Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.

Zusammenfassung

Antikörper spielen eine entscheidende Rolle bei der Kopplung der angeborenen und der adaptiven Immunantwort gegen virale Erreger durch Antigen-bindenden Domänen und Fc-Regionen. Wir beschreiben hier, wie die Aktivierung gemessen Effektor-Funktionen durch monoklonale Antikörper gezielt die Influenza Virus Hämagglutinin mit dem Einsatz einer gentechnisch Jurkat-Zelllinie, die mit dem Ausdruck einer Aktivierung Art von Fc 1. Fc-FcγR. mit dieser Methode, die Beitrag der spezifischen Fc-FcγR-Wechselwirkungen durch Immunglobuline übertragenen kann durch ein in-vitro- Test bestimmt werden.

Einleitung

Immunität von der saisonalen Grippe-Impfstoff zur Verfügung gestellt wurde traditionell durch Hämagglutination Inhibition (HI) Assay¹bewertet, das Vorhandensein von Antikörpern, die auf die Rezeptor-Bindungsstelle des das Hämagglutinin misst. Diese HI-aktive Antikörper sterilisieren Immunität verleihen können, aber sind in der Regel eng in ihrer Breite von Schutz, bietet Immunität gegen nur eine ausgewählte einige Stämme des Influenza-Virus. Die Isolierung und Charakterisierung von weitgehend reaktiven monoklonalen Antikörpern, die das Hämagglutinin (HA) erkennen schlagen vor, dass die Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs in Reichweite^{2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8}. ist eines der Hauptziele des universellen Grippeimpfstoffs induzieren eine starke Antikörperantwort auf die konservierten Bereiche des Influenza-Virus^{9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16}. im großen und ganzen Antikörper, die diese konservierten Epitope, bestehend aus neutralisierende und nicht neutralisierende Antikörper^17,18erkannt haben gezeigt, dass Fc-FcγR Interaktionen für erfordern optimale Schutz in Vivo und Highlight des Beitrags der Fc-vermittelten Immunität gegen die allgemeine Immunantwort auf Influenza Virus^19,20.

Korrelate des Schutzes sind entscheidend bei der Beurteilung der Immunität gegen Infektionen. Diese Metriken ermöglichen Wissenschaftlern und Klinikern, die Wirksamkeit von Impfstoffen, die Bedeutung der Daten und der Verlauf der Behandlung zu schätzen. Das einzige etablierte Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion ist die Hämagglutination Inhibition Assay. Ein Titer von 01:40 ist mit einer 50 % Reduktion des Risikos von Krankheit^1,21 – und spiegelt das Vorhandensein von Antikörpern, die Agglutination zu hemmen, indem Sie auf den Rezeptor verbindlich vor Ort auf den kugelförmigen Kopf des HA. Allerdings sei auch darauf hingewiesen, dass T-Zell-Reaktionen möglicherweise eine bessere Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion bei älteren Menschen. Ein kürzlich veröffentlichten Bericht zufolge Interessanterweise Neuraminidase Hemmung Tätigkeit ein besserer Prädiktor der Immunität gegen Grippe²²sein kann. Glücklicherweise Tests typische in-vitro- , wie z. B. Neutralisation oder Neuraminidase Hemmung Assays HA Stiel oder Neuraminidase-spezifische Antikörper messen können. Die meisten dieser konventionellen in-vitro- Tests jedoch nur berücksichtigen sowohl die Funktion des Antigen-Bindung-Region des Antikörpers und Messen nicht die Rolle der Fc-Region. Darüber hinaus sind der Beitrag der nicht neutralisierende Antikörper, die über Fc-Rezeptor Engagement in Vivo zu schützen nicht erkannten^17,18. Um Schutz durch Antikörper, die Fc-vermittelten Immunität wie Antikörper abhängige Zelle vermittelten Zytotoxizität (ADCC) induzieren zu messen, braucht man ein robuste in-vitro- Assay.

