Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.

Zusammenfassung

Das Vorhandensein von Bakterien als strukturierte Biofilme bei chronischen Wunden, insbesondere bei Diabetikern, wird gedacht, um die Wundheilung und Auflösung zu verhindern. Chronische Wunden Mausmodellen wurden verwendet, die zugrundeliegenden Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und dem Host zu verstehen. Die bisher entwickelten Modelle setzen auf kurzhaarige Tiere und terminal Sammlung von Wundgewebe zur Bestimmung der lebensfähigen Bakterien. Während mit diesen Modellen erhebliche Einblick gewonnen wurde, dieses experimentelle Verfahren erfordert eine große Anzahl von Tieren und Probenahme ist zeitaufwendig. Haben wir eine neuartige Mausmodell, das beinhaltet mehrere optimale Innovationen um Biofilm Progression bei chronischen Wunden zu bewerten: ein) es nutzt haarlose Mäusen, wodurch die Notwendigkeit für die Haarentfernung; (b) bezieht sich auf die Wunden ermöglicht die sofortige Auswertung der Persistenz und Wirkung dieser Gemeinschaften auf Host vorgeformte Biofilme; (c) überwacht die Biofilm Fortschreiten durch leichte Produktion durch eine gentechnisch Biolumineszenz Belastung von Pseudomonas Aeruginosa, ermöglicht Echtzeit-Überwachung von der Infektion, wodurch die Anzahl der Tiere pro Studie zu quantifizieren. In diesem Modell eine einzelne ganzer Tiefe Wunde auf der Rückseite des STZ-induzierte diabetischen haarlosen Mäusen produziert und mit Biofilmen von p. Aeruginosa Biolumineszenz Stamm Xen 41 geimpft. Lichtleistung von den Wunden ist in ein in-Vivo imaging-System, so dass für die in Vivo und in Situ schnelle Biofilm-Visualisierung und Lokalisierung von Biofilm-Bakterien in die Wunden täglich aufgezeichnet. Diese neuartige Methode ist flexibel, es kann verwendet werden, um andere Mikroorganismen, einschließlich gentechnisch veränderter Arten und Multi-Spezies Biofilme zu studieren und möglicherweise von besonderem Wert in Anti-Biofilm Prüfstrategien einschließlich antimikrobielle okklusiven Dressings.

Einleitung

Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen eingebettet in eine Matrix aus Polymeren Substanzen, die als Faktor für die schlechte Auflösung von chronischen Wunden¹hervorgehoben worden sind. Die Studie dieser hoch organisierten, anhaltende mikrobiellen Populationen ist besonders wichtig für Diabetes-Patienten schlechter Durchblutung der Gliedmaßen und geänderten peripheren sensorischen Mechanismen führen zu unerkannten Läsionen². In den Vereinigten Staaten wird geschätzt, dass 15 % der Diabetes-Patienten im Laufe ihres Lebens mindestens ein Geschwür entwickeln wird. Dies führt zu einem wirtschaftlichen Aufwand von rund 28 Milliarden Dollar in Behandlung^3,4, um ganz zu schweigen von unschätzbarem emotionale und soziale Belastung. Verständnis der Faktoren, die es mikrobielle Gemeinschaften ermöglichen bestehen in das Wundbett und die Auswirkungen, die diese Biofilme an den heilenden Veranstaltungen unbedingt bessere Betreuung für die betroffenen Patienten fahren und treiben die Entwicklung neuer Therapieansätze. Daher ist die Einrichtung von reproduzierbar und übersetzbar in Vivo Modellen für die Erkundung von Bakterien-Wirt Interaktionen von größter Bedeutung.

Murinen Modelle wurden erfolgreich entwickelt, um die Auswirkungen von Biofilmen bei chronischen Wunden zu untersuchen. Diese Modelle jedoch oft behaarte Arten nutzen und bewerten Biofilm Abstand von Platte Grafen für tragfähige Bakterienzellen von ausgeschnittenen Gewebe von geopferten Tiere, wodurch sie Zeit- und kostenintensiv.

