Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

Zusammenfassung

Gel-Seq ermöglicht Forschern gleichzeitig Bibliotheken für beide DNA und RNA-Seq bei vernachlässigbaren Kosten ab 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel-Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. Leider die Standardprotokolle für Erzeugung von genomischen oder transkriptomischen Bibliotheken sind nicht kompatibel und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine besondere Probe DNA oder RNA-Sequenz. Gel-Seq löst dieses Problem durch Forscher um gleichzeitig Bibliotheken für DNA und RNA beginnend mit 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren. Wir konzipiert Gel-Seq so, dass es leicht von anderen Forschern umgesetzt werden könnten; viele Genetik Labore verfügen bereits über die notwendige Ausrüstung, die Gel-Seq-Gerät-Herstellung zu reproduzieren. Unser Protokoll beschäftigt häufig verwendete Kits für beide ganz-Transkript Verstärkung (WTA) und Bibliothek Vorbereitung, die auch bereits Forscher vertraut sein dürften versiert in der Erzeugung von genomischen und transkriptomischen Bibliotheken. Unser Ansatz ermöglicht Forschern, bringen die Kraft der DNA und RNA Sequenzierung auf einer einzigen Probe ohne Spaltung mit unwesentlichen zusätzlichen Kosten zu tragen.

Einleitung

Nächste Generation sequencing (NGS) hatte eine profunde Auswirkung auf dem Weg, die Genetik geforscht wird. Wo Forscher einmal auf die Sequenzierung des Genoms eine ganze Spezies konzentriert, ist es nun möglich, das Genom einer einzigen Tumors oder sogar eine einzelne Zelle in einem Experiment sequentiell. ¹ NGS hat auch kostengünstig zu den RNA-Transkripte gefunden innerhalb einer Zelle, eine Sammlung von Daten, bekannt als das Transkriptom Sequenzierung gemacht. Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. ^{2 , 3 , 4} leider Standardprotokolle sind unvereinbar und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine gegebene Probe DNA oder RNA-Sequenz. Wenn eine Start Stichprobe groß genug ist, kann es in zwei Hälften aufgeteilt werden. Bei kleineren Maßstäben Materialverlust durch Spaltung Proben kann Bibliothek Qualität beeinflussen und Bündelung von Proben kann durchschnittlich interessante Variationen zwischen den Zellen. ⁵ im übrigen interessieren sich Forscher zunehmend bei der Prüfung von Proben, die nicht können, z. B. Einzelzellen oder kleine heterogene Tumor Biopsien gespalten werden. ⁶

Um dieses Problem zu beheben, drei Protokolle vor kurzem wurden entwickelt, um aus der gleichen Ausgangspunkt Probe DNA und RNA Sequenz: Gel-Seq⁷, G & T-Seq⁸und DR-Seq-⁹. Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für Gel-Seq, die verwendet werden, um gleichzeitig DNA- und RNA-Bibliotheken von nur 100 Zellen bei vernachlässigbaren Kosten erzeugen kann. Der neue Aspekt der Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA basiert ausschließlich auf Größe mit low-cost Hydrogel Matrizen zu trennen. Die Kern-Innovation des Gel-Seq-Protokolls ist die physische Trennung der DNA von RNA. Diese Trennung erfolgt elektrophoretisch mit einer Kombination aus Polyacrylamid-Membranen, die die Größenunterschiede zwischen diesen Molekülen nutzen. Um diese Größenunterschiede in Zusammenhang zu setzen, zu prüfen, wie DNA und RNA abgebildet werden: während DNA vorhanden auf der Micron-Skala ist und eingesehen werden traditionelle Mikroskopie, RNA existiert auf der Nanometerskala und komplexe Techniken wie Cryo-Elektron abgebildet werden muss Mikroskopie. ¹⁰

Der Ansatz zur Trennung von DNA und RNA in diesem Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt. Die linke Tafel zeigt, dass DNA und RNA frei schwebend in Lösung in der Nähe von einer Membran. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wie auf der rechten Seite gezeigt, erleben DNA und RNA eine elektrophoretische Kraft, die Migration durch die Membran induziert. Durch die Membran Eigenschaften optimieren, schufen wir eine semipermeable Membran, die DNA von RNA trennt. Die DNA-Moleküle sind gegen die Membran gedrückt, aber verfangen am Rande wegen ihrer großen Größe. Auf der anderen Seite können kleine RNA-Moleküle, konfigurieren und schlängeln sich durch die Membran. Dieser Prozeß, bekannt als Reptation, ähnelt die Art, wie, die eine Schlange durch Rasen bewegt. Schließlich sind diese RNA-Moleküle durch eine zweite, mit hoher Dichte Membran, die zu schwierig für noch kleinere Polymere ist gestoppt (> 200 Basenpaaren), durch Winden. Einmal physisch getrennt, kann um Informationen über das Genom und Transkriptom zu generieren DNA und RNA erholt und verarbeitet werden. Während wir DNA und RNA trennen können, haben wir gefunden, dass bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn die RNA transkribiert, cDNA vor der Trennung umgekehrte ist. Die DNA/RNA-Hybriden sind stabiler als RNA allein und können noch durch die Dichte Membran passieren.

