Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Zusammenfassung

Infektiöse cDNA-Klone erlauben die genetische Manipulation eines Virus und erleichtern so die Arbeit an Impfstoffen, Pathogenese, Replikation, Übertragung und Virusentwicklung. Hier beschreiben wir den Aufbau eines infektiösen Klons für Zika Virus (ZIKV), der derzeit einen explosiven Ausbruch in Nord- und Südamerika verursacht. Um Toxizität gegenüber Bakterien zu verhindern, die häufig mit Flavivirus-abgeleiteten Plasmiden beobachtet wird, erzeugten wir ein Zwei-Plasmid-System, das das Genom am NS1-Gen trennt und stabiler ist als Volllängen-Konstrukte, die ohne Mutationen nicht erfolgreich gewonnen werden konnten. Nach der Verdauung und Ligation, um die beiden Fragmente zu verbinden, kann eine Volllängen-Virus-RNA durch in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Nach der Elektroporation von transkribierter RNA in Zellen wurde das Virus gewonnen, das ähnliche In-vitro- Wachstumskinetiken und In-vivo- Virulenz- und Infektions-Phänotypen in Mäusen und Mücken zeigte.

Einleitung

Zika-Virus (ZIKV, Familie Flaviviridae : Gattung Flavivirus ) ist ein Moskito-getragenes Flavivirus, das in Brasilien in den Jahren 2013-14 angekommen ist und anschließend mit einem massiven Ausbruch der fiebrigen Krankheit verbunden war, die sich in ganz Amerika verbreitete ¹ . Darüber hinaus wurde ZIKV mit schwerwiegenden Erkrankungen wie dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen und Mikrozephalie bei Föten und Neugeborenen verknüpft ² . Wenig war über ZIKV vor seiner schnellen Verbreitung in der westlichen Hemisphäre bekannt. Dazu gehört ein Mangel an molekularen Werkzeugen, was die mechanistische Forschung behindert. Molekulare Werkzeuge für Viren, wie infektiöse cDNA-Klone, erleichtern die Impfung und die antivirale therapeutische Entwicklung und ermöglichen die Bewertung von viralen genetischen Faktoren, die mit der differentiellen viralen Pathogenese, der Immunantwort und der viralen Evolution zusammenhängen.

Flavivirus-infektiöse Klone sind bekannt, dass sie in Bakterien aufgrund von cr stark instabil sindYptische prokaryotische Promotoren, die in ihren Genomen vorhanden sind ³ . Es wurden mehrere Ansätze verwendet, um dieses Problem zu lindern; Einschließlich der Insertion von Tandemwiederholungen stromaufwärts von viralen Sequenzen ⁴ , Mutation von mutmaßlichen prokaryotischen Promotorsequenzen ⁵ , Aufteilen des Genoms in mehrere Plasmide ⁶ , Vektoren mit niedriger Kopienzahl (einschließlich bakterieller künstlicher Chromosomen) ^{7 , 8} und Insertion von Introns im viralen Genom ⁹ . Ein einseitiges System ohne Modifikationen wurde für ZIKV beschrieben; Dieser Klon schien jedoch in der Zellkultur und bei den Mäusen ¹⁰ zu dämpfen. Andere Gruppen haben Introns in das ZIKV-Genom konstruiert, was eine Störung von instabilen Sequenzen in Bakterien ermöglicht, die in Säugetierzellen in vitro zur Herstellung von infektiösem Virus ¹¹ gespleißt werden können^{, 12} Zusätzlich wurde ein PCR-basiertes System mit dem Titel Infectious-Subgenomic-Amplicons erfolgreich eingesetzt, um den Prototyp MR766-Stamm von ZIKV ¹³ zu retten. Der hier beschriebene Ansatz erfordert keine Fremdsequenzen, sondern stört das Genom im Bereich hoher Instabilität durch die Verwendung mehrerer Plasmide, die bisher erfolgreich mit Gelbfieber ⁶ , Dengue ^{14 , 15} und West-Nil-Viren ¹⁶ verwendet wurden. Darüber hinaus erleichtert die Zugabe der Hepatitis-D-Ribozym-Sequenz an den viralen genomischen Termini die Schaffung eines authentischen 3'-Endes ohne die Notwendigkeit der Addition einer Linearisierungsstelle. Zusätzlich werden beide Plasmide in einem Vektor mit niedriger Kopienzahl (pACYC177, ~ 15 Kopien pro Zelle) konstruiert, um jegliche Resttoxizität ¹⁷ zu mildern. Das gewonnene Virus zeigt ein vergleichbares Wachstumsprofil anElterliches Virus in in vitro Wachstumskurven in 8 Zelllinien, die eine Vielzahl von Zelltypen umfassen, die von Säugetieren und Insekten abgeleitet sind, und hat identische pathogene Profile bei Mäusen und Infektions-, Verbreitungs- und Übertragungsraten in den Mücken ^{18 gezeigt} .