Eine biophotonische Alternative zum Endpunkt Probenahme von Tieren bei der Bewertung von Infektion wurde zuerst von Contag Et al.vorgeschlagen. (1995) ^{5 ,} , entwickelt eine Methode, Lumineszenz von konstitutiv Biolumineszenz Salmonella Typhimurium zur Messung der Wirksamkeit der antibiotischen Behandlung zu erfassen. Andere Studien, die unter Ausnutzung der Biolumineszenz-emittierende Bakterien gefolgt. Z. B. Rocchetta Et Al. (2001) ⁶ validiert eine Infektionsmodell Oberschenkel Escherichia coli -Infektionen bei Mäusen durch die Messung der Lumineszenz, die mit einer verstärkten Coupled Ladegerät – studieren und später, Kadurugamuwa Et Al. (2003) ⁷ nutzten das Photon emittierenden Eigenschaften ein veränderter Stamm von Staphylococcus Aureus , die Wirksamkeit der verschiedenen Antibiotika in einem Katheter-Wunde-Modell bei Mäusen zu untersuchen.

Die Methode zeichnet sich hier stellt eine einfache Protokoll um Diabetes in haarlosen Mäusen zu induzieren, produzieren und Wunden mit vorgeformten Biolumineszenz Biofilmen von p. Aeruginosa, impfen und biophotonische Überwachung der Infektion mit Hilfe einer in-Vivo imaging-System. Es bietet eine direkte, Rapid, in Situ, nicht invasiv und quantitativen Prozess, Biofilme bei chronischen Wunden zu bewerten und darüber hinaus für die zusätzliche Analyse ermöglicht, wie mikroskopische Bildgebung des Heilens Wunden, intermittierende Blutentnahme für Zytokin-Messungen und terminal Gewebe Kollektion für Histologie.

Protokoll

Tierversuche wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschuss der Michigan State University.

1. Vorbereitung der okklusiven Dressings und Silikon Spacer

1. schneiden die transparenten okklusiven Verband zu ca. 1 cm x 1 cm mit der Schere Quadrate.
2. Schneiden 10 mm Kreise auf einem 0,5 mm dicken Silikon-Blatt mit einem 10 mm Biopsie Punsch. Center eine 5 mm-Biopsie in der Mitte des Kreises 10 mm Stanzen und drücken Sie fest um ein Loch zu bilden eine " Donut "-wie Scheibe, die als eine Schiene verwendet werden.

2. Versuchstieren

1. Verwendung 8 Woche alt (22-26 g) männlichen SKH-1 Mäusen von einem kommerziellen Züchter. Halten Sie Mäuse im standard-Bedingungen von 21 ° C und einem 12 h hell-dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
2. Um Diabetes zu induzieren, injizieren Mäuse Intraperitonially mit 13 mg/ml Streptozocin (STZ) Solutionand 25 % Glucose (250 µl pro / Maus) an 5 aufeinander folgenden Tagen.
   1. Machen die STZ-Lösung durch Verdünnung 65 µg der STZ in 5 µL 100 mm Zitronensäure, pH 4,5.
   2. Lautstärke für jede Maus zu einer endgültigen Masse von 65 mg STZ pro 1 kg Körpergewicht Maus injiziert. Kontroll-Mäusen mit 100 mM Zitronensäure Lösung pH 4.5 zu injizieren, an den gleichen Tagen.
3. Hyperglykämie durch Blutzucker-monitoring mit einem Blutzuckermessgerät 14 Tage nach der letzten Injektion STZ bestätigen. Diabetische Mäusen möglicherweise Polyurie und so ihre Bettwäsche müssen häufiger gewechselt werden, um Feuchtigkeit zu beseitigen und ihre Gewichte sollten 3 Mal pro Woche überwacht werden.