Abbildung 1 . Gel-Seq operative Prinzip. Das zugrunde liegende Prinzip verwendet, um räumliche Trennung von DNA und RNA. In einem angewandten elektrischen Feld kleine RNA-Moleküle Wandern durch die Dichte Membran aber große DNA-Moleküle sind an der Oberfläche gefangen. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von ref 7 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Dieses Papier beschreibt ausführlich sowohl die Herstellung von Gel-Seq-Gerät und das biologische Protokoll generieren gepaart DNA- und RNA-Bibliotheken. Eine Übersicht der beiden ist in Abbildung 2dargestellt. Das Gerät ist durch Schichtung drei unterschiedliche Dichte Polyacrylamid Gele übereinander in einem Prozess ähnlich erstellen standard Stapeln Gele hergestellt. ¹¹ das biologische Protokoll beginnt mit 100-1000 Zellen mit PBS-Puffer suspendiert. Die Zellen lysiert und die RNA in cDNA umgewandelt wird, bevor das Gerät verwendet wird, um die genomische DNA aus der DNA/RNA-Hybriden zu trennen. Nach der Trennung und Verwertung, genomische und transkriptomischen sind Bibliotheken zubereitet einen Prozess, der das gesamte Genom Standardbibliothek Vorbereitung Kit Protokoll verfolgt. Weitere Details über die Entwicklung und Validierung von Gel-Seq abgelesen werden im Labor auf einem Chip-Veröffentlichung "Gel-Seq: Vollständiggenom und Transkriptom Sequenzierung durch gleichzeitige Low-Eingang DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitung mit semi-permeable Hydrogel Barrieren ." ⁷

Abbildung 2 . Gel-Seq Protokoll. Eine Übersicht über die Schritte, die Gel-Seq-Gerät und das Protokoll zum generierten gepaarten DNA und RNA Bibliotheken zu fabrizieren. Teile davon wurden mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von Ref. 7 wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um DNA und RNA Bibliotheken aus einzelnen Zellen zu generieren, Forscher sollten erwägen, entweder G & T-Seq oder DR-f-G & T-FF, wie Gel-Seq, stützt sich auf eine räumliche Trennung von RNA aus genomischer DNA. Dieser Ansatz stützt sich auf Boten-RNA (mRNA) 3′ Polyadenylated Schweif als Pulldown-Ziel. Die mRNA wird auf eine magnetische Perle biotinylierte Oligo-dT Grundierung mit erfasst. Sobald die mRNA eingefangen hat die Perlen mit einem Magneten in Position gehalten werden und der Überstand mit der genomischen DNA entfernt und in einem anderen Gefäß übertragen werden kann. Nachdem diese körperliche Trennung abgeschlossen ist, können separate Bibliotheken aus der mRNA und DNA generiert werden. ⁸ dieser Ansatz funktioniert gut, wenn die RNA von Interesse Polyadenylated ist, kann nicht jedoch es verwendet werden, nicht Polyadenylated Abschriften, wie ribosomaler RNA, tRNA oder RNA von Prokaryoten zu studieren.

DR-Seq stützt sich auf eine Vorverstärkung Schritt wo DNA und cDNA abgeleitet von RNA in der gleichen Röhre verstärkt werden. Die Probe wird dann in zwei Teile gespalten und parallel, DNA und RNA-Seq Bibliotheken vorzubereiten verarbeitet. Zur Unterscheidung zwischen genomischer DNA und die cDNA abgeleitet von RNA, nimmt DR-Seq einen rechnerischen Ansatz. Sequenzen, in denen nur Exons vorhanden sind werden rechnerisch in der genomischen DNA-Daten, unterdrückt, wie diejenigen aus entweder DNA oder RNA entstanden sein könnte. ⁹ ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die DNA und DNA/RNA nicht räumlich getrennt sein müssen wie in Gel-Seq und G & T-seq. Der Nachteil ist jedoch, dass DR-Seq a-priori Kenntnis des Genoms und Transkriptom (d.h. Exons und Introns erfordert), und möglicherweise nicht ideal für Anwendungen wie z. B. Sequenzierung von Kernen, in denen viele Transkripte noch nicht vollständig sind gespleißt und weiterhin enthalten Introns. ¹²

Der neuartige Aspekt des Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA in Hunderten von Zellen ausschließlich anhand der Größe trennen. Diese Methode erfordert kein priori Kenntnis des Genoms oder Transkriptom, ist robust gegen unvollständige Spleißen und beschränkt sich nicht auf Poly-Adenylated-Protokolle. Für Anwendungen, wo ein Forscher mit mindestens 100 Zellen beginnen kann, bietet Gel-Seq ein einfaches Verfahren mit billigen und allgemein zugänglichen Materialien.

