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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein Protokoll wird für die Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristallen (UCNs) und deren zellulären Anwendungen für Kanal-Protein-Verordnung auf Nah-Infrarot (NIR) Beleuchtung präsentiert.

Zusammenfassung

Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristalle (UCNs) haben viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren anhand ihrer vielversprechenden und kontrollierbaren optische Eigenschaften, die für die Absorption von Nah-Infrarot (NIR) Licht und können anschließend konvertieren Sie es in Multiplex-Emissionen, die über eine Vielzahl von Regionen vor der UV-Strahlung zu sichtbaren in der NIR umfassen. Dieser Artikel stellt detaillierte experimentelle Verfahren für Hochtemperatur-Co Niederschlag Synthese von Kern-Schale-UCNs, die verschiedene Lanthanoid-Ionen in Nanokristallen für die effiziente Umwandlung von tiefen Gewebe durchlässig NIR Erregung (808 integrieren nm) in eine starke blaue Emission bei 480 nm. Durch die Kontrolle der Oberflächenmodifikation mit biokompatiblen Polymer (Polyacryl Säure, PAA), die als vorbereitet UCNs erwirbt große Löslichkeit in Pufferlösungen. Die hydrophilen Nanokristalle sind weiter mit spezifischen Liganden (Dibenzyl Cyclooctyne, DBCO) für die Lokalisierung auf der Zellmembran funktionalisiert. Bei NIR Licht (808 nm) Bestrahlung, hochkonvertiert blaue Emission effektiv aktivieren die Licht-gated Kanal-Protein auf der Zellmembran und speziell die Zustrom kation (z.B. Ca2 +) im Zytoplasma zu regulieren. Dieses Protokoll bietet eine praktikable Methode zur Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierten UCNs und anschließende biokompatible Oberflächenmodifizierung für weitere mobile Anwendungen.

Einleitung

In den letzten Jahren haben Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristalle (UCNs) verbreitet wurde, als Alternative zu herkömmlichen organischen Farbstoffen und Quantenpunkte in biomedizinischen Anwendungen, die vor allem auf ihre hervorragenden chemischen und optischen Eigenschaften basieren, auch gute Verträglichkeit, hohe Beständigkeit gegen Immunofluoreszenz und schmale Bandbreite Emission1,2,3. Noch wichtiger ist, können sie als eine viel versprechende Nanotransducer mit ausgezeichneten Gewebe eindringen Tiefe in Vivo zum Konvertieren von Nah-Infrarot (NIR) Erregung in eine breite Palette von Emissionen aus UV, sichtbar, und die NIR-Regionen durch ein Multi-Photon dienen. Großbildschirmen Prozess4,5. Diese einzigartigen Eigenschaften machen Lanthanid-dotierte UCNs dienen als besonders Erfolg versprechend Vektor für biologische sensing, biomedizinische Bildgebung und Krankheiten Theranostik6,7,8.

Die allgemeinen Komponenten des UCNs basieren vor allem auf die dotierten Lanthanoid-Ionen in der isolierenden Host-Matrix mit einer sensibilisierend (z.B., Yb3 +, Nd3 +) und einem Aktivator (z.B., Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) im Inneren des Kristalls homogen9. Verschiedene optische Emission von der Nanokristalle wird lokalisierten elektronischen Übergang innerhalb der 4f -orbitale der Lanthanid Dotierstoffe aufgrund ihrer Leiter-wie angeordneten Energieniveau10zugeschrieben. Daher ist es wichtig, die Größe und Morphologie der synthetisierten UCNs mit Mehrkomponenten Lanthanid Dotierstoffe genau zu kontrollieren. Von rechts wurden einige vielversprechende Methoden gut für die Vorbereitung der Lanthanoid-dotierten UCNs, einschließlich thermische Zersetzung, Hochtemperatur-Co Niederschlag, hydrothermale Synthese, Sol-Gel-Verarbeitung, etc.11 eingerichtet , 12 , 13 unter diesen Ansätzen, die Hochtemperatur-Co Niederschlag-Methode ist eine beliebte und praktische Strategien für UCNs-Synthese, die streng kontrolliert werden kann, gewünschte qualitativ hochwertige Nanokristalle mit einheitlicher Form vorbereiten und Größenverteilung in einer relativ kurzen Reaktionszeit und kostengünstige14. Jedoch sind die meisten Nanostrukturen synthetisiert durch diese Methode hauptsächlich begrenzt mit hydrophoben Liganden wie Ölsäure und Oleylamine, die in der Regel ihre weitere Bioapplication aufgrund der begrenzten hydrophobe Liganden Löslichkeit in wässriger Lösung behindern 15. Daher ist es notwendig, geeignete Oberflächenmodifizierung Techniken um biokompatible UCNs in biologischen Anwendungen in Vitro und in Vivovorzubereiten.

