Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Mikrofluidische Technologie überwindet viele der Einschränkungen zu den traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie. Anders als Massen-Kultur bietet es eine einzellige Auflösung und lange Beobachtung Zeiten überspannt Hunderte von Generationen; im Gegensatz zu Agarose Pad-basierte Mikroskopie hat es einheitliche Wachstumsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Weil der kontinuierliche Fluss von Nährmedium der Zellen in einem mikrofluidischen Gerät aus unvorhersehbaren Schwankungen in der chemischen Umgebung verursacht durch Zellwachstum und Stoffwechsel, authentische Veränderungen der Genexpression und das Zellwachstum in Reaktion auf isoliert bestimmte Reize können sicher beobachtet werden. Bacillus Subtilis dient hier als ein Modell Bakterienarten, eine "Mutter-Maschine" zu demonstrieren-Methode für die zelluläre Analyse geben. Wir zeigen, wie Sie zu konstruieren und mikrofluidischen Gerät zu ergründen, mit Zellen zu laden, mikroskopische Bildgebung zu initiieren, und setzen Zellen auf einen Reiz durch den Wechsel von einem Wachstumsmedium zum anderen. Stress-responsive Reporter wird als Beispiel verwendet, um den Typ der Daten offenbaren, die mit dieser Methode erzielt werden können. Wir diskutieren auch kurz weitere Anwendungen dieser Methode für andere Arten von Experimenten, wie z. B. Analyse der bakteriellen Sporenbildung.

Einleitung

Eines der auffälligsten Merkmale des Lebens auf der Erde ist seine große Widerstandsfähigkeit und Vielfalt. Ein zentrales Ziel der Molekularbiologie ist es, die Logik zu verstehen, mit der Zellen Gene und Proteine verwenden, um ihr Wachstum und ihre Fitness unter verschiedensten Umweltbedingungen zu maximieren. Um dieses Ziel zu erreichen, Wissenschaftler dürfen getrost zu beobachten wie einzelne Zellen wachsen, teilen und express ihre Gene unter einem gegebenen Satz von Bedingungen, unter Hinweis darauf, wie Zellen auf nachträgliche Änderungen in ihrer Umgebung reagieren. Traditionellen analytische Methoden in der Mikrobiologie haben jedoch technische Einschränkungen, die die Arten von Fragen betreffen, die behandelt werden können. Zum Beispiel Bulk Kultur-basierte Analysen haben im Laufe der Jahre als sehr nützlich erwiesen, aber sie bieten nur Populationsebene Daten, die sinnvolle Zell-Zell-Varianten oder das Verhalten der kleinere Sub-Populationen von Zellen an der Gesamtbevölkerung überdecken können. Einzellige Analysen von lebenden Bakterien basierend auf Lichtmikroskopie einzellige Verhalten offenbaren aber auch technisch beschränkt. Bakterien sind in der Regel auf Agarose-Pads mit Wachstumsmedium, immobilisiert aber Zelle Wachstum und Teilung Massen die mikroskopische Ansicht und die verfügbaren Nährstoffe verbraucht, nach nur wenigen Zelle Zyklen deutlich begrenzen die Beobachtung Zeit^{1, 2}. Darüber hinaus verändern die lokalen Erschöpfung der Nährstoffe und der gleichzeitige Aufbau von Stoffwechselprodukte durch Zellwachstum ständig die lokalen Zelle Wachstum Umwelt in einer Weise, die schwierig zu messen oder vorherzusagen. Solche Veränderungen der Umwelt mit Agarose-Pads stellen eine Herausforderung für Studien von stationären Verhaltensweisen oder der zellulären Reaktionen auf spezifische Veränderungen im Wachstum Bedingungen³.