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Protokoll

1. Vorbereitung der chemische Lösung

Hinweis: Die folgenden Schritte sind für die Zubereitung von chemischer Lösungen, die in späteren Schritten erforderlich. Diese können in loser Schüttung und mehrere Monate gelagert werden.

1. Zunächst bereiten Sie 50 mL gereinigtes, deionisiertes Wasser durch Sterilisation in einem 254 nm UV-Vernetzung-Ofen für 15 min (15 mJ/cm² Gesamtexposition), keine kontaminierende DNA zu neutralisieren. Erhitzen Sie auf 37 ° C für den Einsatz in folgenden Schritten.
2. 10 mL eines 40 % Gesamt (T) und 3,3 % Vernetzer (C) (29,1) machen Polyacrylamid-Vorläufer-Lösung. Wiegen Sie 3,867 g Acrylamid Monomeren und BIZ-Acrylamid Monomeren 0,133 g. Kombinieren und bringen Volumen bis zu 10 mL mit warmem gereinigtes Wasser und Wirbel bis aufgelöst. Lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern.
   Hinweis: Vorgemischte 40 % T, 3,3 % C (29,1) Polyacrylamid-Lösungen im Handel erhältlich.
3. 10mL 50 % T, 5 % C Gel-Lösung zu machen. Wiegen Sie 4,750 g Acrylamid Monomeren und BIZ-Acrylamid Monomeren 0,250 g. Kombinieren und bringen Volumen bis zu 10 mL mit warmem gereinigtes Wasser und Wirbel bis aufgelöst. Lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern.
4. 10 mL einer 50 % (w/V) Saccharose-Lösung zu machen. 5 g Saccharose, ein Messzylinder dazugeben Sie und warmes gereinigtes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 mL. Vortex bis aufgelöst und bei Raumtemperatur lagern.
5. Machen Sie 10 mL 10 % APS (w/V). Ein Messzylinder 1 g Ammonium Bleichen (APS) hinzufügen. Hinzufügen, kalt (~ 4° C) gereinigtes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 mL und Vortex bis aufgelöst. Sofort in Aliquote von 200 µL einfrieren.

(2) Gel-Seq-Kassette-Fertigung

Hinweis: Gel-Seq wurde ursprünglich mit aufrechten Kassetten entwickelt (siehe Tabelle der Materialien für mehr Informationen); Dieses Protokoll kann jedoch angepasst, mit jedem standard-Gel-Elektrophorese-Kassette zu arbeiten.

1. Bereiten Sie Gel-Vorstufen in drei separaten Kunststoffrohre durch Zugabe von Reagenzien, wie unten in Tabelle 1 dargestellt. Nicht hinzufügen entweder APS oder Tetramethylethylenediamine (TEMED) bis in den folgenden Schritten geleitet. Vortex Zutaten gründlich mischen.

Füller Gelvorstufe		High-Density Gel Vorläufer		Geringe Dichte Gelvorstufe
40 %T, 3.3%C Acrylamid Bisacrylamide Lösung	1,6 mL	50 %T, 5 %C Acrylamid Bisacrylamide Lösung	2,4 mL	40 %T, 3.3%C Acrylamid Bisacrylamide Lösung	0,6 mL
Deionisiertes Wasser	10,2 mL	Deionisiertes Wasser	1,0 mL	Deionisiertes Wasser	4,8 mL
Zuckerlösung (50 % w/V)	2,6 mL	Zuckerlösung (50 % w/V)	0,6 mL
10 X Tris-Borat-EDTA	1,6 mL			10 X Tris-Borat-EDTA	0,6 mL
Ammonium-Bleichen (10 % w/V)	104.0 ΜL	Ammonium-Bleichen (10 % w/V)	50,0 ΜL	Ammonium-Bleichen (10 % w/V)	39,0 ΜL
TEMED	6.0 ΜL	TEMED	1,0 ΜL	TEMED	2.2 ΜL
Gesamtvolumen	16,1 mL	Gesamtvolumen	4,1 mL	Gesamtvolumen	6,0 mL

Tabelle 1. Gel-Synthese Reagenzien. Polyacrylamid-Gel Vorläufer Reagenzien ausreichend für die Herstellung von 2 Kassetten.