Hier präsentieren wir Ihnen das detaillierte experimentelle Verfahren für die Synthese von Kern-Schale UCNs Nanostrukturen durch die Hochtemperatur-Co Niederschlag-Methode und eine machbare Veränderung Technik zu funktionalisieren biokompatible Polymer auf UCNs Oberfläche für Weitere zelluläre Anwendungen. Dieser UCNs Nanoplatform enthält drei Lanthanoid-Ionen (Yb3 +, Nd3 +und Tm3 +) in die Nanokristalle, starke blaue Emission zu erwerben (~ 480 nm) bei NIR leichte Erregung bei 808 nm, die größere Eindringtiefe hat in lebendes Gewebe. Es ist allgemein bekannt, dass Nd3 +-dotierten UCNs minimierte Wassereffekte Absorption und Überhitzung in diesem spektralen Fenster anzeigen (808 nm) im Vergleich zu herkömmlichen UCNs auf 980 nm Bestrahlung16,17, 18. Darüber hinaus um die UCNs in biologischen Systemen zu verwenden, die hydrophoben Liganden (Ölsäure) auf der Oberfläche des UCNs werden zunächst durch Ultraschallbehandlung in saurer Lösung19entfernt. Dann sind die Liganden-freie UCNs mit einem biokompatiblen Polymer (Polyacryl Säure, PAA), gute Löslichkeit in wässrigen Lösungen20erwerben weiter modifiziert. Darüber hinaus als ein Proof of Concept in zelluläre Anwendungen, hydrophilen UCNs sind weitere funktionalisiert mit molekularen Liganden (Dibenzyl Cyclooctyne, DBCO) für die konkrete Lokalisierung auf der N-3-Zellmembran getaggt. Bei NIR Licht (808 nm) Bestrahlung, die blauen hochkonvertiert Emission bei 480 nm kann effektiv aktivieren eine Licht-gated Kanal-Protein, Kanalrhodopsine-2 (ChR2), auf Zellen die Oberfläche und erleichtern somit kation (z.B. Ca2 + -Ion) Zustrom durch die Membran lebender Zellen.

Dieses video Protokoll bietet eine praktikable Methode für Lanthanid-dotierte UCNs Synthese, biokompatible Oberflächenmodifizierung und UCNs Bioapplication in lebenden Zellen. Unterschiede in der Synthesetechniken und chemischen Reagenzien in Nanocrystal Wachstum beeinflusst die Größe Verbreitung, Morphologie und Großbildschirmen Lumineszenz (UCL) Spektren des endgültigen UCNs Nanostrukturen in Zelle Experimente verwendet. Dieses detaillierte video-Protokoll ist bereit zu helfen neue Forscher auf diesem Gebiet zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit des UCNs mit der Hochtemperatur-Co Niederschlag-Methode und vermeiden die häufigsten Fehler in UCNs biokompatible Oberflächenmodifizierung für weitere Mobile Anwendungen.

Protokoll

Vorsicht: konsultieren Sie bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Nutzen Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Synthese von UCNs bei hoher Temperatur (~ 290 ° C), einschließlich der Verwendung von technischen Kontrollen (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (z.B. Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).