Hierin beschreiben wir ein Protokoll, in dem beschrieben wird, wie man die infektiösen Klonplasmide wächst, in vitro eine Volllängen-Virus-RNA (das virale Genom) erzeugt und in der Zellkultur ein infektiöses Virus wiederherstellt. Zuerst beschreiben wir die Ausbreitung von Plasmiden in Bakterien oder bakterienfreien Verstärkung mittels Rollkreisverstärkung (RCA). Als nächstes zeigen wir, wie die beiden Plasmide verdaut werden und dann anschließend miteinander ligiert werden, um ein Volllängenvirus zu erzeugen. Schließlich beschreiben wir die Produktion von transkribierter RNA und deren anschließende Elektroporation in Vero-Zellen, gefolgt von Titration des gewonnenen Virus (Abbildung 1 ). Der beschriebene Ansatz ist schnell, so dass foR Erholung von infektiösen Virusbeständen in 1-2 Wochen.

Protokoll

1. Transformation und Wiederherstellung von infektiösen Klonplasmiden

1. Transformieren Sie beide Plasmide (getrennt) unter Verwendung eines kommerziellen Transformationsprotokolls ( z. B. NEB 5 Minute Transformation Protocol) mit einigen Modifikationen. Beide Plasmide enthalten ein für die Ampicillinresistenz kodierendes Gen, daher verwenden sie Ampicillin oder Carbenicillin zur Selektion. Carbenicillin wird bevorzugt, da es stabiler ist.
   1. Entfernen Sie die Zellen (siehe Materialtabelle) von -80 ° C Gefrierschrank und tauen Sie auf Eis für 5-10 min. Prewarm Lysogeny Brühe (LB) (mit 10 g / l NaCl und 25 μg / ml Carbenicillin, genannt LB-Carb) Platten und die Brühe mit Catabolit Repression (SOC (ohne Antibiotika) - kommen mit den Zellen) bei 37 ° C.
   2. Füge zwischen 100 pg-10 ng in 1 μl Plasmid-DNA zu einem Röhrchen hinzu, das 50 μl kompetente Zellen enthält; Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Tube schlagen.
   3. Röhrchen auf Eis für 5 min inkubieren.
   4. Hitzeschockrohre bei 42 ° C für 30 sIn einem wasserbad Rückkehr zum Eis für 2 min unmittelbar nach Hitzeschock.
   5. 950 μl Raumtemperatur SOC in jedes Röhrchen pipettieren und durch Pipettieren mischen. 100 μl des Bakteriengemisches auf eine LB-Carb-Platte auftragen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren (ca. 12-14 h).
2. Entfernen von Platten aus 37 ° C Inkubator nach 12-14 h Inkubation. Legen Sie die Platten in eine dunkle Schublade bei Raumtemperatur, damit Kolonien weiter wachsen (ca. 8-9 h).
3. Unter Verwendung von 5 ml Terrific Brühe (TB, enthaltend 25 & mgr; g / ml Carbenicillin, genannt TB-Carb), wachsen 5-10 kleine Kolonien für jedes Plasmid über Nacht bei 30 ° C in einem Bakterienschüttler (etwa 14-16 h).