2. De-Gas Gel Monomer Lösungen durch eine Nadel durch die Kappe des Rohres und verbinden diese Nadel mit einem Haus Vakuumleitung. Tauchen diese Assembly in einem Ultraschallbad zu hoch und warten Sie, bis die Bläschen stoppen entstehende Flüssigkeit vor dem Umzug zum nächsten Schritt (~ 60 Sekunden / Rohr).
   Hinweis: Die Qualität des Vakuums und Ultraschallbad ist nicht kritisch, solange Bläschen aus der Lösung gesehen werden können.
3. Hinzu kommen TEMED und APS der Füller Gel Vorläufer und Wirbel kurz. Fügen Sie 6 mL der Füller Gel Vorstufe sofort jede Gel-Kassette durch Pipettieren der Lösung in den oberen Teil der Kassette hinzu. Verwenden Sie eine 1 mL Mikropipette hinzufügen den Vorläufer in sechs Schritten zu verschütten zu vermeiden. Die Gesamtzeit für diesen Schritt sollte weniger als 3 Minuten betragen.
4. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit Ebene durch die Positionierung der Kassetten aufrecht auf eine Tabelle. Füllen Sie den Rest der Kassette mit entionisiertem Wasser entgast. Pipette das Wasser wieder mit 1 mL Schritten langsam in die Mitte der Kassette zu mischen zu minimieren. Das Polymer für mindestens eine Stunde bis zu heilen, um über Nacht zu ermöglichen.
5. Nach des Polymers Aushärten invertieren Sie die Gel-Kassetten über ein Waschbecken, das Wasser-Overlay zu entfernen. Eine Druckluftpistole lässt sich sanft die Schnittstelle trocknen durch Einblasen von Luft durch die obere Öffnung der Kassette aus einer Entfernung von 6 Zoll.
6. Hinzu kommen TEMED und APS die High-Density Gel Vorläufer und Wirbel kurz. Sofort fügen Sie 320 µL des High-Density-Vorläufers der Kassette, erneut mit einer 1-mL-Pipette hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit gleichmäßig die Füller Gelschicht Mäntel durch Schaukeln der Kassette hin und her etwa 3 Mal. Dieser Schritt sollte weniger als drei Minuten dauern.
7. Füllen Sie den Rest der Kassette mit entionisiertem Wasser entgast. Pipette langsam mit einer 1-mL-Pipette in die Mitte der Kassette zu mischen zu minimieren. Lassen Sie das Polymer für mindestens 15 Minuten, vorzugsweise eine Stunde zu heilen.
8. Wieder, invertieren Sie die Gel-Kassetten um die Wasser-Overlay zu entfernen. Druckluft kann verwendet werden, die Oberfläche sanft trocknen. Hinzu kommen TEMED und APS der Low-Density Gel Vorläufer und Wirbel kurz. Sofort füllen Sie den Rest der Kassette (~1.65 mL) mit der Low-Density Gel-Vorläufer und setzen Sie den Gel-Kamm.
9. Pipette ein Übermaß an Reserve Vorläufer an der Spitze des Kammes, wie es während der Polymerisation absorbiert wird. Lassen Sie das Polymer, mindestens 4 Stunden, besser über Nacht heilen. Gele können für eine Woche oder länger in einem Puffer Tris-Borat-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (TBE Puffer) gespeichert werden.