3. Biofilme

1. Biofilm Vorbereitung
   1. wachsen Kolonie Biofilme ⁸, um die Wunden zu impfen. Zwei Tage vor Beginn der Operation eine Nacht Kultur der Biolumineszenz p. Aeruginosa Xen 41 in tryptic Soy Bouillon (TSB) bei 37 ° C inkubiert und schütteln bei 200 u/min und sterilisieren Polycarbonat Membranfilter mit 0,2 µm Porengröße von UV-Exposition Licht in eine biologische Schutzhaube für 15 min pro Seite.
   2. Einen Tag vor der Operation über Nacht Kultur bei 20.000 x g für 2 min Zentrifugieren und wasche 3 Mal mit 1 mL Dulbelcco ' s Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von oben und unten pipettieren.
   3. Verdünnen Aufhängung in DPBS eine Extinktion von 0,05 bei 600 nm.
   4. Pipette 10 µL der verdünnte Kultur auf jede Membran ruhen auf einem tryptic Soy Agar (TSA) Teller. Nach dem Trocknen erlauben, brüten die Membranen bei 35 ° C für 72 h, Biofilmen auf frischen TSA Platten übertragen alle 24 Std. zu wachsen
2. Standardkurve
   1. vor Beginn des Experiments machen eine Standardkurve Biolumineszenz und bakterielle zählt korrelieren.
   2. Biofilme vorbereiten, wie unter 3.1 beschrieben.
   3. Machen Verdünnungsreihen von Biofilmen von ½ bis 1/24 Biofilm mit DPBS und vortexen vermischen, bis eine optisch homogene Lösung entsteht. Pipette 200µL der verdünnten Lösungen in einem schwarzen 96-Well-Platte und Bild mit der in-Vivo imaging-System.
   4. Platte Verdünnungen auf TSA Platten verteilt und inkubieren Sie bei 35 ° C für 24 h.
   5. Zählen Koloniebildenden Einheiten (KBE) auf Platten und erstellen eine Standardkurve um Biolumineszenz und bakterielle zählt korrelieren.

4. Wunde Chirurgie

1. induzieren allgemeinen Anästhesie mit Isofluran in 95 % oxygen/5% CO ₂ (um Tod von einer Ketoazidose zu verhindern) bei einer Durchflussmenge von 1 L/min und Anästhesie mit 1-3 % Isofluran zu erhalten. Tiere auf Heizmatten während der Operation zu erhalten.
2. Gewährleisten die tief Pedal Reflexe der Maus werden durch Kneifen den Fuß mit einer Pinzette unterdrückt und platzieren Sie den Mauszeiger in die Bauchlage.
3. Verwalten Sie Meloxicam (0,2 mg/kg) durch subkutane Injektion (30 µl) zur Schmerzbekämpfung.
4. Wischen Sie die Haut des Rückens mit 10 % Povidon-Jod dreimal und einer Isopropanol-Pad.
5. Benutzen einen sterile 4 mm Biopsie-Punch um ein kreisförmiges Muster für die Wunde auf der einen Seite der Maus zu markieren ' s Mittellinie auf der Ebene der Schultern. Skizzieren Sie das Muster mit einem Permanentmarker.
6. Gezahnte Pinzette anheben die Haut in der Mitte der Kontur und Iris Schere erstellen eine voll-dicke Wunde, die durch das subkutane Gewebe einschließlich der Panniculus Carnosus erstreckt und Verbrauchsteuern kreisförmige Stück des Gewebes verwenden.
7. Kleber eine medizinische wasserdichte Haut Kleber auf der Haut der Mäuse und positionieren Sie die Silikon-Schiene mit leichten Druck. Decken Sie die Wunde mit einem transparenten okklusiven Dressing. Nach der Operation individuell Käfig Tiere.

5. Die Nachbehandlung

1. verwalten Meloxicam (0,2 mg/kg) einmal täglich durch subkutane Injektion für postoperative Schmerzlinderung für die nächsten 2 Tage.
2. Monitor Tiere täglich für Manifestationen von Schmerzen und Gewichtsverlust. Diabetische Tiere brauchen Insulin-Injektionen, wenn sie mindestens 15 % des Körpergewichts verloren haben.