1. Synthese des NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) Kern-Schale-Nanokristalle

  1. Synthese von NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) Kern Nanostruktur
    1. Vorbereitung der RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F Methanol Stammlösung
      Hinweis: die seltenen Erden (RE) Lanthanoid-Ionen sind Yttrium (Y), Ytterbium (Yb), Thulium (Tm) und Neodym (Nd).
      1. Auflösen 500 mg Yttrium(III) Acetat Hydrat in 5 mL Methanol (100 mg/mL), 250 mg Ytterbium (III)-Acetat-Hydrat in 5 mL Methanol (50 mg/mL), Thulium (III)-Acetat-Hydrat in 1 mL Methanol (10 mg/mL), 10 mg und 10 mg Neodym (III)-Acetat-Hydrat in 1 mL metha Nol (10 mg/mL) in Glasfläschchen mit einem Ultraschall Reinigungsbad für 2 min.
      2. 400 mg NaOH in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 20 mL Methanol mit Ultraschall Reinigungsbad vorzubereitende NaOH-Stammlösung (20 mg/mL) zu kombinieren.
      3. Kombinieren 600 mg NH 4 F in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 30 mL Methanol mit Ultraschall Reinigungsbad NH 4 F-Stammlösung (20 mg/mL) vorzubereiten.
        Hinweis: Platzieren Sie die Stammlösung Lanthanid-komplexe, NaOH und NH 4 F in Glasfläschchen, versiegeln mit Parafilm und speichern Sie sie im Kühlschrank bei ~ 4 ° C bis benötigt. Die vorbereiteten Methanol Stammlösungen sind einmal alle 2 Wochen ersetzt.
    2. Vorbereitung der NaYF 4: Yb/Tm/Nd Kern Nanostruktur
      1. Pipette 3 mL der Ölsäure und 7 mL 1-Octadecene in ein drei-Hals Flasche 50 mL.
      2. Kombinieren 1.089 mL Y (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung, 0,608 mL der Yb (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung, 83,6 µL Tm (CH 3 CO 2) 3 Lager-Lösung und 128,5 µL der Nd (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung in den Kolben.
      3. Einen Thermometer (0 - 360 ° C-Bereich) in den Kolben passen und lassen Sie ihren Tipp Tippen Sie auf die Lösung. Legen Sie die Flasche in einem Glasbehälter mit Silikonöl Phenylmethyl.
      4. Erhitzen der Lösung auf 100 ° C mit einer Heizplatte aus Methanol verdunstet. Schließen Sie die Flasche an einen Schlenk-Linie mit einem dual Vakuum/Gasarmatur zur Beseitigung der restlichen Methanols und das Reaktionsgemisch unter Vakuum für 2 – 3 min. unter Rühren.
      5. Erhöhen die Temperatur auf 150 ° C und halten diese Temperatur für 60 min. Maintain Rührgeschwindigkeit von 700 u/min während der Synthese.
        Hinweis: Stellen Sie eine mäßige Geschwindigkeit rühren bis zu vermeiden, die Lösung Platschen.
      6. Der Heizplatte zu stoppen und halten Sie die Flasche bei Raumtemperatur ermöglichen die Lösung abkühlen langsam.
        Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten.
      7. Kombinieren 2 mL NaOH-Methanol-Stammlösung und 2,965 mL NH 4 F-Methanol-Stammlösung in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Ziehen Sie den Schlauch mit der Kappe und mischen Sie die Lösung durch leistungsstarke vortexen für 5 s.
      8. Hinzufügen der NaOH-NH 4 F Mischung langsam in die Flasche durch eine Glaspipette über 5 min.
      9. Erhöhen die Temperatur der Mischung auf 50 ° C und halten dieser Temperatur für 30 min.
        Hinweis: Stellen Sie die Temperatur von nicht mehr als 50 ° C, weil die hohe Temperatur Kristall Kernbildung und Wachstum fördern wird.
      10. Erhöhen Sie die Temperatur (~ 100 ° C) zu verdampfen aus Methanol und verbinden Sie den Kolben zu einer Schlenk-Linie mit dual Vakuum/Gasarmatur zur Beseitigung der restlichen Methanols und das Reaktionsgemisch unter Vakuum für ca. 2-3 min.
      11. Schalterstellung der Absperrhahn die Küvette mit Stickstoff füllen.
      12. Erhöhung der Temperatur bis 290 ° C bei einer Heizrate von ~ 5 ° C/min. halten die Reaktionsmischung bei 290 ° C für 1,5 h.
      13. Der Heizplatte zu stoppen und entfernen Sie die Flasche um das Reaktionsgemisch langsam bei Raumtemperatur unter Rühren abkühlen lassen.
        Achtung: Seien Sie vorsichtig mit der heißen Platte mit hoher Temperatur (> 400 ° C), schwere Verbrennungen bei Hautkontakt zu vermeiden.
      14. Übertragen Sie die Mischung in die Flasche in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Flasche mit 30 mL Ethanol und übertragen Sie die Lösung auf die Zentrifugenröhrchen.