3. die Probenvorbereitung und Reverse Transkription

1. Beginnend mit einer Aussetzung der Zellen von Interesse, und arbeiten in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Laminar-Flow Kapuze, verwenden eine Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler zur Berechnung der Zellkonzentration. Verdünnen Sie die Zellen zu einer Konzentration von 100 bis 1000 Zellen pro Mikroliter in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   Hinweis: Dieses Protokoll ist auf einen Bereich von Zellen, einschließlich PC3, HeLa und Leber Mauszellen validiert worden.
2. Reagenzien zur Verfügung gestellt in der WTA mit kit (siehe Tabelle der Materialien), Mix 19 µL Lyse Puffer und 1 µL RNase-Inhibitor, bereiten Sie ein 10 X auf Lager Lösung Reaktion Puffer. Erstellen Sie einen Lyse-master-Mix von ausreichendem Umfang mit 0,5 µL Reaktion Puffer und 2,75 µL Nuklease freies Wasser für jede Probe.
3. Die Zellsuspension nach oben und unten 5 Mal neu besiedelte Zellen auszusetzen und dann pipette 1 µL der Probe in ein 200 µL Nuklease kostenlose Strip Rohr sterilisiert durch UV-Pipette. Wiederholen Sie diese Schritte je nach Anzahl der Proben. Achten Sie darauf, eine negative Kontrolle durch Pipettieren 1 µL Nuklease kostenlos Wasser anstelle von Zellen für eine Reaktion enthalten. Als nächstes jede Probe 3,25 µL Lyse-master-Mix hinzu und mischen Sie, indem Sie sanft nach oben und unten 5 Mal pipettieren.
4. Thermocycler (mit beheizten Deckel) auf 72 ° c vorheizen 1 µL RT-Grundierung und 1 µL 20 µM random Hexamer, jede Probe mit WTA-Adapter (5′-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′) hinzufügen. Reservieren Sie mindestens eine Röhre als Positivkontrolle für gDNA Bibliothek Vorbereitung und fügen Sie 2 µL Wasser anstelle von Primern.
   Hinweis: Random Hexamer mit WTA-Adapter ist optional und hat nur minimale Auswirkungen auf Ergebnisse der Sequenzierung.
5. Inkubieren Sie Proben bei 72 ° C in den vorgeheizten Thermocycler für 3 Minuten, die Zellen lysiert. Entfernen Sie Zellen aus Thermocycler und auf Eis für 2 Minuten. Speichern Sie die Positivkontrolle bei 4 ° C bis Schritt 5.
6. Während die Zellen Lyse sind, erstellen Sie ein ausreichendes Volumen der reversen Transkription master-Mix für alle RNA-Proben, enthält die folgenden Reagenz Verhältnisse: 2 µL der erste Strang Puffer, 0,5 µL Vorlage Schalter Oligonukleotid (TSO), 0,25 µL RNase-Inhibitor und 1 µL Reverse Transkriptase (100 U/µL).
7. Heizen Sie Thermocycler bis 42 ° C vor. Die restlichen Proben, die Gesamtstichprobe Lautstärke bringen 10 µL. 3,75 µL der reversen Transkription master-Mix hinzufügen Mix von Pipettieren rauf und runter 5 Mal.
8. Führen Sie reversen Transkription, indem man sofort Proben in einem vorgeheizten Thermocycler. Führen Sie das folgende Programm: 42 ° C für 90 min, 70 ° C für 10 min, 4 ° C für immer. Dies ist ein sicheres Haltepunkt.