6. Biofilm Inokulum Vorbereitung und Infektion

1. impfen Mäuse 48 h nach der Operation, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
2. Kratzen 72 h Biofilme aus den Membranen mit einem sterilen Spatel, legen Sie sie in einem Microcentrifuge Schlauch und verdünnen 1:2 in DPBS. Mix von kurz auf und ab pipettieren.
3. Ausbreitung Platte Inokulum auf TSA Platten insgesamt KBE berechnen. Um sicherzustellen, dass zählt korrekt sind, brechen die Biofilm-Inokulum weiter durch eine Reihe von 1 min vortexen zweistufig Zwischenspiele durch ein 2 min Beschallung Schritt bei 40 kHz in einem Ultraschallreiniger.
4. Dressing-Abdeckung der Wunde und Silikon-Schiene und nehmen ein Schliffbild der Wunde mit einem Mikroskop mit angeschlossene Kamera mit einem Lineal zu Referenzzwecken entfernen.
5. Schneiden die Spitzen von 200 µL Pipettenspitzen und pipette 10 µL des Inokulums Biofilm auf jede Wunde.
6. Bild-Maus mit dem in-Vivo imaging-System mit Auto-Einstellungen: Belichtungszeit 5-300 s, mit mittlerer binning, 1 f/Stop und offene Filter und Sichtfeld C (12,9 x 12,9 cm).
7. Abdeckung Wunde mit frischen Dressing.

7. Wunde Mess- und Imaging

1. bewerten die klinischen Symptome der Tiere täglich ⁹.
2. Nahrung, Wasser und Käfige nach Bedarf ändern.
3. Überprüfen die Integrität des Dressings täglich. Wenn das Dressing vorhanden ist, kann nur die Biolumineszenz durch Verschluss der Wunde gemessen werden. Am Tag 8, Dressings werden entfernt und nicht ersetzt ermöglicht Messung der Wundverschluss.
4. Wiegen Tiere jeden zweiten Tag.
5. Mäuse Platz für alle Tage, einzeln in eine Isolationskammer ausgestattet mit einem HEPA-Filter und Image mit dem in-Vivo imaging-System täglich oder jeden zweiten Tag bis Hintergrundkonzentration Lumineszenz Werte unterschreiten.
6. Nach Tag 8, induzieren Vollnarkose und nehmen Mikrographen der Wunde mit einem Mikroskop mit angeschlossene Kamera mit einem Lineal zu Referenzzwecken jeden zweiten Tag bis Wunden geheilt sind.

8. Histologische Analyse

1. einschläfern die Mäuse mit einem Flow von 2 l/min von CO ₂ in eine Euthanasie Kammer nach Lumineszenz Hintergrundkonzentrationen unterschreitet und die Wunden sind geheilt. Tod durch zervikale Dislokation als eine zweite Methode der Euthanasie bestätigen.
2. Iris Schere verwenden, um eine breite, vollständige Exzision um und unter dem Wundgebiet (ca. 1 cm im Durchmesser) zu schaffen und zu erhalten das Gewebe in 4 % Paraformaldehyd für histologische Analyse.
3. Andere Analyse: Zytokin-Erkennung
   1. Blut von Tieren unter Narkose mit einer Kapillare Glasröhre Retro-Orbital zu sammeln und überträgt es auf EDTA-behandelten Rohre.
   2. Blut bei 2.000 u/min für 20 min bei 4 ° C zentrifugiert und Plasma für Zytokin-Erkennung einfrieren.

Ergebnisse

Bei der Entwicklung dieses neuen Modells, beobachteten wir viele Vorteile bei der Nutzung von haarlosen SKH-1 über C57BL/6J Mäuse, die wir in der Vergangenheit benutzt haben. STZ-Injektionen normalerweise ausgesetzt Tiere erleben schrittweise Gewichtsabnahme mit den Ausbruch von Diabetes; jedoch durchgeführt in Wunde Heilung Experimente bisher von unseren Laboratorien reproduzieren von Dunn Et al.vorgestellte Modell. (2012) ⁹ mit C57BL/6J, drastischen G...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein neue Mausmodell für die Untersuchung von Biofilmen bei diabetischen chronischen Wunden, das viele Vorteile um eine reproduzierbare, übersetzbar und flexible Modell zu erstellen.

Die erste Neuerung ist die Verwendung von haarlosen Mäusen. Andere Mausmodelle wurden entwickelt, um diabetische Chronische Wundheilungsstörungen^10,11studieren, aber alle haben stützte sich auf die Verwendung von Haaren Mäuse, die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner