenmilch im PBS-T für total Proteine unter Erregung (90 min, verdünnt zu blockieren RT).
9. Den ausgewählten Antikörper in 10 mL des entsprechenden blockierende Puffers in der empfohlenen Konzentration zu verdünnen und inkubieren Sie die Membran unter Erregung (ON, 4 ° C). Alternativ legen Sie die Membran in verschlossenen Plastiktüten und 5 mL der verdünnten Antikörper verwendet.
10. Nächsten Tag waschen die Membran drei Zeiten (überschüssige PBS-T, 15 min, RT).
11. Inkubation die Membran unter Agitation (30 min, RT) mit 10 mL der Korrespondent Sekundärantikörper, Meerrettich-Peroxidase (HRP verpflichtet) verdünnt 1: 10.000 im entsprechenden blockierende Puffer.
12. Waschen die Membran dreimal unter Erregung (überschüssige PBS-T, 15 min, RT).
13. Inkubieren Sie die Membran 1 min mit 0,1 mL/cm ² von Peroxidase Substrat verstärkte Chemilumineszenz (ECL). Legen Sie die durchlässige Membran zwischen zwei transparenten Kunststoffplatten, und fügen Sie es in der Chemilumineszenz-Detection-System umfasst eine Charged-Coupled Kamera (CCD).
    1. Die CCD-Kamera verwenden, um das Signal und seine Software zur Aufnahme von Bildern mit dem addierten Programm erkennen (Bildanzeige angesammelten Signal an alle 30 s Belichtung insgesamt 15 min lang).
14. Quantifizieren die Band Intensität von Densitometrie mit ImageJ-Software nach dem Protokoll beschrieben in der Benutzer-Führer- ¹⁵.
    1. Die Probe in der ImageJ-Software öffnen und wählen Sie die Band mit rechteckigen Auswahlwerkzeug.
    2. Wählen Sie, wie der erste Spur und Presse Gassen Plot um den Profil-Parzellen zu erhalten.
    3. Begrenzen den Bereich der Gipfel mit der geradlinigen Auswahl.
    4. Die Größe der einzelnen Bänder zu messen, indem Sie auf der Innenseite jeder Gipfel.
    5. Stellen die Ergebnisse in Bezug auf Protein Ladekontrolle (β-Actin, Tubulin, etc.).

6. Bewerten, endothelialer Faktor befreit Leukozyten-Aktivierung durch Adhäsion Assays

1. die endothelialen konditionierten Medien erhalten.
   1. Die MLEC-04-Zellen zu behandeln, wie in Abschnitt 2 erläutert und sammeln die Kultur überstand nach 24 h Stimulation mit LPS (100 ng/mL).
   2. Erfassen die konditionierten Medien von den behandelten MLEC-04 Zellen und Zentrifuge (600 X g). Den Überstand in 0,5 mL Aliquote bleiben bei-80 ° C bis zur Verwendung.
2. Leukozyten Adhäsion Assay
   1. 96-Well-Platten mit 50 µL/Well des ausgewählten extrazelluläre Matrixproteine verdünnt mit PBS-Puffer (mit Ausnahme von Kollagen, das in 0,1 M Essigsäure verdünnt wird) zu beschichten: Fibronektin (1-10 µg/mL ), Laminin (1-10 µg/mL) und Kollagen Typ I (10-40 µg/mL). Leave-ON bei 4 ° c
   2. Die beschichteten Medien zu verwerfen und blockieren unspezifischen Bindungsstellen an Brunnen mit 150 µL PBS, 1 % BSA Hitze-inaktivierten (1 min., 100 ° C) für 90 min bei RT.
   3. Brunnen zweimal mit PBS waschen und 100 µL der zuvor gesammelten endotheliale konditioniert Medien (Abschnitt 6.1) in die Vertiefungen hinzufügen.
      Hinweis: Platten sind bereit für die Durchführung des Adhäsion Tests.
   4. Kultur der Maus Monocyte-Makrophagen-Zelllinie J774 in einem biologischen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO ₂) mit Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10 % FBS, 1 % P/S.
      Hinweis: Die J774 Zellen in Suspension wachsen.
   5. Sammeln die J774 Zellen in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge (300 X g, 5 min). Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der zellulären Pellets mit 10 mL serumfreie Medien. Zählen der Zellen in einer Neubauer-Kammer. Die Zellen (300 X g, 5 min) zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in serumfreien Medien an 15 x 10 ⁴ J774 Zellen pro 50 µL Medien.
   6. Add 15 x 10 ⁴ J774 Zellen zueinander auch in 50 µL serumfreie Medien und 15 min bei 4 ° C, gefolgt von 1 h bei 37 ° C in der CO ₂ Zelle Inkubator inkubieren.
   7. Waschen die Brunnen zweimal, sanft durch Zugabe von warmen PBS; Zentrifugieren (300 X g, 5 min) und überstand durch eine 180°-Snap des Handgelenks von oben nach unten und schnelle Wiederherstellung in die ursprüngliche Position zu verwerfen. Die beigefügte Zelle zu behebens durch Zugabe von 100 µL/Well von 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer und inkubieren (10 min, RT).
   8. Verwerfen die Medien sanft und permeabilize der Zellen mit 2 % Methanol mit PBS-Puffer für 2 min bei RT. verwerfen die Medien sanft und färben die Zellen durch Zugabe von 50 µL/Well von 0,5 % Kristallviolett in 20 % Methanol für 90 s bei RT
   9. Die Platte mit reichlich fließendem Wasser waschen, verwerfen Sie die überschüssige Flüssigkeit und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Die angeschlossenen Zellen durch Digitalkamera gekoppelt mit einem Lichtmikroskop melden.
   10. Verdünnen die Zelle Färbung durch Zugabe von 100 µL/Well von 0,1 M Natriumcitrat, 50 % Ethanol. Maßnahme der Extinktion bei 545 nm und repräsentieren die Ergebnisse als willkürliche Einheiten der Extinktion oder Prozentsatz der Adhäsion durch die Berücksichtigung von 100 % als Zelladhäsion nach Wells erreicht mit höheren Liganden-Konzentration beschichtet

7. Endotheliale Aktivierung von Leukozyten-Endothel Co Adhäsion Assay zu testen

1. MLEC-04-Zellen auf 96-Well Platten zu behandeln, wie in Abschnitt 2 beschrieben und inkubieren Sie mit LPS (6 h, 37 ° C).
2. Eindringmittel beschriften J774 Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
   1. Waschen die J774 Zellen mit PBS-Puffer nach dem Verfahren des 6.2.5. Anzahl der Zellen durch die Neubauer Kammer-Methode und 1 x 10 ⁶ Zellen/ml in PBS, 0,1 % BSA Aufschwemmen.
   2. Inkubation der Zellen mit CFSE (5 µM, Endkonzentration) für 20 min bei 37 ° C. hinzufügen 5 mL unvollständige Medien und inkubieren (5 min, 4 ° C).
   3. Einmal waschen mit unvollständigen Medien wie in 6.2.5 erklärt., bei 15 x 10 ⁴ Zellen/100 µL Aufschwemmen und fahren Sie mit Co Adhäsion Assay.
3. Nach der Endothel-Behandlung Waschen die Brunnen dreimal mit unvollständigen Medien. Fügen Sie CFSE--J774 Zellen (15 x 10 ⁴ Zellen/100 µL hinzu) zueinander endotheliale beschichtet gut. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei 4 ° C, gefolgt von 60 min bei 37 ° c
4. Waschen die Brunnen sanft, wie beschrieben in 6.2.7., mit erwärmten PBS und melden die J774 Adhäsion auf die endotheliale Schicht durch die folgenden zwei Methoden:
   1. Lyse der Zellen in 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1 % SDS (100 µL/Well) und Messen Sie die CFSE--J774 Signal durch Fluorometry (Erregung/Emission = 492 nm/517 nm). Stellen Sie die Ergebnisse als willkürliche Einheiten der Fluoreszenzintensität oder Prozentsatz der Haftung in Bezug auf Positivkontrolle (Signal vom gesamten Zellen hinzugefügt in jede Vertiefung).
   2. Fixieren den Zellen bei 4 % PFA und Bericht der Befestigung der CFSE--J774 Zellen des Endothels durch die Visualisierung unter dem Fluoreszenzmikroskop (Anregung/Emission = 492 nm/517 nm).

Ergebnisse

Bewertung von LPS-induzierte endothelialer Zellaktivierung durch RT-qPCR

Die Serum verhungert MLEC-04 Zellen wurden von 100 ng/mL von LPS 6 h stimuliert, und die endotheliale Genexpression wurde anhand RT-qPCR durch den Vergleich des Ausdrucks der Aktivierungsmarker auf den ruhenden Zustand. Wie in Abbildung 1Adargestellt, induziert die LPS inkubiert MLEC-04-Zellen die mRNA Expression von ausgewählten...

Diskussion

Dieses Endothel Protokoll beschreibt eine schrittweise Technologie, die legt den Grundstein für die Erforschung neuartiger Mechanismen an der Regulation der Entzündungsreaktion beteiligt. Diese Ansätze basieren auf der Untersuchung der endothelialen Aktivität angeregt durch LPS und bewerten die entscheidenden Schritte, speziell bei der Rekrutierung von Leukozyten während der entzündlichen Reaktion beteiligt: endotheliale Cytokine Freigabe, endotheliale Haftung Moleküle Ausdruck und Leukozyten Adhäsion der vaskul?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin	Sigma	G9391
DMEM-F12	Lonza	BE12-719F
Fetal Bovine Serum	Sigma	A4503
Penicillin streptomycin	Lonza	DE17-602E
Trypsine	Lonza	BE17-160E
EDTA	Sigma	ED2SS
LPS	Sigma	L2880
Trizol	Sigma	T9424	RNA extraction buffer
Isopropanol	Sigma	33539
Ethanol absoluto	Panreac	1,310,861,612
Pure H2O	Qiagen	1017979	RNAse free
Agarose	Pronadisa	8020
Stain for agarose gels	Invitrogen	s33102
SuperScript III First-Strand Synth	Invitrogen	18080051	Reagents for RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385610	Fluorescent stain for qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-Well	Applied Biosystems	4346906	Plates for qPCR
U-bottom 96 well plates	Falcon	353072
Cytometry tubes	Falcon	352054
TX100	Panreac	212314	Non-ionic surfactant
Tris-HCl	Panreac	1,319,401,211
Sodium chloride	Merck	1,064,041,000
Sodium pyrophosphate	Sigma	221368
Sodium fluoride	Sigma	S7920
Sodium orthovanadate	sigma	13721-39-6
Protease inhibitor cocktail	sigma	P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225	Reagents for bicinchoninic acid assay
β-mercaptoethanol	merck	805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm	Thermo Scientific	88518
Tween-20	Panreac	1,623,121,611	Polysorbate 20
PBS	Lonza	BE17-515Q
ECL	Millipore	WBKLS0500
Fibronectin	Sigma	F1141
Laminin	Sigma	L2020
Collagen type I	Sigma	c8919
Acetic acid	Panreac	1,310,081,611
Trypan blue	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Methanol	Panreac	1,310,911,612
Crystal violet	Sigma	HT90132
Sodium citrate	Sigma	C7254
Ethanol 96%	Panreac	1,410,851,212
CFSE	Sigma	21888
RPMI	Lonza	BE12-115F
SDS	Bio-Rad	161-0418
Infinite M200	Tecan	M200	Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000	Bio-Rad	2000	Gel documentation system
StepOnePlus	Applied Biosystems	StepOnePlus	qPCR system
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	Analyzer 10	Cytometry equipment
ChemiDoc MP	Bio-Rad	MP	Chemiluminescence detection system
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
PECAM-1	BD Biosciences	553370	Use at 10 µg/mL
ICAM-2	Biolegend	1054602	Use at 10 µg/mL
E-selectin	BD Biosciences	553749	Use at 10 µg/mL
VCAM-1	BD Biosciences	553330	Use at 10 µg/mL
ICAM-1	Becton Dickinson	553250	Use at 10 µg/mL
anti-rat IgG-FITC	Jackson Immuno Research	112-095-006	Use at 10 µg/mL
anti armenian hamster-FITC	Jackson Immuno Research	127-095-160	Use at 10 µg/mL
Rat IgG isotyope control	Invitrogen	10700	Use at 10 µg/mL
Armenian hamster IgG isotype control	Invitrogen	PA5-33220	Use at 10 µg/mL
P-IκΒ-α	Cell Signaling	2859	Use at 10 µg/mL
β-Actin	Sigma	A5441	Use at 10 µg/mL
P-ERK	Cell Signaling	9101	Use at 10 µg/mL
anti-mouse HRP	GE Healthcare	LNXA931/AE	Use at 1:10,000
anti-rabbit HRP	GE Healthcare	LNA934V/AG	Use at 1:10,000
anti-rat HRP	Santa Cruz	Sc-3823	Use at 1:10,000