Die unten beschriebene Methode beurteilt die Fähigkeit von murinen monoklonalen Antikörpern, Fc-vermittelten Funktionen durch den Einsatz von gentechnisch veränderten Jurkat Zell-Linie mit dem Ausdruck einer Aktivierung induzieren Murine Typ 1 FcR, FcγRIV. Antikörper-Engagement von der FcγR transduces intrazellulären signalisieren, dass Trigger nuklearen Faktor der aktivierten T-Zellen vermittelten Luciferase-Aktivität. Der Test hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken, die Isolierung und Kultur der primären Effektorzellen und die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Aktivierung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen^{19,23,24 Erkennung erfordern ,25,26}. Erstens kann das Protokoll hier beschriebenen leicht verschiedene virale Ziele, FcγRs und Antikörper verschiedener Arten (menschliche und murine) integrieren angepasst werden. Zweitens die Verwendung einer modifizierten Jurkat-Zelle Zeile zum Ausdruck zu bringen, die eine FcγR mit einer Luciferase Reporter-gen unter einem nuklearen Faktor von aktivierten T-Zellen (NFAT) für einen Großformat-Assay ermöglicht, die mit einer Platte Reader Messung der Lumineszenz leicht analysiert werden können. Hier wird die traditionelle Aktivierung des primären Effektorzellen mit der Induktion von NFAT-Luciferase auf Antikörper Engagement von einer FcγR auf der Oberfläche der Zelle Jurkat ersetzt. 96-Well-Platte Format Assays kann für die Messung von bis zu vier verschiedene Proben in Triplicates mit sieben Verdünnungen – eine Reihe von Proben, die umständlich mit traditionellen Techniken werden könnte. Gibt es weitere Punkte, die mit dieser Assay, die das Design von Experimenten und die Interpretation der Daten beeinträchtigen können. Das virale Ziel muss auf der Zelloberfläche in Reihenfolge für die Antikörper Anerkennung ausgesprochen werden. Um dies zu mindern, kann das Ziel-Antigen (z.B. eine interne virale Proteine) direkt auf die Oberfläche der Platte beschichtet werden. Allerdings hat dies noch nicht rigoros getestet. Darüber hinaus die modifizierte Zellinie Jurkat drückt nur eine Art der Aktivierung FcγR und drückt keine hemmenden FcγRs während Primärzelle Linien alle Rezeptoren in einem physiologischen Kontext auszudrücken.

Wir haben zuvor dieser Assay verwendet, um zu zeigen, dass Epitop-Spezifität in einem polyklonalen Kontext eine entscheidende Rolle spielt bei der Regulierung der Fc-vermittelten Effektor-Funktionen und optimale Aktivierung des Antikörper-abhängige zellvermittelte Reaktion zwei Punkte erfordert wenden Sie sich an^27,28. Hier beschreiben wir eine Methode, die bewertet die Fähigkeit von Stiel-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu engagieren und aktivieren die Murine FcγRIV aktivieren. Zwar gibt es Ausnahmen^29,30, eine große Anzahl von weitgehend Antikörper Ziel antigenetisch erhaltenen Stiel und Umgebung das Hämagglutinin und somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer universellen Grippe Impfstoff.

Protokoll

Die Experimente in diesem Manuskript vorgeformt wurden folgende Icahn School of Medicine der institutionellen Code von Ethik und Vorschriften durchgeführt.

1. Ausdruck des Influenza-Virus Hämagglutinin über Transfektion oder Infektion

Transfektion:

1. Platte menschlichen embryonalen Niere (HEK 293T) Zellen bei einer Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte und lassen Sie es für 4 h in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO₂).
2. Transfizieren Zellen mit 100 ng der DNA Kodierung für virale Hämagglutinin und 0,2 μl Transfection Reagens pro Bohrloch in einem Gesamtvolumen von 50 μL.
   Hinweis: Beide Plasmid und Transfectant Reagenz 1 x Opti-Minimum wesentlichen Medien (MEM) reduziert Serum Medium verdünnt werden.
3. Entfernen Sie nach Platten in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO₂ für 18 h Inkubation, Transfektion Medium.

(2) Infektion

1. Platte A549 oder Madin Darby canine Nieren-Zellen bei einer Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur wachsen mindestens 18 Stunden in einem 37 °C Inkubator mit 5 % CO₂und 96-Well-Platte behandelt.
2. Verdünnten Virus in 1 x MEM und infizieren Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von 3, 1 oder 0,33 für 1 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO₂. Gesamtvolumen sollte 100 μL entsprechen.
   Hinweis: 10 X MEM wird verdünnt mit Wasser zu einer 1 x MEM arbeiten Lager für die oben genannten Virus-Verdünnung.
3. Nach der Infektion, entfernen das Inokulum und 100 μl 1 x MEM in die Platte in der Abwesenheit von Trypsin.
4. Wachsen Sie infizierte Zellen für 18 bis 24 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO₂.