   HINWEIS: Kleine Kolonien sind ein Indikator dafür, dass das Plasmid intakt ist; Kolonien mit Plasmiden, die Deletionen, Umlagerungen oder Mutationen enthalten (hierin Instabilitätsereignisse genannt), werden schneller wachsen und sind daher größer. Deshalb sollte man versuchen, die kleinsten Kolonien auf dem Teller zu holen, namentlichT Auswahl der größten Kolonien vorhanden. Einige mittelgroße Kolonien können auch für Vollständigkeit ausgewählt werden. Die niedrigere Temperatur reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen überwachsen (OD ₆₀₀ von größer als 0,6-0,8). Da die meisten Forscher über Nacht Wachstum durchführen, ermöglicht es mehr Kontrolle und reduzierte Chance der Überwucherung.
4. Prüfen Sie flüssige Kulturen auf Trübungen (ca. OD ₆₀₀ von 0,6-0,8). Legen Sie alle trüben Rohre auf 4 ° C und lassen Sie andere Röhrchen trüben, indem Sie länger wachsen.
   HINWEIS: Bakterien nicht auf OD _600- Werte wachsen, die größer als empfohlen sind, da Plasmid-Instabilitätsereignisse auftreten können.
5. Extrahieren Sie Plasmid-DNA aus Bakterien mit einem handelsüblichen Plasmid-Miniprep-Kit (siehe Materialtabelle). Eluieren in 15 & mgr; l vorgewärmtem (bis 70 ° C in einem Heizblock) Elutionspuffer. Lassen Sie den Elutionspuffer 5 Minuten lang vor der Zentrifugation auf die Säule inkubieren.
   HINWEIS: Bewahren Sie mindestens 1 ml dieser Starterkultur bei 4 ° C fürWeiter im nächsten Schritt.
6. Digg 10 & mgr; l der gewonnenen Plasmide, um zu beurteilen, ob Plasmid-Instabilitätsereignisse während der Kultur auftraten.
   HINWEIS: Digit p1 mit SalI / NheI und p2 mit BamHI / HindIII bei 37 ° C für 1 h. Bestätigen Sie die Anwesenheit der korrekten Banden nach der Verdauung (Abbildung 2a ) durch Gelelektrophorese und fahren Sie mit Schritt 2 fort. Wenn Sie Plasmid-DNA durch Walzkreisverstärkung (RCA) vorbereiten, reservieren Sie ein Teil des Miniprep-Eluats, um als Vorlage zu dienen.

2. Herstellung von ausreichend Plasmid-DNA zur Ligation

HINWEIS: Die Ligation und die anschließende Elektroporation erfordert eine ausreichende Menge an Plasmid-DNA, die entweder über Maxiprep oder RCA erzeugt werden muss. Während maxiprep der traditionell verwendete Ansatz ist, bietet RCA den Vorteil, dass keine Bakterien erforderlich sind, wodurch das Potential für die Plasmid-induzierte Toxizität in Bakterien, die zu Instabilitätsereignissen führen können, entfernt wird.

1. Führen Sie das folgende maxiprep-Verfahren durch.
   1. Für jedes Plasmid, das im vorigen Abschnitt das korrekte Restriktionsenzym-Verdauungsmuster nachgewiesen hat, fügen Sie 500 & mgr; l Starterkultur zu 1 l TB-Carb (25 & mgr; g / ml Carbenicillin) -brühe hinzu und schütteln über Nacht bei 30 ° C (ungefähr 14-16 h , Etwa OD ₆₀₀ von 0,6-0,8).
      HINWEIS: Lassen Sie die Kultur nicht über diesen OD _600- Wert wachsen. Dies führt möglicherweise zu Instabilitätsereignissen innerhalb der Plasmide.
   2. Ernten Sie die Bakterien und führen Sie maxipreps pro Hersteller-Protokoll (siehe Material-Tabelle).
2. Verwenden Sie die gespeicherten Miniprep ab Schritt 1.6, führen Sie die folgenden für die RCA-Prozedur durch.
   1. Übertragen Sie 1 & mgr; l Plasmid-DNA in ein Röhrchen, das 50 & mgr; l Probenpuffer enthält.
   2. Die Probe bei 95 ° C für 3 min erhitzen und dann bei 4 ° C inkubieren, bis sie gebrauchsfertig sind.
   3. Bereitet die kommerzielle Verstärkung vorVormischung (siehe Werkstofftabelle ). Kombinieren Sie 50 μl Reaktionspuffer mit 2 μl Enzymmischung in einem auf Eis eingesetzten Röhrchen.
      HINWEIS: Die Amplifikationsvormischung sollte bis zum Gebrauch auf Eis gehalten werden. Es ist zweckmäßig, eine Mastermischung durch Kombination von ausreichenden Reagenzien für die erforderliche Anzahl von Amplifikationsreaktionen herzustellen. Eine nicht genutzte Vormischung muss verworfen werden.
   4. Übertragen Sie 50 & mgr; l der vorbereiteten Amplifikationsvormischung auf die denaturierte Probe.
   5. Inkubieren Sie die Reaktionsröhrchen bei 30 ° C für 18 h.
   6. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 65 ° C für 10 min, um die ø29-DNA-Polymerase zu inaktivieren.
   7. Die Reaktionsrohre bei 4 ° C oder -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte die Plasmid-DNA, die über beide Methoden hergestellt wurde, quantifiziert werden (unter Verwendung von Absorption bei 260 nm), und das ZIKV-Genom sollte Sanger sequenziert werden, um zu bestätigen, dass keine Instabilitätsereignisse (Deletionen und Umlagerungen) während der Präparation auftraten.

Primer Name	Sequenz (5 '- 3')
ZIKV PRVABC59 1Für.	AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC
ZIKV konserviert 632Für.	GCCCTATGCTGGATGAGG
ZIKV konserviert 692Rev.	GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG
ZIKV konserviert 1313Rev.	CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA
ZIKV konserviert 1201Für.	CCAACACAAGGTGAAGCCTAC
ZIKV konserviert 1663Für.	GCAGACACCGGAACTCCACACT
ZIKV konserviert 2008Für.	CAGATGGCGGTGGACATGC
ZIKV konserviert 2350Rev.	GTGAGAACCAGGACATTCCTCC
ZIKV konserviert 2605Für.	TACAAGTACCATCCTGACTCCC
ZIKV konserviert 3499Rev.	GCCTTATCTCCATTCCATACCA
ZIKV Konserviert 3961Rev.	TTGCCAACCAGGCCAAAG
ZIKV konserviert 4132Für.	CATTTGTCATGGCCCTGG
ZIKV konserviert 4561Rev.	CTATTGGGTTCATGCCACAGAT
ZIKV konserviert 4665Für.	GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT
ZIKV konserviert 5189Rev.	AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG
ZIKV konserviert 5219Für.	GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA
ZIKV konserviert 6086Rev.	CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC
ZIKV konserviert 6119Für.	GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG
ZIKV konserviert 6721Rev.	CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC
ZIKV konserviert 6769Für.	CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC
ZIKV Konserviert 7209Rev.	ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA
ZIKV Konserviert 7343Für.	GTTGTGGATGGAATAGTGGT
ZIKV Konserviert 8243Für.	TGCCCATACACCAGCACTATGA
ZIKV PRVABC59 8893Rev.	TGCATTGCTACGAACCTTGTTG
ZIKV konserviert 9133Für.	AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA
ZIKV PRVABC59 9673Rev.	AACGCAATCATCTCCACTGACT
ZIKV konserviert 9686Für.	GATGATAGGTTTGCACATGCC
ZIKV Konserviert 10321Rev.	GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT
ZIKV konserviert 10455Für.	CAGGAGAAGCTGGGAAACC
ZIKV konserviert 10621Rev.	CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC

Tabelle 1: Primer zur Sequenzierung von cDNA-Klonen. Plasmide können vollständig mit den aufgeführten Primern sequenziert werden. Primer markiert als "konserviert" indiDass sie wahrscheinlich alle Genotypen von ZIKV sequenzieren / verstärken können. Primer, die als "PRVABC59" markiert sind, sind spezifisch für diesen Stamm, können aber auch für andere asiatische Genotypstämme und möglicherweise auch andere Genotypen funktionieren.