      15. Zentrifugieren Sie das Produkt bei 4.000 × g für 8 min bei Raumtemperatur und entsorgen des Überstands.
      16. Fügen Sie 10 mL Hexan Zentrifugenröhrchen und neu verteilen das Produkt mit Beschallung (60 kHz, 240 W) für mind. 2
      17. 30 mL Ethanol hinzufügen das Rohr. Drehen Sie das Gerät bei 4.000 × g für 8 min und dann verwerfen des Überstands.
      18. Neu zerstreuen die feste Produkte im unteren Teil Zentrifugenröhrchen mit 5 mL Hexan. Die Lösung im Kühlschrank bei ~ 4 ° C für einen nächsten Schritt zu speichern.
        Hinweis: Die Großbildschirmen Emission von Kern-Schale-UCNs wird durch bestrahlen die Lösungen mit einem 808 nm-Laser (2 W) getestet.
  2. Vorbereitung der NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) Kern-Schale-Nanokristalle
    1. 3 mL der Ölsäure und 7 mL 1-Octadecene in ein 50 mL-drei-Hals-Kolben zu kombinieren. Fügen Sie 1,082 mL der Vorratslösung Y (CH 3 CO 2) 3 und 2,87 mL Nd (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung in den Kolben.
    2. Erhaltenen Kern Nanostruktur (80 mg in 5 mL Hexan aus Schritt 1.1.2.18) in den Kolben unter Rühren hinzufügen.
    3. Einen Thermometer (0 - 360 ° C-Bereich) in den Kolben passen und lassen Sie seine Spitze, die Mischung zu berühren. Legen Sie die Flasche in einem Glasbehälter mit Silikonöl Phenylmethyl.
    4. Erhitzen Sie die Mischung bei 100 ° C auf der Oberseite Heizplatte aus Methanol und Hexan verdunsten. Schließen Sie die Flasche an einen Schlenk-Linie mit einem dual Vakuum/Gasarmatur zur Beseitigung des restlichen Lösungsmittels und das Reaktionsgemisch unter Vakuum für 2 – 3 min. unter Rühren.
    5. Erhöhen die Temperatur auf 150 ° C und halten Sie sie für 60 min. pflegen die Rührgeschwindigkeit bei 700 u/min bei der Synthese.
      Hinweis: Stellen Sie eine mäßige Geschwindigkeit rühren bis zu vermeiden, die Lösung Platschen.
    6. Der Heizplatte zu stoppen und entfernen Sie die Flasche um die Lösung langsam bei Zimmertemperatur abkühlen lassen.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten.
    7. Pipette 2 mL NaOH-Methanol-Stammlösung und 2,965 mL NH 4 F-Methanol-Stammlösung in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Ziehen Sie den Schlauch mit der Kappe und mischen Sie die Lösung durch leistungsstarke vortexen für 5 s.
    8. Hinzufügen der Mischung in die Flasche durch eine Glaspipette langsam über 5 min.
    9. Erhöhen die Temperatur der Mischung auf 50 ° C und halten Sie sie bei 50 ° C für 30 min.
      Hinweis: Stellen Sie die Temperatur nicht höher als 50 ° C weil die hohe Temperatur Kristall Kernbildung und Wachstum fördern wird.
    10. Erhöhen Sie die Temperatur (~ 100 ° C) zu verdampfen aus Methanol und verbinden Sie den Kolben zu einer Schlenk-Linie mit dual Vakuum/Gasarmatur zu entfernen, die restliche Methanol, halten das Reaktionsgemisch unter Vakuum für ca. 2-3 min.
    11. Schalterstellung der Absperrhahn die Küvette mit Stickstoff füllen.
    12. Erhöhen die Temperatur bis 290 ° C bei einer Heizrate von ~ 5 ° C/min. halten die Reaktionsmischung bei 290 ° C für 1,5 h
    13. Der Heizplatte zu stoppen und entfernen Sie die Flasche um das Reaktionsgemisch langsam bei Raumtemperatur unter Rühren abkühlen lassen.
      Achtung: Seien Sie vorsichtig mit der heißen Platte mit hoher Temperatur (> 400 ° C), schwere Verbrennungen bei Hautkontakt zu vermeiden.
    14. Übertragen Sie die Mischung in die Flasche in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Flasche mit 30 mL Ethanol und übertragen Sie die Lösung auf die Zentrifugenröhrchen.
    15. Zentrifugieren Sie das Produkt bei 4.000 × g für 8 min bei Raumtemperatur und entsorgen des Überstands.
    16. Fügen Sie 10 mL Hexan Zentrifugenröhrchen und neu verteilen das Produkt mit Beschallung (60 kHz, 240 W) für mind. 2
    17. 30 mL Ethanol hinzufügen das Rohr. Drehen Sie das Gerät bei 4.000 × g für 8 min und dann verwerfen des Überstands.
    18. Neu zerstreuen die feste Produkte im unteren Teil Zentrifugenröhrchen mit 5 mL Hexan. Speichern Sie die Lösung im Kühlschrank bei ~ 4 ° C bis benötigt.
      Hinweis: Die Großbildschirmen Emission von Kern-Schale-UCNs wird durch bestrahlen die Lösungen mit einem 808 nm-Laser (2 W) getestet.