Mikrofluidische Technologie, in denen ein flüssiges Medium Microfabricated Geräte ständig durchströmt wird bietet eine Lösung für klassische experimentelle Einschränkungen. Ein mikrofluidischen Gerät kann Einzelzellen für Leben-Zelle Mikroskopie in Position halten, während den Fluss der Wachstumsmedium ständig versorgt die Zellen mit frischen Nährstoffe und Stoffwechselprodukte und überschüssigen Zellen, wodurch eine sehr gleichmäßig wächst wäscht Umgebung. Unter konstanten Wachstumsbedingungen können losgelöst von der Einfluss von Umweltfaktoren, erlaubt einen ungehinderten Blick auf die innere Logik der Zellen Zelle Verhalten beobachtet werden. Da die Strömung mikrofluidischen Gerät verhindert, immer voll mit Zellen, wird Beobachtung der einzelnen Zelle Linien für Dutzende oder Hunderte von Generationen möglich^4,5. So lange Beobachtungszeiten ermöglichen die Erkennung von sonst nicht nachweisbar langfristige oder seltenen Zelle Verhalten. Schließlich wird die Zusammensetzung des Mediums, die durch das Gerät fließt bei geändert werden können, Zellen zu beachten, da sie zu Beginn einer Belastung oder die Einführung oder die Entfernung einer bestimmten Substanz reagieren.

Mikrofluidik hat bereits eine Reihe von wichtigen Anwendungen genossen. Zum Beispiel wurde es verwendet in Gewebe, Organ oder Körper-on-a-Chip-Geräte, in denen mehrere menschliche Zelltypen Co kultiviert, eine in Vivo Zustand⁶zu simulieren sind. für die Studie der Nematoden Bewegung in mikrostrukturierten Umgebungen⁷; untersuchen Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Biofilmen (z.B. ⁸); und für die Kapselung und Manipulation von winzigen Mengen von Zellen oder Chemikalien (z.B. ⁹). Mikrofluidische Geräte auch auf dem Gebiet der Mikrobiologie (für sehr gute Kritiken, s. ¹⁰ und ¹¹), zumal ihre körperliche zunehmend populär geworden und Fließeigenschaften sind gut aufeinander abgestimmt, um natürliche mikrobielle Nischen¹². Zum Beispiel wurde Mikrofluidik vor kurzem von Mikrobiologen für solche Zwecke eingesetzt als Zelle Wachstum und Teilung^13,14,15, Analyse der Erreger Bewegung¹⁶genau zu messen, Quorum sensing¹⁷ und physiologischen Übergänge¹⁸überwachen und für Protein zählen¹⁹, unter vielen anderen Beispielen. Die hier vorgestellte Methode ist speziell für die Analyse der einzelnen Bakterienzelle Linien anstatt Kombinationen von Sorten oder Arten. Das mikrofluidischen Gerät demonstriert hier nutzt eine Variante der "Mutter-Maschine" Design⁴, in dem Zellen Einzeldatei wachsen-innerhalb einer mikrofluidischen Graben mit einem geschlossenen und einem offenen Ende; Zelle Wachstum und Teilung schiebt Nachkommen Zellen oben und aus dem offenen Ende in die Strömung. Unsere Analysen konzentrieren sich in der Regel nur auf die "" Mutterzelle, die geschlossene Ende des Grabens beschränkt ist. Wir betrachten diese Methode als ein Fortschritt gegenüber früheren Licht Mikroskopie-basierte einzellige analytische Techniken, wie z. B. Zelle Immobilisierung auf Agarose-Pads. Während B. Subtilis als Vorbild dient, die Methode gilt auch für andere Bakterienarten (Escherichia coli ist ein weiteres gemeinsames Modell, einige Arten mit unterschiedlichen Zellgrößen oder Morphologien erfordern die Herstellung neuer Geräte mit verschiedenen Dimensionen). Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter um Zellen zu markieren und zu Veränderungen in der Genexpression zu visualisieren erfordert den Einsatz von genetisch gefügig Arten; Analysen von Zellwachstum und Morphologie sind jedoch auch ohne fluoreszierende Markierungen möglich.