3. Beurteilung der FcRg/NFAT-vermittelte Aktivierungs der Luciferase-Aktivität durch monoklonale Antikörper oder Sera

1. Zunächst ersetzen Sie Wachstumsmedien transfizierte oder infizierten Zellen mit 25 µL Assays Medien (1 X RPMI 1640 ergänzt mit 4 % (Vol/Vol) niedrige IgG fetalen bovine Sera).
2. Durchführen Sie in eine separate 96-Well-Platte vierfach Verdünnungen der Antikörper des Interesses ab 30 μg/mL mit Hilfe der Assay-Medien. Verdünnungen in Triplicates durchführen und eine Beispiel-Platte-Layout ist in Figur 1Adargestellt. Stellen Sie sicher, ein Steuerelement, das Antikörper (keine Antikörper-Kontrolle) ausschließt sowie ein Hintergrund-Steuerelement (Testpuffer allein).
   Hinweis: für beide der "keine Antikörper" und Hintergrund-Kontrollen, fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Antikörper.
3. Übertragen Sie 25 μL der seriell verdünnten Antikörper von Schritt 3.2 in entsprechenden Vertiefungen auf Platte transfizierten Zellen oder infizierten Zellen.
4. Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO₂) für 15 min.
5. Fügen Sie 25 μL der entsprechenden veränderten Effektor Jurkat Zelle murinen FcgRIV oder menschliche FcgRIIIa (75.000 von Zellen/weit) zum Ausdruck bringen. Gesamtvolumen für jede sollte gut 75 µL und der Start Endkonzentration des Antikörpers ist bei 10 µg/mL (Abbildung 1 b).
   Hinweis: Für das Hintergrund-Steuerelement fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Effektorzellen hinzu. Um Antikörper-abhängige zellvermittelte Phagozytose zu untersuchen, kann eine modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der menschlichen FcgRIIa verwendet werden.
6. Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂ 6 h.
7. Tauwetter und warmen Luciferase Substratpuffer in einem 37 °C Wasser für ca. 1 h vor dem Gebrauch.
   Hinweis: Um die Luciferase Substratpuffer machen, bereiten Sie lyophilisierter Luciferase Assay Substrat in Testpuffer zur Verfügung gestellt. Die rekonstituierte Substratpuffer kann bis zu sechs Wochen bei-30 °C bis-10 °C aufbewahrt werden.
8. Alle Vertiefungen mit Ausnahme der Hintergrundkontrolle 75 μl/Well der Luciferase Substratpuffer hinzufügen.
9. Lesen Sie auf einem Luminometer.
10. Falten-Induktion mit folgender Gleichung berechnen: Falten Induktion (induzierte Wert-Background-Wert) = / (keine mAb-Wert-Background-Wert).

Ergebnisse

Wir konnten zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, aber nicht Kopf-spezifischen Kopf-spezifische mAb, PY102, konnte durch heraufregulierende CD107a und Interferon-γ-¹⁹primäre natürliche Killerzellen aktivieren. Um die Fähigkeit einer Stiel-spezifischen Antikörper, primären menschlichen NK-Zellen aktivieren zu modellieren, wir zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, robust aktivieren kann, die modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der murinen FcγRIV von ~ 14-fold. Auf der a...

Diskussion

Die hier beschriebene Methode ermöglicht dem Benutzer die Fähigkeit eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers, der murinen FcγRIV zu messen. Das Ziel-Antigen, Influenza Virus Hämagglutinin, drückt sich auf der Oberfläche der Zellen nach der Infektion durch Viren oder Transfektion von Plasmid DNA. Der Test ist ein weiterer mit verschiedene Oberfläche ausgedrückt virale Proteine in Kombination mit anderen FcγRs (Menschen oder Murine) zugänglich. Darüber hinaus wir haben verwendet Sera Proben um zu beurteil...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CCL-185	Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells
HEK 293T cells	ATCC	CRL-3216	Human embryonic kidney cells
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019	Transfection reagent
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	51985-034
White tissue culture treated 96-well plate	Corning, Inc.	3917	Assay plates
10X MEM	Gibco	11430-030
Jurkat cell expressing murine FcgRIV	Promega	M1201	Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Jurkat cell expressing human FcgRIIIa	Promega	G7010	Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Jurkat cell expressing human FcgRIIa	Promega	G9901	Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum
Luminometer	BioTek	Synergy H1 Multi-Mode reader	Luminescence plate reader
Bio-Glo Luciferase Assay System	Promega	G7940	Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate
Madin Darby canine kidney cells	ATCC	CCL-34	Canine kidney cells