3. Herstellung von in vitro transkribierter RNA

1. Richten Sie die Verdauungsreaktion von entweder maxiprep oder RCA vorbereitete DNA ein.
   1. Zur p1-Verdauung werden 10 μl 10x Reaktionspuffer, 3 μl ApaLI, 3 μl BamHI-HF, 3 μl rSAP oder CIP und 3,3 μg p1 DNA vermischt. Füge ddH ₂ O zu 100 μl hinzu.
   2. Zur p2-Verdauung 10 μl 10x Reaktionspuffer, 3 μl ApaLI, 3 μl EcoRI-HF und 13,3 μg p2 DNA mischen. Füge ddH ₂ O zu 100 μl hinzu.
   3. Inkubieren bei 37 ° C für 1-2 h.
   4. Reinigen Sie mit einem handelsüblichen Gel- und PCR-Clean-up-Kit (siehe Materialtabelle). Eluieren in 30 & mgr; l Elutionspuffer, der auf 70 ° C in einem Heizblock vorgeheizt ist (inkubieren derSpalte für 5 min vor dem Spinnen).
      HINWEIS: Halten Sie 1 μL auf einem Gel später.
2. Ligationsreaktion vorbereiten.
   1. Kombinieren Sie 10 μl 10x T4-DNA-Ligationsreaktionspuffer, 3 μl T4-DNA-Ligase (400 U / μL), 29 μl gereinigtes p1 und 29 μl gereinigtes p2. Füge ddH ₂ O zu 100 μl hinzu.
   2. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 h oder 16 ° C über Nacht.
   3. Reinigen Sie mit einem handelsüblichen Gel- und PCR-Clean-up-Kit (siehe Materialtabelle). Eluieren in 10 & mgr; l Elutionspuffer, der auf 70 ° C in einem Heizblock vorgeheizt wurde (5 Minuten vor dem Spinnen inkubieren).
      HINWEIS: Halten Sie 1 μL auf einem Gel später.
3. Führen Sie unverdaute Plasmide, verdaute Plasmide und Ligation auf einem Agarosegel. Das Ligationsprodukt sollte eine höhere Molekulargewichtsbande (etwa 11 kb) als nur verdautes Plasmid allein aufweisen, was anzeigt, dass die Ligation erfolgreich war ( 2b ).
4. Richten Sie T7 in vitro Transkriptionsreaktion ein.
   1. Kombinieren Sie 10 & mgr; l 2 × ARCA / NTP-Mischung, 2 & mgr; l T7-RNA-Polymerase-Mischung und 8 & mgr; l gereinigte Ligationsreaktion für ein Endvolumen von 20 & mgr; l.
      HINWEIS: Die im Mix enthaltene ARCA ist ein Cap-Analog, das exklusiv in die richtige Orientierung integriert ist. Standard-Cap-Analoga können nur ~ 50% der Transkripte mit einer Kappe in der richtigen Orientierung führen.
   2. 5 h bei 37 ° C inkubieren.
   3. Messung der RNA-Konzentration über ein UV-Spektrophotometer. Gegebenenfalls ein denaturierendes Agarosegel ausführen, um die Länge des RNA-Transkripts zu bestätigen.