Dieses Protokoll schließt den Prozess der Herstellung des Silizium-Meisters mittels Fotolithografie, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde⁵; Meister können auch leicht vom Microfabrication Einrichtungen ausgelagert werden. Freuen Sie sich auf die Ausformung eines PDMS-Geräts von einem verstärkten Silizium-Meister; kleben das Gerät an ein Deckglas; Montage der mikrofluidischen Einlass und Auslass Sanitär, Armaturen einschließlich Prise um mittlere umschalten zu ermöglichen; Passivierungslösung das Gerät, die Vorbereitung von Bakterienzellen und laden das Gerät mit Bakterienzellen; Befestigung der Rohrleitungen an das Gerät und Äquilibrierung der Zellen; und laden das Gerät auf eine Fluoreszenzmikroskop für die Bildgebung. Da viele verschiedene Bildaufnahme und processing-Software, die Werkzeuge verwendet werden können, zu visualisieren und analysieren Sie verschiedene Daten von Interesse^4,5, sind Beispielbilder gezeigt, aber Bilderfassung Methoden sind in diesem Protokoll nicht enthalten.

Protokoll

(1) PDMS Gerät Casting

1. In einer staubfreien Umgebung PDMS Polymer und Härtemittel im Verhältnis 10:1 mischen und unter Vakuum für mindestens 10 Minuten entgasen.
2. Legen Sie ein Silizium-Meister (oder eine Epoxid oder Polyurethan Nachbildung davon) auf ein Stück Alufolie ungebrochen in einem Polystyrol Petri-Platte. Den Teig entgast PDMS über den Master bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm. Degas die Petri-Platte für mindestens 10 Minuten Nutzung eines sanften Luftstrom Oberfläche Bläschen zu brechen.
   Hinweis: Die Abmessungen des Gerätes zwei Ebenen werden zur Verfügung gestellt im zugehörigen CAD Datei⁵ (siehe ergänzende Datei 1). Ein plastische Nachbildung Master kann teilweise während der Entgasung schweben; in diesem Fall drücken Sie das Replikat mit eine saubere Kunststoff-Applikator.
3. PDMS für mindestens 1 Stunde im Ofen bei 60 ° C zu heilen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Entfernen Sie die Master- und ausgehärteten PDMS aus der Petri-Platte mit Aluminium-Folie. Die Aluminium-Folie von der Rückseite des Meisters ziehen Sie vorsichtig ab, dann ziehen Sie vorsichtig die PDMS vom Master.
   Hinweis: Alternativ können PDMS über Nacht bei Raumtemperatur geheilt werden. Die relative Zerbrechlichkeit eines Silizium-Wafer-Master kann überwunden werden, indem mit Epoxy Klebstoff dauerhaft binden den Wafer zu einem 1/16-Zoll-dicken Aluminiumscheibe von der gleichen Größe wie der Wafer.
4. Ein Wafer in der Regel mehrere mikrofluidischen Geräte mit leicht unterschiedlichen Dimensionen umfasst (siehe ergänzende Datei 1), ein einziges Gerät mit einem sauberen, scharfen Skalpell Größe geschnitten.
   Hinweis: Für Routine B. Subtilis arbeiten, verwenden Sie Geräte mit 1,0 µm breite Zelle Gräben, die mit einem C oder F in der zugehörigen CAD-Datei markiert sind.