2. Synthese von biokompatiblen UCNs Nanostrukturen

  1. Vorbereitung der Liganden-freie UCNs Nanopartikel
    1. kombinieren 30 mL Ethanol mit der als vorbereitet Oleate-capped UCNs Lösung (Schritt 1.2.18) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 4.000 × g für 8 min bei Raumtemperatur und entsorgen des Überstands.
    2. Kombinieren Sie 10 mL saure wässrige Lösung (pH = 4) angepasst von HCl (0,1 M) mit dem Niederschlag in 50 mL Zentrifugenröhrchen und auflösen den Niederschlag durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 30 min.
    3. Übertragung der Lösung in ein Glas Fläschchen mit kräftigen rühren für 2 h.
    4. Extrahieren die wässrige Lösung mit 30 mL Diethylether zu entfernen die Ölsäure, wiederholen dreimal.
    5. Fügen Sie 10 mL Wasser in den kombinierten Äther-Schichten mit sanft schütteln.
    6. Sammeln die wässrige phase zusammen (20 mL) und fügen Sie 20 mL Aceton mit vortexen für 5 s.
    7. Spin down das Produkt bei 35.000 × g für 10 min und den Überstand verwerfen. Den Niederschlag in 2 mL Wasser auflösen.
  2. Vorbereitung des Polymers geändert UCNs (PAA-UCNs)
    1. 200 mg Polyacryl Säure zu kombinieren (PAA, Mw = 1.800) mit 20 mL Wasser durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 20 min. Fügen Sie der oben genannten Liganden-freie UCNs in der PAA-Lösung mit kräftig rühren.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 durch NaOH-Lösung (1 M) mit Beschallung (60 kHz, 240 W), für 30 min. halten Sie die Mischung für 24 h bei Raumtemperatur unter Rühren.
    3. Sammeln die Ausfällung durch Zentrifugation bei 35.000 × g für 10 min. wieder auszusetzen das Produkt in 10 mL Wasser durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 5 min und Zentrifuge wieder bei 35.000 × g für 10 min. diesen Schritt wiederholen Sie dreimal.
    4. Neu verteilen das Produkt in 8 mL Wasser durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 5 min. speichern die Lösung im Kühlschrank bei ~ 4 ° C bis benötigt.
  3. Vorbereitung der funktionellen DBCO-UCNs-Nanopartikel
    1. Spin-down PAA@UCNs als vorbereitet (1 mg) durch Zentrifugation bei 35.000 × g für 10 min. wieder aussetzen des Niederschlags in 1 mL trocknen DMF durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 1 min und Zentrifuge wieder bei 35.000 × g für 10 min. diesen Schritt zweimal wiederholen.
    2. Auflösen des Niederschlags in 200 µL trocknen DMF in einer Glasflasche. Hinzufügen von EDC (14 mg), HOBT (12,2 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) und DIPEA (16 µL) in die Durchstechflasche mit magnetischen rühren für 24 h
    3. Sammeln das Produkt durch Zentrifugation bei 35.000 × g für 10 min. Überstands entfernen und erneut aussetzen des Niederschlags in 1 mL DMSO und Zentrifuge wieder bei 35.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
    4. Zerstreuen, das Produkt in 0,2 mL DMSO und Speicher im Kühlschrank bei ~ 4 ° C vor dem Gebrauch.