4. Gel Trennung und probieren Sie Erholung

1. Reinigen Sie sorgfältig eine Gel-Elektrophorese-Kammer mit einem DNA-Entfernung-Produkt. Gelten mehrere mL flüssiges Reinigungsmittel für eine Einweg-Fussel freien Tuch und wischen Sie über alle Oberflächen der Kammer, und füllen Sie dann die Kammer mit sauberen 0,5 X TBE. Legen Sie um optimale Ergebnisse zu erzielen den gesamten Apparat in einem 254 nm UV-Vernetzung-Ofen und für 15 Minuten (15 mJ/cm²) sterilisieren.
2. Setzen Sie die Gel-Seq-Kassette in der Gel-Elektrophorese-Kammer und verriegeln Sie ihn einrasten. Langsam ziehen Sie den Gel-Kamm gerade nach oben. Bewegen Sie sich langsam, reißen das Gel oder Rippen irgend einen der Arme zu vermeiden.
3. Halten die Proben aus Schritt 3 auf Eis, Rückstellprobe mindestens als Positivkontrolle für cDNA-Bibliothek-Generation. Speichern Sie dieses Steuerelement bei 4 ° C bis zu Schritt 6. Fügen Sie 2 µL 6 X laden Farbstoff, die restlichen Proben, bringen das Gesamtvolumen ~ 12 µL. gründlich mischen der Proben durch Pipettieren rauf und runter 5 Mal.
4. Kombinieren Sie 1 µL einer DNA-Leiter mit 2 µL 6 x laden Farbstoff und 7 µL Wasser. Diese Mischung in Spur 1 Gel-Seq-Kassette als Elektrophorese Kontrolle Pipette. Pipette die Proben aus dem vorherigen Schritt auf getrennten Bahnen der Gel-Seq-Kassette. Achten Sie darauf, um Kontaminationen zwischen Brunnen durch Einfügen der Pipette voll in jede Vertiefung und entfernen es mit nur vertikalen Bewegungen zu vermeiden.
5. Verwenden ein standard-Gel-Elektrophorese-Netzteil, wenden Sie ein elektrisches Feld von 250 V auf die Gel-Seq-Kassette für 30 Minuten, die gDNA von DNA/RNA-Hybriden zu trennen. Einmal getrennt, entfernen der Gel-Seq-Kassette aus der Gel-Elektrophorese-Kammer und öffnen Sie die beiden Hälften der Kassette von neugierigen die Kanten mit einem Schaber.
6. Mit einem Skalpell, halbieren Sie das Gel direkt unterhalb der High-Density-Schicht. Entsorgen Sie die Hälfte, die Füller Gel enthält, indem Sie es sich mit der behandschuhten Hand. Schälen Sie sanft das restliche Gel aus der Kassette durch mit einem Farbschaber oder anderen ähnlichen Werkzeug Schaben. Legen Sie in diesem Abschnitt des Gels in eine Schale mit ~ 30 mL 0,5 X TBE mit 3 µL Gel Fleck.
7. Decken Sie den Container zu minimieren Immunofluoreszenz und genießen, dass das Gel sanft schütteln den Container für 5 Minuten. Legen Sie das Gel auf Plastikfolie und nehmen Sie eine UV-Bild mit einem Gel-Dokumentations-System (für weitere Details siehe Nr. 13). Ein 30 Sekunden Exposition produziert in der Regel klare Bilder. Stellen Sie sicher, dass Trennung stattgefunden hat.
8. Bewegen Sie das Gel zu einem UV-Transilluminator Visualisierung der Nukleinsäuren zu erleichtern. Mit entsprechenden UV-Brille, bestätigen Sie die Ergebnisse aus dem Gel-Dokumentation-System. Die gDNA sollte zu Beginn der Low-Density-Gel und die cDNA an der Schnittstelle der Low-Density und High-Density-Regionen befinden.
9. Verwenden Sie ein Skalpell, schneiden Sie die Regionen des Gels mit dem gDNA und cDNA. Proben werden am besten durch eine 4 mm x 10 mm rechteckigem Querschnitt Gel schneiden wiederhergestellt; Allerdings hängt die genaue Geometrie der Gel-Elektrophorese-System verwendet. Denken Sie daran, auch die Spur geladen mit der Negativkontrolle geschnitten.
10. Platzieren Sie jedes ausgeschnittenen Teil Gel in ein Strip-Rohr mit stumpfen Ende Pinzette. Achten darauf, nicht zuviel Gewalt anwenden oder das Gel wird in mehrere Teile aufgeteilt. Dies sollte passieren, einfach abholen jedes Stück und fügen Sie es auf das Rohr.
11. Schleifen Sie das Gel in jedem Röhrchen mit einer Pipettenspitze (200 µL Pipette Tipps funktionieren gut) durch Verschieben der Pipettenspitze ein kreisförmig gegen die Unterseite des Rohrs. Jedes Rohr fügen Sie Nuklease freies Wasser (40 µL in gDNA Proben und 80 µL in die DNA-Proben hinzu) vor dem Entfernen der Pipettenspitze verwendet, um das Gel zur Minimierung von Probenverlust mahlen.
12. Legen Sie die Streifen-Rohre zu einem Vortex-Mixer in einem 37 ° C Inkubator und schütteln für 8-12 Stunden. Dies ermöglicht die Nukleinsäuren, aus dem Gel zu verbreiten und ist ein natürlicher Haltepunkt für dieses Multi-Tag-Protokoll.
13. Pipette die Proben in ein 8 µm Netz Filterplatte und drehen Sie die Platte bei 2600 X g für 5 Minuten zu belasten, die Gel-Fragmente. Heben Sie die Netz-Filter-Platte von der Gehäuse-Platte und pipette die Gel-freies Wasser-Proben zu einem neuen 200 µL Streifen Schlauch.
14. Jede Probe gDNA, Mix gut von oben und unten, Pipettieren mit 1 µL Protease (0,9 AU/mL) hinzu und bei 50 ° C für 15 min, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung bei 70 ° C für 15 min inkubieren. Dieser Schritt ist entscheidend für die abbauende Nukleosomen und macht die gDNA für nachfolgende Reaktionsschritte zugänglich.
15. Mit einem 18-Gauge-Nadel, stechen Sie Löcher in das Kappen der alle Probenröhrchen. Legen Sie die Proben in ein Vacufuge um flüssiges Volumen zu reduzieren. gDNA Proben sollte auf 5 µL und cDNA Proben reduziert auf 10 µL reduziert werden.
16. Je nach Vacufuge und Anzahl der Proben wird die gesamte Verdunstung Zeit zwischen 30 und 60 Minuten variieren. Unterschreitet das Probenvolumen das Ziel-Volume, fügen Sie einfach Nuklease kostenlos Wasser um das Probenvolumen zu erhöhen.

5. gDNA Bibliothek Vorbereitung

1. Mit einem Fluorometer oder ähnliche Technologie, Quantifizierung der DNA-Konzentration in jeder gDNA Probe aus Schritt 4 sowie die Positivkontrolle aus Schritt 3. Ein detailliertes Protokoll finden Sie unter Fluorometer Reference Manual. ¹⁴
2. Verdünnen Sie zu 0,2 ng/µL DNA-Proben. Je nach Ausgangspunkt Zelltyp und Qualität der Ergebnisse erforderlich können niedrigere Konzentrationen noch brauchbare Bibliotheken produzieren. Einige Experimente werden benötigt; Allerdings hatten die Autoren Erfolg mit Bibliotheken so niedrig wie 0,1 ng/µL.
3. Vervollständigen Sie gDNA Bibliothek Vorbereitung, indem Sie die Bibliothek Vorbereitung halbe Reaktion Volumen Protokoll in Step 7.

(6) cDNA Bibliothek Vorbereitung

1. Beginnend mit 10 µL cDNA Proben und Positivkontrolle aus Schritt 4, fügen Sie 12,5 µL 2 X qPCR Mix, 0,5 µL cDNA PCR Primer und 2 µL Nuklease-freies Wasser.
2. PCR in eine Echtzeit-Thermocycler verwenden das folgende Protokoll ausführen: hot Start bei 95 ° C für 3 min, gefolgt von 20-30 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 65 ° C für 30 s und 72 ° C für 3 min. Gesamtstichprobe Volumen 25 µL. überwachen die Reaktion Kurven und stoppen die Verstärkung vor th e Reaktionen verlassen die exponentielle Phase (lineares Signal Anstieg gegenüber Zykluszahl), um PCR-Artefakte durch Ausschmückungen zu vermeiden. Weitere Informationen über Ausschmückungen zu vermeiden siehe Abschnitt Diskussion dieses Papier sowie Ref. 15.
3. Reinigen Sie nach Verstärkung das Produkt mit der Festphase reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen nach dem Protokoll in Schritt 8. Einmal abgeschlossen, gehen Sie zum nächsten Schritt.
4. Mit einem Fluorometer oder ähnliche Technologie, Quantifizierung der DNA-Konzentration in jeder DNA-Probe als auch die Positivkontrolle ab Schritt 4. Verdünnen Sie die Proben, bei Bedarf um etwa 0,2 ng/µL DNA enthalten. Etwas niedrigere Konzentrationen produzieren noch brauchbare Bibliotheken. Einige Experimente sind erforderlich, aber die Autoren Erfolg mit Bibliotheken so niedrig wie 0,1 ng/µL hatten.
5. Optionaler Schritt: führen Sie eine standard Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Trennung auf 1-2 µL der einzelnen qPCR-Produkt für die Bibliothek Generation Reaktion bestätigen gearbeitet. Ein Beispiel-Bild des erfolgreichen Ergebnis ist in Abbildung 4dargestellt. Für ein detailliertes Protokoll wie Polyacrylamid Gelelektrophorese durchführen siehe Ref. 16.
6. Vervollständigen Sie cDNA Bibliothek Vorbereitung, indem Sie die Bibliothek Vorbereitung Kit halber Lautstärke Reaktion Protokoll in Step 7.

(7) Bibliothek Vorbereitung mit halber Lautstärke Reaktionen

1. Bibliothek-Vorbereitung folgt der Bibliothek Vorbereitung Kit Protokoll mit halber Lautstärke Reaktionen. ¹⁷ alle Reagenzien, auf die verwiesen wird in diesem Abschnitt des Protokolls sind von der Bibliothek Vorbereitung kit (siehe Tabelle der Materialien). Beginnen Sie durch UV-Sterilisation eine ausreichende Anzahl von Streifen Rohre für die Anzahl der Samples verarbeitet werden.
2. Führen Sie die Transposase Reaktion durch Zugabe von 5 µL Transposase Puffer zu jeder Streifen-Schlauch in der Probe verwendet werden. Fügen Sie dann 2,5 µL Eingabe DNA auf 0,2 ng/µL (0,5 ng gesamt) gefolgt von 2,5 µL Transposase. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 5 Mal pipettieren.
3. 5 Minuten bei 55 ° C inkubieren Sie, dann halten Sie bei 10 ° C. Nachdem die Probe 10 ° C erreicht hat, entfernen Sie es aus der Thermocycler und sofort jede Probe fügen Sie 2,5 µL Transposase Stop Puffer hinzu. Die Proben für 5 Minuten bei Zimmertemperatur aufbewahren.
4. Bereiten Sie die PCR-Reaktion, die Transponierung behandelt Probe zu verstärken, indem 7,5 µL Bibliothek Prep PCR-Mixes, 2,5 µL eine Grundierung Index 1 und 2,5 µL ein Index 2 Grundierung vor. Diese Primer sind urheberrechtlich geschützt und werden vom Hersteller des der Bibliothek Vorbereitungssatz geliefert. Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter 5 Mal.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass einzigartige Grundierung Kombinationen für jede Probe verwendet werden. Es gibt 12 verschiedene Index 1 Primer und 8 verschiedenen Index 2 Primer, die es ermöglichen, bis zu 96 verschiedene Proben eindeutig kennzeichnen. Wählen Sie eine einzigartige Kombination von Primern für jede Probe.
5. Mit dem folgenden Programm auf einem Thermocycler PCR durchführen. Die Probenmenge ist 25 µL.
   72 ° C für 3 Minuten
   95 ° C für 30 Sekunden
   12 Zyklen:
   95 ° C für 10 Sekunden
   72 ° C für 30 Sekunden
   55 ° C für 30 Sekunden
   72 ° C für 5 Minuten
   Bei 10 ° C halten
6. Reinigen Sie die vorbereiteten Bibliotheken mit SPRI Perlen nach dem Protokoll in Schritt 8. Die Bibliotheken sollten mittels Gelelektrophorese oder einen ähnlichen Test validiert werden. Finden Sie die Bibliothek Vorbereitung Kit Handbuch ausführliche Informationen zu Bibliotheken zu validieren. ¹⁷

8. die Festphase Reversible Immobilisierung Bead Bibliothek Reinigung

1. Festphase reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen sollten in 1,5 mL Aliquote gelagert werden und sollte vor jedem Gebrauch auf Zimmertemperatur gebracht. Es wird auch empfohlen, frisch 80 % igem Ethanol für jedes Experiment vorbereiten. Die folgenden Schritte basieren das SPRI Wulst Protokoll in der WTA-Kit-Handbuch. ¹⁸
2. 1 µl des Puffers WTA Kit Lyse zu jeder PCR-Produkt hinzufügen. Wirbel der SPRI-Perlen bis gleichmäßig gemischt, dann hinzufügen 50 µl SPRI Perlen jeder Probe. Mischen Sie, indem die Probe nach oben und unten 10 Mal pipettieren und 8 Minuten dann inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur.
3. Kurz drehen Sie die Proben um die Flüssigkeit von der Seite der Rohre zu sammeln. Legen Sie die Proben auf eine magnetische Trennvorrichtung für ~ 5 Minuten, bis die Flüssigkeit ganz klar erscheint.
4. Während der Proben auf die magnetische Trennvorrichtung, langsam pipette aus dem überstand und verwerfen - seien Sie vorsichtig, um nicht zu stören den Ring von Perlen auf dem Schlauch. Als nächstes fügen Sie 200 µL Ethanol 80 % jede Probe hinzu, ohne zu stören die Perlen. 30 Sekunden warten und dann vorsichtig aus der Überstand pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt (Ethanol waschen) einmal.
5. Ermöglichen die Proben trocknen für 30 s - 1 min. Nicht übermäßig trocknen Sie die Proben wie große Fragmente, die Perlen dauerhaft gebunden werden werden.
   Hinweis: Eine kurze Trocknungszeit wird empfohlen, um sicherzustellen, dass alle Spuren von Ethanol entfernt werden. Spuren von Ethanol zurückbleiben sollten können sie leicht nachgeschaltete Reaktionen hemmen.
6. Entfernen Sie die Proben aus der magnetischen Trennvorrichtung und jede Probe, die DNA aus den Perlen eluieren fügen Sie 15 µL Wasser hinzu. Pipette rauf und runter und sicherzustellen, dass die Perlen aus den Seiten der Rohre entfernt werden. 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Drehen Sie kurz die Proben und dann legen Sie sie auf die magnetische Trennvorrichtung für ~ 1 Minute, bis die Lösung klar erscheint.
7. Während der Proben auf die magnetische Trennvorrichtung, langsam pipette auf den Überstand und überträgt es auf saubere Rohre. Achten Sie darauf, nicht zu stören den Ring von Perlen auf dem Schlauch. Entsorgen Sie die Rohre mit Perlen.

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Ergebnisse

Die räumliche Trennung von gDNA und DNA/RNA-Hybriden in der Gel-Seq-Gerät kann durch fluoreszierende Gel Imaging sichtbar gemacht werden; ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 3dargestellt. Zentrale A zeigt die fabrizierte Gel-Seq-Gerät; falsche Farbe wurde hinzugefügt, um die verschiedenen Gel-Regionen zu unterscheiden. Zentrale B zeigt eine Nahaufnahme von vier verschiedenen Trennungen für die Validierung verwendet. Die dritte Spur, eine Negat...

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Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die mit der Gel-Seq-Gerät-Fertigung sowie das Protokoll selbst verbunden. Während der Fertigung empfiehlt es sich, beginnend mit der vorgeschriebenen Schichtdicken für die verschiedenen Regionen des Gels. Wir verbrachten viel Zeit verschiedene Herstellung Testmöglichkeiten und das hier beschriebene Protokoll produziert die besten Geräte für die Kassetten, die in der Tabelle der Werkstoffe und Reagenzienaufgeführt. Wenn Forscher eine alternative Kassettensystem ve...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.