2. Gerät Stanzen und kleben

1. Ort ein Stück transluzent Büro mit Klebeband (siehe Tabelle der Materialien) über die gemusterte Seite des Geräts, um die Sichtbarkeit der gemusterten Features zu verbessern. Die Einlass und Auslass Ports werden als Kreisflächen an den entgegengesetzten Enden der sichtbaren fluidische Kanäle (Abbildung 1) identifiziert. Um ihre Sichtbarkeit zu verbessern, beim Stanzen von Löchern in das Gerät für den Einlass und Auslass Pins, markieren Sie die ein- und Ausläufe mit Punkten mit einer feinen Spitze Marker.
   Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Einlass und Auslass Pins nicht überfüllt sind, wird jeder andere Kanal gelocht beginnend mit den Kanal direkt unter dem alphabetischen Bezeichner für das Gerät.
2. Das PDMS-Gerät drehen, so dass die Dekorseite nach unten ist, und durch das Gerät zu den markierten Punkten eine 0,75 mm Biopsie-Punch mit Punsch; entsorgen Sie die Ausstanzungen.
   Hinweis: Die Geräte sind mit der Dekorseite nach unten schlug, weil das Loch durch die Biopsie-Punch erzeugt in der Regel leicht ausgestellte ist wo der Stempel des Polymers betritt. Stanzen das Gerät in eine umgekehrte Orientierung sorgt dafür, dass das Loch auf die Dekorseite eine scharfe Grenze hat.
3. Mit einem Stereomikroskop, sicherzustellen Sie, dass die gestanzten Löcher überschneiden sich mit den Einlass und Auslass des Gerätes. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette, um keine überflüssigen Fragmente von PDMS aus gestanzten Löcher zu entfernen.
4. Verwenden Sie Klebeband, um Staub von beiden Seiten des Geräts und des Ortes in einer sauberen Polystyrol Petri-Platte zu entfernen. Bereiten Sie ein Deckglas 22 x 40 mm, durch Benetzung mit 100 % Isopropyl-Alkohol und rieb mit einem Reinraum abwischen; trocken mit einem Strom von staubfreie Luft oder Stickstoff.
5. Stellen Sie die gestanzte PDMS Gerät Funktion Seite nach oben zusammen mit dem gereinigten Deckglas in einem Sauerstoffplasma sauberer.
   1. Plasma-Behandlung das Gerät mit den folgenden Einstellungen: Vakuum, 70 mTorr; O₂ Druck, 200 mTorr; Dauer, 15 s; macht, sofort nach Abschluss die Plasma-Behandlungsdauer 30 W. Gerät und Deckglas aus dem Plasma Reiniger entfernen.
   2. Invertieren Sie der PDMS und legen Sie es auf das Zentrum der Glasabdeckung, so dass die Dekorseite das Glas berührt; Stellen Sie sicher, dass die Fütterung Kanäle (laufen zwischen den Einlass und Auslass) mit der Längsachse der Glasabdeckung ausgerichtet sind. Drücken Sie sehr sanft, um sicherzustellen, dass die PDMS Dichtungen gegen das Glas.
6. Backen Sie das montierte Gerät in einem Ofen für mindestens 1 h bei 60 ° C. Nach dem Backen, manuell überprüfen Sie, ob die PDMS auf das Glas verklebt wird, indem man vorsichtig an einer Ecke des Geräts.
   Hinweis: Sobald das Gerät verbunden ist, sollte es innerhalb von 24 h verwendet werden wie das Polymer wird zunehmend hydrophobe mit zunehmender Zeit nach Plasmabehandlung.