3. Bioapplications DBCO-UCNs in der Verordnung der Membrankanäle in lebenden Zellen

  1. Kultur der HEK293 Zellen in Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) mit 10 % FBS, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin ergänzt und in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 ° c Seed 1 × 10 5 Zellen in 1 mL DMEM/Brunnen in einem 12-Well-Platte zu erhalten und bewahren Sie es in den Inkubator für 24 h
  2. Kombinieren das Plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µg) mit P3000 Transfection Reagens (2 µL) in Eagle ' s Minimum wesentlichen Medien (MEM) (100 µL) in Microcentrifuge Schlauch A, und fügen Sie Transfection Reagens (1,5 µL) in MEM (100 µL) im Rohr B.
  3. Die Mischung aus Lösungen in Tuben A und B für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Verbinden die Lösung in Röhre A und B mit 400 µL MEM. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL zweimal serumfreien DMEM.
  5. Fügen Sie die 600 µL Transfektion Mischung in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte und inkubieren Sie den Zellen bei 37 ° C Inkubator für 4 Std. Entfernen Sie das Medium und waschen zweimal mit 1 mL DMEM.
  6. 1 mL DMEM mit 1 µL Ac 4 ManNAz (50 mM in DMSO) in den Brunnen und halten Sie es für 2 Tage im Inkubator.
  7. Entfernen Sie das Medium und einmal mit 1 mL PBS waschen. Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA (0,25 %) Lösung in jede Vertiefung des 12-Well-Platte und bei 37 ° C inkubieren Sie bis Zellen (~ 2 min) gelöst haben. Re Kultur der Zellen in einer konfokalen Petrischale mit 1 × 10 5 Zellen/Brunnen in 1 mL DMEM für Übernachtung.
  8. Des Mediums zu entfernen und fügen Sie 1 mL frische DMEM mit 2 µL DBCO-UCNs (50 mg/mL) in die Schüssel für 2 h bei 37 ° C. Für die konfokale Bildgebung waschen Zellen zweimal mit DMEM und 1 µL Rhod-N 3 (10 mM) für 30 min.
  9. Für die intrazellulären Calcium-Analyse, inkubieren Sie die Zellen mit der Mischung von 1 µL Rhod-3 Uhr (10 mM), 10 µL Probenecid (250 mM) und 10 µL laden Puffer (Pluronic Tensid polyols,0.1% w/V)) in 1 mL DMEM Medium für 30 min im Dunkeln.
  10. Waschen der Zellen mit serumfreien DMEM und Bestrahlen mit 808 nm NIR Licht bei der Dosierung von 0,8 W/cm 2 für 20 min (5 min Pause nach 5 min Beleuchtung).
  11. Tragen die bildgebenden Ergebnisse auf das konfokale Mikroskop (Laserquelle: 561 nm Laser; Detektorbereich: 610/75 nm; Objektiv: 100 x 1,4 NA Öl, Belichtungszeit: 100 ms). Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA (0,25 %) Lösung in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C bis Zellen (~ 2 min) gelöst haben. Wieder aussetzen der Zellen in 1 mL PBS für Flow-Zytometrie (FCM)-Analyse (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).

Ergebnisse

Die schematische Syntheseverfahren von Kern-Schale Lanthanid-dotierte UCNs sind in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und hochauflösenden Übertragung Elektronenmikroskopie (HRTEM) Bilder von Core- und Core-Shell UCNs Nanostrukturen bzw. gesammelt wurden (Abbildung 1). Die Liganden-freie UCNs sind durch das Entfernen der hydrophoben Ölsäure auf der...

Diskussion

Dieser Artikel hat ein Verfahren für die Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristallen (UCNs) und ihre Oberflächenmodifikation mit funktionalen Moieties für mobile Anwendungen vorgestellt. Dieses neuartige Nanomaterialien besitzt hervorragende optische Eigenschaften, die UV- und sichtbaren Lichts bei NIR leichte Erregung durch einen Multi-Photonen Großbildschirmen Prozess abgeben können. In diesem Protokoll, die Kern-Schale-UCNs-Nanostrukturen (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@Na...

Offenlegungen

Wir haben nichts zu veröffentlichen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) und (RG 35/15) in Nanyang Technological University, Singapore und National Natural Science Foundation von China (NSFC) (Nr. 51628201) vergeben.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1-OctadeceneSigma AldrichO806Technical grade
oleic acidSigma Aldrich364525Technical grade
MethanolFisher ScientificA412Technical grade
EthanolFisher ScientificA405Technical grade
AcetoneFisher ScientificA18Technical grade
HexaneSigma AldrichH292Technical grade
Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3)Sigma Aldrich36770299.9% trace metals basis
Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32580599.9% trace metals basis
Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32601199.9% trace metals basis
Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32604699.9% trace metals basis
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma AldrichS5881reagent grade
Ammonium fluoride (NH4F)Sigma Aldrich338869ACS reagent
Hydrogen chloride (HCl)Fisher ScientificA144reagent grade
polyacrylic acid (PAA)Sigma Aldrich323667average Mw 1800
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)Sigma Aldrich54802ACS reagent
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Sigma AldrichE7750commercial grade
Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2)Sigma Aldrich761540ACS reagent
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)Sigma AldrichD125806ACS reagent
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231Technical grade
HEK293 cell lineATCCCRL-1573human embryonic kidney
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma AldrichF1051ACS reagent
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher1514012210,000 U/mL
plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus)Addgene15753Plasmid sent as bacteria in agar stab
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11965092High glucose
opti-Modified Eagle Medium (MEM)Thermo Fisher51985034Reduced Serum Media
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo FisherL3000015Lipid-Based Transfection
N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz)Sigma AldrichA7605ACS reagent
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher25200056Phenol red
Rhod-3 AM Calcium Imaging KitThermo FisherR10145Fluorescence dye
5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3)Sigma Aldrich760757Azide-fluor 545
Confical dishibidi GmbH81158Glass Bottom, 35 mm
50 ml conical centrifuge tubesGreiner Bio-One227261Polypropylene
15 ml conical centrifuge tubesGreiner Bio-One188271Polypropylene
1.5 ml conical microcentrifuge tubesGreiner Bio-One616201Polypropylene
Phenylmethyl silicone oilClearco Products63148-52-7Less than 320 degrees Celsius
Glass thermometerGH ZealL0111/10From -10 to 360 degrees Celsius
12-well plateSigma AldrichZ707775Polystyrene

Referenzen

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  2. Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543 (7644), 229-233 (2017).
  3. Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28 (24), 3987-4011 (2016).
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