4. Rettung des Infektionsvirus durch Elektroporation

1. Tage vor der Elektroporation, 1 T182-Kolben von Vero-Zellen herstellen (zwischen T150 und T182 ist akzeptabel, in DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet) pro zu ersetzendes Konstrukt. Füge 1 T182 als Mock-Transfektionskontrolle ein. CeSollte bei 70-80% Konfluenz verwendet werden.
2. Wenn die Zellen fertig sind, legen Sie 12 ml / Reaktion von DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in ein auf 37 ° C erwärmtes Wasserbad.
3. Lösen Sie Zellen durch Trypsinisierung mit einem Standardprotokoll und gewinnen Sie Zellen in Medien mit 10% FBS, um Trypsin zu inaktivieren; Zentrifugen von Zellen bei 150 xg für 5 min bei 4 ° C.
4. Waschen von Zellen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), Pelletieren von Zellen bei 150 xg für 5 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal für insgesamt drei Wäschen.
5. Resuspendieren von Zellen in 200 & mgr; l RPMI 1640 + 10 mM HEPES (steril) pro Anzahl der Proben. 200 μl Zellsuspension in ein steriles Röhrchen überführen. Zellen sollten ~ 0,5 x 10 ⁷ Zellen / ml sein.
6. Füge 20 μl Wasser (Mock Neg. Kontrolle) oder 20 μl RNA (vorzugsweise 5-10 μg) in Schritt 3.4 zu jedem Satz von Zellen zu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen schlagen und den Inhalt des Röhrchens in eine 2 mm Spalt-Elektroporationsküvette übertragen.
7. Elektrisch einstellenOporator auf 170 V LV, Omega (Widerstand) bei 0 und 950 μF (ca. 625 V / cm und 20 ms Zeitkonstante für andere Maschinen). Stellen Sie den Widerstand auf die niedrigste verfügbare Einstellung ein, entweder 0 oder ∞ falls vorhanden.
8. Pulse einmal und fügt sofort 600 μl DMEM +15% FBS +10 mM HEPES hinzu, das in Schritt 4.2 erwärmt wurde. Innerhalb der Küvette gründlich ausspülen, um alle Zellen zu entfernen. Füge Zellen zu einem T75-Gewebekulturkolben hinzu, der 10 ml vorgewärmtes Medium enthält. Entfernen Sie zusätzliche Medien aus der Küvette, indem Sie die mit der Küvette enthaltene Tropfmaschine verwenden. Sei vorsichtig, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.
9. Wirbelkolben zum Mischen von Medien und Zellen und Platzieren in 37 ° C Inkubator.
10. Überprüfen Sie den nächsten Tag auf die Lebensfähigkeit der Zellen und tun Sie es jeden Tag bis 50-75% Zelltod beobachtet wird. Der Zelltod wird durch Vergleich mit der mockelektroporierten Kontrolle beobachtet.
    HINWEIS: Der ZIKV-Zytopathie-Effekt (CPE) ist in Vero-Zellen sehr ausgeprägt, was zu aufgerundeten Zellen führt, die sich im Kulturmedium ablösen und schwimmen. Wir habenBeobachtete eine Reichweite von 8-10 Tagen als ideal für die Ernte.
11. Ernteüberstand in einem konischen Rohr und zentrifugieren, um Zellschutt bei> 3.000 xg für 10 min bei 4 ° C zu entfernen.
12. Den geklärten Überstand auf ein neues Röhrchen auftragen und mit einer Endkonzentration von 20% FBS (ab 100% Lager) ergänzen. Zusätzlich fügen Sie sterile HEPES in einer Endkonzentration von 10 mM als Puffermittel hinzu, um die Virusinfektiosität zu bewahren, während sie gefroren sind (aus einem 1 M sterilen Bestand).
13. Mischen Sie das Virus durch Vortexen und Aliquot in Schraubverschluss-Durchstechflaschen. Bei -80 ° C für zukünftige Verwendung lagern.