(3) mikrofluidischen Sanitär-Vorbereitung

1. Schnittlängen Sie Polymer Schläuche (Innendurchmesser (ID) 0,02 Zoll Außendurchmesser (OD) 0,06 Zoll) passenden Längen von der Spritzenpumpe der Vermittlungsvorrichtung zu erreichen, um (falls verwendet) und das Gerät auf das Mikroskop montiert. Schnittlängen Sie so viele mikrofluidischen Gassen gibt.
2. Montieren Sie Y Kreuzungen für Quetschventile (falls verwendet) durch Schneiden und Anbringen von 2 cm Länge des flexiblen Silikon Schläuche (0,03 Zoll ID, 0,065 Zoll OD) an der oberen Widerhaken des "Y" und 1 cm Länge der Silikonschlauch auf der unteren Widerhaken des "Y".
3. 10 cm (oder geeigneten) Schnittlängen von Polymer-Schläuche; verbinden Sie sie mit einem Ende an der Switch-Verzweigung durch Einfügen in die 1 cm Silikon Schlauch Segmente auf der unteren Widerhaken des "Y". Schließen Sie sie an das andere Ende an 21G Nadeln, die von ihren Kunststoffspritze Adapter und gebogen ca. 90 ° etwa 9 mm vom Ende der Nadel entfernt wurden.
4. Schließen Sie 21G stumpfe Nadeln an einem Ende der Röhre Segmente, die von den Spritzen auf den Schalter-Apparat ausgeführt wird, indem man die Nadeln in den Schlauch an. Legen Sie die anderen Enden jeder Länge von Schläuche in Silikon Schlauch Segmente auf den Einlass Widerhaken der Y-Kreuzungen.
   Hinweis: Verwenden Sie irgendeine Art von Apparat, um Quetschventile und Abzweigungen in Position zu halten; Dies kann leicht von einer Mikropipette Tip Box (Abb. 2D) erfolgen.
5. Schnittlängen von Polymer-Schläuche, Abfälle aus der Steckdose des Geräts zu einem Abfall-Becher zu tragen. Verbinden Sie sie mit einem Ende an gebogenen 21G Nadeln vorbereitet, wie oben beschrieben. Kleben Sie das andere Ende der Rohre in einem Abfall-Becher.
6. Bereiten Sie entsprechende Mengen an Medien mit 0,1 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen Sie die gewünschte Größe und Anzahl der Spritzen. Verbinden Sie die BSA geladen Spritzen an den vorbereiteten 21G Nadeln befestigt, die Einlass Schlauch und Ladung Spritzen in Spritzenpumpen.
   Hinweis: für typische Experimente, die 5 Kanäle des Gerätes verwendet werden, jeweils mit einer 20-mL-Spritze. Ein Experiment, in dem das Medium gewechselt ist, erfordert 2 Bänke 5 Spritzen. Hier die Pumpe mit der erste Bank nennt man die Phase-1-Pumpe und die Pumpe mit der zweiten Bank, mit dem Post-Schalter-Medium wird als die Phase-2-Pumpe bezeichnet.
7. Luft von der Einlass-Sanitär entlüften, durch Ausführen der Spritzenpumpen mit einer high-Flow-Rate (> 500 µL/min), beginnend von der Spritzenpumpen vertikal ausrichten und durch Tippen auf die Spritzen um Luftblasen in den Vordergrund zu bringen. Sobald Luft aus dem Spritzen gelöscht wurden, legen Sie die Spritzenpumpe horizontal und schrittweise Tippen Sie oder Schalter Apparat zu entfernen und säubern Luftblasen durchblättern Sie die Polymer-Linien von den Spritzen bis. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Bank von Spritzen (wenn Medien wechseln).
8. Nach Luftblasen gelöscht werden, setzen die Phase-2-Spritzenpumpe (d. h.mit dem Medium, der verwendet wird zweite, nach dem Wechsel) zu 1,5 µL/min, dann pause den Fluss. Platzieren Sie kleine Binder Clips auf die Segmente der Schlauch auf dem Zweig der Y-Kreuzungen, die zweite, mittlere Phase entspricht. Weiterhin ausgeführt, die Phase-1 Spritzenpumpe mit einer bescheidenen Durchflussrate (z.B. 10 µL/min) für mindestens 30 min, das zweite Medium aus den Zulauf-Schlauch säubern stromabwärts von der Y-Kreuzung.

(4) Zelle Kultur Vorbereitung

1. Wachsen Sie eine Vorkultur der Belastung der Interesse an dem gewünschten Medium auf stationäre Phase über Nacht. Der Bakterienstamm sollte eine Mutation enthalten, die macht die Zellen unbeweglich, so dass die Zellen aus der Kanäle des Gerätes nicht schwimmen zu tun.
   Hinweis: In diesem Protokoll wird der Bakterienstamm B. Subtilis 3610 mit einem Hag_A233V Substitution (diese Mutation bewirkt, dass die Geissel direkt anstatt spiralförmige, Vermeidung von Zelle Motilität zu sein), eine P_RsbV- mNeonGreen Reporter für Zelle Stress und eine konstitutive P_Hyperspank- mNeptune (rot) Reporter Zellen zu markieren. LB-Lennox-Medium wird im Beispiel Protokoll verwendet. Typische Belastungen für Mikrofluidik Experimente enthalten eine oder mehrere fluoreszierende transkriptionelle Reporter und ein konstitutiv produziert, zytoplasmatischen fluoreszierende Protein um automatisierte Erkennung von Zellen zu erleichtern. Wachstumsstörungen wurden nicht beobachtet, wenn LB Lennox reichen Medium verwendet wurde, aber B. Subtilis Wachstum bei minimaler Medien unter mikrofluidischen Bedingungen gehemmt kann, weil abgesondert, dass Siderophores durch die mittlere Strömung weggespült werden. Unter solchen Umständen kann Wachstum durch die Zugabe von Natriumcitrat und Eisenchlorid auf das Medium wiederhergestellt werden, wie für S7₅₀ mittlere¹¹berichtet.
2. Verdünnen Sie am Morgen des Experiments, B. Subtilis Zellen 01:50 in eine verblüfft 250-mL-Flasche mit 25 mL Wachstumsmedium. Wachsen Sie die Zellen für 5-6 h in Kultur bei 37 ° C zu einer optischen Dichte von mehr als 1 schütteln.
   Hinweis: Eine Dichte Zellkultur ist vorzuziehen, da die stationäre Phase B. Subtilis sind kleiner und weniger häufig gefunden in Zelle Zellen Ketten, Gerät laden zu erleichtern. Verschiedene Bakterienarten erfordern andere Mittel "oder" Wachstum Bedingungen für optimale Beladung.
3. Mit einer Spritze, ausgestattet mit einem 5 µm Porengröße Filter, Filtern Sie etwa 15 mL der Zellkultur in ein 15 mL konische Röhrchen, B. Subtilis Zelle Ketten zu entfernen (es ist nicht erforderlich für E. Coli und kann nicht mit anderen Arten erforderlich sein).
   Hinweis: Es sollte relativ wenige Zellen entfernt werden; das Filtrat sollten trübe werden.
4. Zentrifugieren Sie die gefilterten Kultur für 10 min bei 4.000 x g bei Raumtemperatur. Der Überstand abgießen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in die Restflüssigkeit überstand noch in die Röhre, ca. 500 µL frisches Medium hinzufügen, wenn erforderlich, um die Zellsuspension pipettieren.

5. Gerät laden

1. Legen Sie vorsichtig leeren dünnen Gel-Loading Mikropipette Tipps (siehe Tabelle der Materialien) in die Steckdose Löcher von mikrofluidischen Gerät.
2. Mit dünnen Gel-laden-Tipps mit einer Mikropipette P200, passiviert das Gerät durch die Injektion von 1 mg/mL BSA in den Saugbohrungen beobachten die Tipps in die Steckdose Löcher zur Füllung der mikrofluidische Kanäle (Abbildung 2A) Überwachung-haltigem Medium. Inkubieren Sie das Gerät für ca. 5 min bei Raumtemperatur.
   Hinweis: BSA dient häufig als blockiert oder Passivierung Agent, der an der hydrophoben Oberfläche des Polymers PDMS binden wird erhöhen die Hydrophilie und die Bindung von anderen Proteinen oder von Zellen (über Zelle Oberfläche Moleküle) zu reduzieren.
3. Mit dünnen Gel-Loading Tipps laden Sie jeden Kanal mit der resuspendierte Zellen (aus Abschnitt 4), mit den Tipps in den Auslasskanal zur Überwachung des Fortschritts der Zellen durch das Gerät (Abb. 2 b).
   Hinweis: Laden wird durch Festlegen der P200 Mikropipette auf maximal 200 µL Volumen und dann absaugen ein Luftpolster vor dem Absaugen eines kleinen Volumens (ungefähr Hälfte des Volumens der Dünnschliff die Pipettenspitze) Zellen erleichtert. Das Volumen der resuspendierte Zellen muss nicht genau, wie die Lautstärke des Gerätes PDMS klein im Verhältnis zu derjenigen der Mikropipette ist. Wir kennen keine Obergrenze für die Dichte der resuspendierte Zellen, solange die Zellsuspension in das Gerät pipettiert werden kann. Zelle Klumpen können das Gerät verstopfen und sollten vermieden werden, durch gründliche pipettieren und/oder Vortex mischen.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Gel-laden-Tipps aus der Steckdose Löcher, arbeiten jeweils einzeln zu Schäden am Gerät zu vermeiden.
5. Zentrifugieren Sie das Gerät in einem Tischgerät Microcentrifuge in einen entsprechenden Rotor-Adapter bei ca. 6.000 x g für 10 min (Abbildung 2).
   Hinweis: Ein benutzerdefinierte bearbeitet Aluminium Rotor-Adapter, der entworfen wurde, um in einem Microcentrifuge Rotor (Abbildung 2) passen diente; verschiedenen Zentrifuge Modelle können mit entsprechenden Rotor-Adapter verwendet werden. Die wichtige Funktion des Adapters ist, dass es seitliche Kraft in Richtung der geschlossenen Enden der Zelle Schützengräben, so zwingt Zellen in die seitlichen Kanäle bietet.
6. Erfolgreiche laden unter dem Mikroskop (Abbildung 3) zu überprüfen, aber ohne Anbringung des Geräts auf die Folie Halter/Bühne einfügen.
   Hinweis: In diesem Protokoll, eine 60 X 1,4 NA Ph3 Ölimmersion Ziel für beide Prüfung zu diesem Zeitpunkt und für die nachfolgende Bildgebung dient.

6. die Gerätemontage, Gleichgewichtherstellung und Montage

1. Sorgfältig montieren Sie das geladene Gerät auf einer Bühne Einlage durch Abkleben das Deckglas auf beiden Seiten des PDMS am unteren Rand der Bühne einfügen (d.h., invertieren die Bühne legen Sie vor dem Anbringen des Gerätes). Drehen Sie die Bühne einfügen-Gerätemontage, so dass die PDMS nach oben und legen Sie auf einer weichen Unterlage, wie z. B. einem staubfreien Tuch (Abb. 2D).
2. Einstellen die Durchflussmenge des Phase-1-Spritzenpumpe auf 35 µL/min arbeiten mit einem Fahrstreifen in einer Zeit, legen Sie die Einlassnadel und dann die Steckdose Nadel (d.h., läuft auf den Abfall Becher; Abb. 2E).
3. Jedes überschüssige Medium mit einer sauberen, staubfreien Tuch abwischen und das Gerät auf Dichtheit überprüfen. Prüfen Sie den Steckdose Schlauch für das Erscheinungsbild der überschüssigen Zellen (in der Regel erscheint als eine trübe Streifen) und die mittlere Meniskus, die langsam in Richtung der Abfälle Becher bewegen wird.
4. Das Gerät bei 35 µL/min für ca. 15-30 min laufen lassen, bis alle angeschlossenen Bahnen in den Abfall Becherglas Entwässerung sind zu ermöglichen.
5. Die Phase-1 Spritzenpumpe auf 1,5 µL/min und unterbrechen Sie den Informationsfluss. Bringen Sie den gesamten Apparat der Pumpe und Gerät an das Mikroskop (dieser Prozess wird unterstützt, indem sie alles auf einem rollenden Wagen) und starten Sie die Phase-1 mittlerer Durchfluss 1,5 µL/min. sorgfältig montieren die Bühne einfügen mit dem Gerät auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit Band wie nötig, um den Einlass und Auslass-Schlauch zu verlegen.
6. Suchen Sie die gewünschte Positionen auf dem Gerät für die Bildgebung und beginnen Sie Bildgebung wie gewünscht zu. Beachten Sie, dass Zellen in der Regel ein paar Stunden (ca. 10 Generationen benötigen), stationäre exponentielle Phase Wachstum zu erreichen, und der Beginn der Bildaufnahme werden, wie verzögert kann gewünscht, so dass Bildgebung nach Gleichgewichtherstellung Periode beginnt.
   Hinweis: Das stationäre Wachstum von Zellen in der exponentiellen Phase statt sollte überprüft werden während der nachfolgenden Bildanalyse durch Zellteilung Zeiten zu verfolgen und sicherzustellen, dass sie einen konstante Mindestwert erreicht haben.

7. mittlerer wechseln

1. Zwischen den aufeinander folgenden Runden der Bildgebung halten Sie an, den Fluss von Phase-1-Spritzenpumpe. Vorsichtig ausclipsen der Bindemittel-Clips aus der Phase-2-Silikon Schläuche, verschieben jeweils den Silikonschlauch auf dem Phase-1-Zweig der Y-Kreuzung. UN-Pause den Fluss des Phase-2 Spritze Pumpe (die auf 1,5 µL/min im Schritt 3.8 gesetzt wurde) und Bildgebung weiter.
   Hinweis: bei 1,5 µm/min mit einer 10-cm-Länge von Polymer tubing flussabwärts der Y-Kreuzungen der zweiten Phase Medium erreicht das Gerät in etwa 50 Minuten. Die Zeit, um das Gerät kann mit Medien, die Fluoreszenz Tracer Partikel enthalten empirisch getestet werden.

Ergebnisse

Erfolgreiche erste Zelle laden, wie Phasenkontrast-Mikroskopie bewertet vor dem Anbringen der mikrofluidischen Sanitär an das Gerät würde gelten, dass alle oder fast alle der mikrofluidischen Seitenarmen, enthält eine oder mehrere bakterielle Zellen ( Abbildung 3A). Optimale Beladung würde mehrere Zellen in jedem Kanal zeigen, aber Kanäle füllt sich dennoch mit Zellen durch Zellwachstum Gleichgewichtherstellung Zeitraum (Abb. 3 b

Diskussion

Diese Mikrofluidik-Protokoll ist flexibel, dass viele der Schritte zur Optimierung ihrer Nutzung mit einer bestimmten Art oder Sorte oder für einen bestimmten Zweck geändert werden können. In diesem Protokoll haben wir Änderungen an der ursprünglichen "Mutter-Maschine" Konzept⁴ zur Optimierung ihrer Nutzung mit B. Subtilisgemacht. Oft bilden die Schützengräben, in denen die Zellen beschränkt sind, eine einschichtige Funktion während in dieses Protokoll verwenden wir Zweischicht-Z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	(240)4019862	This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch	World Precision Instruments	504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50	Plasma Etch Inc.	PE-50	Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06"	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD	HelixMark Standard Silicone Tubing	60-795-05	For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G	Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200)	Molecular BioProducts	2155	For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane	Pall Life Sciences	4560	For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1"	McMaster-Carr	75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene	Nordson Medical	Y210-6005	The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon		This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1	wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven	VWR	414005-106	for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit	3M	2216 B/A	may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width	3M		to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800N	listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	To clean cover glass
Syring pump, 6 channel	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	a brand of dust-free wipes