5. Titration des wiederhergestellten Virus

1. Saat die passende Anzahl von 6- oder 12-Well-Platten von Vero-Zellen am Tag vor der Titration.
2. Virus aus dem Gefrierschrank entfernen und serielle 10-fache Verdünnungen in DMEM + 2% FBS in Röhrchen oder 96-Well-Platten herstellen.
   HINWEIS: Der erwartete Titer aus wiederhergestellten Klonen liegt zwischen 1 x 10 ⁶ und 5 x 10 ⁷ PFU / mL.
3. Hinzufügen 200 oR 400 & mgr; l jeder Verdünnung in Duplikat zu einer Vertiefung einer 12- bzw. 6-Well-Platte.
4. Legen Sie Platten in 37 ° C Inkubator und Felsen alle 15 min, für insgesamt 1-1,5 h Adsorption Zeitraum.
5. Entfernen Sie das Virus-Inokulum und fügen Sie 1 ml (12-Well) oder 2 ml (6-Well) DMEM-Tragacanth-Overlay zu jeder Vertiefung hinzu.
   HINWEIS: Hierbei können Agarose, Agar, Methylcellulose oder andere Überlagerungsmedien verwendet werden.
6. Inkubieren von Zellen in 37 ° C Inkubator für 5 Tage. Die Zeit für die richtige Plaque-Bildung hängt von der verwendeten Überlagerung ab.
7. Um die Zellen zu fixieren, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und dekantieren Sie die Überlagerung sanft in das Desinfektionsmittel.
8. Füge ausreichend 20% Ethanol / 0,1% Kristallviolett (CV) zu jeder Vertiefung hinzu, um zu bedecken und zu mischen zu mischen.
   HINWEIS: Viele andere Fixiermittel existieren und können hier verwendet werden. Zusätzlich kann bei Verwendung eines Agarose- oder Agar-Overlays eine zweite Overlay in Verbindung mit neutralem Rot verwendet werden, um Plaques ohne Fixierung zu visualisieren. 20% Ethanol hat sich gezeigtWirksam bei der Inaktivierung von umhüllten Viren in früheren Studien; Verwenden Sie diesen Betrag nicht für nicht umhüllte Viren, da sie nicht inaktiviert werden. ¹⁹ .
9. Inkubieren von Platten für 30-60 min bei Raumtemperatur (in einem Klasse II Biosicherheitsschrank); CV (nach örtlichen Vorschriften) verwerfen und Platten mit Leitungswasser waschen.
10. Lassen Sie die Platten trocknen und legen Sie Plaques manuell ein.
    HINWEIS: Referenz 20 kann als zusätzliche Referenz für die Durchführung von Plaque-Assays verwendet werden.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von infektiösem Klon-abgeleiteten Zika-Virus. Das Manipulieren des Zwei-Plasmid-Infektios-Klonsystems ist einfach, wenn es mit Sorgfalt durchgeführt wird, im Vergleich zu Volllängen-Versionen, die sehr instabil sind (Daten nicht gezeigt). Nach der Verdauung und Ligation der beiden verschiedenen Stücke wird eine Capped-RNA unter Verwendung einer in vitro- Transkription mit T7-Polymerase hergestellt, die dann in...

Diskussion

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEB Stable CompetentE. coli	New England BioLabs	C3040H
Carbenicillin, Disodium Salt	various
Zyppy Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit	Zymo Research	D4202
SalI-HF	New England BioLabs	R3138S	20,000 units/ml
NheI-HF	New England BioLabs	R3131S	20,000 units/ml
ApaLI	New England BioLabs	R0507S	10,000 units/ml
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	20,000 units/ml
BamHI-HF	New England BioLabs	R3136S	20,000 units/ml
HindIII-HF	New England BioLabs	R3104S	20,000 units/ml
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit	GE Healthcare Life Sciences	25640010
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.5
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England BioLabs	M0371S	1,000 units/ml
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	New England BioLabs	M0290S	10,000 units/ml
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S	400,000units/mL
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit	New England BioLabs	E2065S
Vero cells	ATCC	CCL-81
ECM 630 High Throughput Electroporation System	BTX	45-0423	Other machines are acceptable.
LB Broth with agar (Miller)	Sigma	L3147	Can be homemade as well.
Terrific Broth	Sigma	T0918	Can be homemade as well.
Petri Dish	Celltreat	229693
Culture Tubes	VWR International	60818-576
T75 flasks	Celltreat	229340
T182 flasks	Celltreat	229350
1x PBS	Corning	21-040-CV
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose	Corning	10-017-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlas Biologicals	FP-0500-A
Tragacanth Powder	MP Bio	MP 104792
Crystal Violet	Amresco	0528-1006
Ethanol Denatured	VWR International	BDH1156-1LP
6 well plate	Celltreat	229106
12 well plate	Celltreat	229111
Sequencing Oligos	IDT	see table 1
Qubit 3.0	ThermoFisher	Qubit 3.0	other methods are acceptable.
Qubit dsDNA BR Assay Kit	ThermoFisher	Q32850	other methods are acceptable.
Qubit RNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32852	other methods are acceptable.
Class II Biosafety Cabinet	Varies	N/A	This is necessary for live-virus work.