Bewertung der Plasma Koagulation am Lebergewebe in einem großen Tiermodell In Vivo

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Plasma-Koagulation in Lebergewebe in Vivoexperimentell zu beurteilen. In einem porcinen Modell Mikrozirkulation wird mittels Laser Doppler untersucht, Koagulation Tiefe bemisst sich histologisch, Temperatur am Standort der Gerinnung durch Infrarot-Thermometer und Thermografische Kamera Kanal Dichtwirkung ist dokumentiert durch Berstdruck Experimente.

Zusammenfassung

Plasma Koagulation als eine Form der elektrokauter wird in der Leber Chirurgie seit Jahrzehnten zum Versiegeln Sie der große Leber Schnittfläche nach großen Hepatektomie, Blutungen zu einem späteren Zeitpunkt zu verhindern. Die genauen Auswirkungen der Plasma Koagulation im Lebergewebe sind nur unzureichend untersucht. In unserem porcinen Modell können in der Nähe der klinischen Anwendung der koagulationseffekte untersucht werden. Eine kombinierte Laser Doppler Durchflussmesser und Spektralfotometer Dokumente Mikrozirkulation ändert während Koagulation in 8 mm Gewebe Tiefe nicht-invasiv, quantifizierbare Informationen über Blutstillung jenseits der subjektive klinische Eindruck. Die Temperatur am Standort der Koagulation wird mit einem Infrarot-Thermometer Prior und Post-Koagulation und eine Thermografische Kamera während Gerinnung beurteilt, eine Messung der Gastemperatur Strahl ist nicht möglich, da die Obergrenze der Geräte. Die Tiefe der Koagulation wird mikroskopisch auf Hämatoxylin/Eosin befleckt Abschnitte nach der Kalibrierung mit einem Objekt Mikrometer gemessen und gibt eine genaue Information über das macht Einstellung-Koagulation Tiefe-Verhältnis. Die Dichtwirkung wird auf die Gallengänge untersucht, da es nicht möglich für ein Plasma-Coagulator, größere Blutgefäße zu versiegeln. Burst Druck Experimente heraus auf explantierten Organe auszuschließen Blutdruck im Zusammenhang mit Effekten.

Einleitung

Argon-Plasma-Koagulation (APC) ist ein weit verbreitetes Instrument im Bauchchirurgie seit mehr als drei Jahrzehnten^1,2. Es ist ein Standardverfahren für die Erreichung der sekundären Hämostase nach großen Hepatektomie durch Versiegelung der Leberzellkrebs Oberfläche, um zu verhindern, dass später Blutungen³geschnitten. Plasma-Koagulation ist eine spezielle Form der Radiofrequenz elektrokauter, die die elektrische Energie über einen Bogen von ionisiertem Gas liefert. Bereitstellung von monopolaren elektrothermische Blutstillung, hat diese berührungslose Technik den Vorteil, die Elektrode an das Gewebe⁴halten zu verhindern. Der ionisierte Gas-Strahl richtet sich automatisch auf den Bereich des geringsten elektrischen Widerstands und wird abgewiesen, wenn Widerstand aufgrund von Austrocknung auf andere Bereiche, die noch nicht ausgetrocknet steigt. Dadurch entsteht eine einheitliche begrenzte Tiefe Koagulation^5,6. Faktoren, die die Gerinnung Wirkung sind die Aktivierung Zeit, Einstellung der Leistung des Geräts Koagulation und der Abstand von der Sonde des Gewebes. Helium ist ein weiteres Trägergas, die für Plasma-Koagulation⁷verwendet werden können. Aktuelle klinische Studien konzentriert sich auf klinische Ergebnisse anstatt histologische und funktionelle Ergebnisse^3,8,9, während experimentelle Studien konzentrierte sich auf in-vitro- Untersuchungen¹⁰ oder Experimente an isolierten PERFUNDIERTEN Organen¹¹.

Das zugrunde liegende Protokoll ermöglicht die Studie über die Auswirkungen der Plasma-Koagulation in einem großen Tier-Modell in der Nähe der klinischen Anwendung unter Verwendung von menschlichen Standardausrüstung auf Schweine: Mikrozirkulation ist nicht-invasiv durch eine Laser-Doppler-Durchflussmesser bewertet und Spektralphotometer, die klinische Standardtool für diese Indikation^12,13ist. Temperaturänderungen während Koagulation werden mit einem Infrarot-Thermometer und eine Thermografische Kamera überwacht. Die Tiefe der Koagulation wird auf histologischen Hämatoxylin/Eosin befleckt Abschnitte nach der Ernte von Gewebeproben gemessen. Für den Vergleich mit anderen Mitteln zur sekundären Hämostase werden platzen Druck Versuche durchgeführt. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Techniken¹⁴, diese werden durchgeführt auf explantierten Organe auszuschließende Blutdruck im Zusammenhang mit Effekten. Zusätzlich zu den beschriebenen Untersuchungen über die lokalen Auswirkungen der Plasma-Koagulation können standard Blutuntersuchungen auch im porcinen Modell durchgeführt werden.

Protokoll

Vorschriften unterliegen deutschem Recht für tierexperimentelle Studien sowie die Grundsätze der Laboratory Animal Care (National Institutes of Health Publikation Hg. 8, 2011) folgten. Offizielle Erlaubnis ist aus dem staatlichen Tierpflege-Büro (Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt Und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Deutschland).

(1) Tiere

1. Verwenden Sie weibliche deutsche Landrasse-Schweine (von 25-30 kg) in offenen Käfigen untergebracht.
2. 5 Tiere pro Gruppe (Argon und Helium) zu verwenden.
3. Lassen Sie die Tiere in die Umgebung für mindestens eine Woche vor den versuchen zu akklimatisieren. Schnelle Tiere 24 Stunden vor der Operation mit freiem Zugang zu Wasser.

(2) Anästhesie

1. Premedicate die Tiere mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (15 mg/kg Körpergewicht [BW]), Xylazin (10 mg/kg kg) und Atropin (0,1 mg/kg kg) 10 min vor der Induktion der Anästhesie.
2. Peripheren venöser Zugang wird durch Platzierung einer 22-Gauge-Kanüle in eine Vene Ohr aufgebaut.
3. Induzieren Sie Vollnarkose durch intravenöse Injektion von Propofol 2 mg/kg Körpergewicht.
4. Legen Sie das Tier in Rückenlage und führen Sie einen longitudinale Hautschnitt in der Vena Nut über eine Länge von 2 cm. Locate Vene durch die stumpfe Vorbereitung des subkutanen Gewebes. Stecken Sie die Kanüle, dann Seldingertechnik Draht.
5. Kanüle zurückziehen und 14 Fr. Katheter über den Führungsdraht einfügen. Führungsdraht zurückziehen. Verbinden Sie Katheter für die Erweiterung zu und fixieren Sie den Katheter mit einem Gurt oder einer Naht.
6. Ziehen Sie die Zunge heraus und setzen Sie gerade Laryngoskop. Verwenden Sie die Spitze des das Laryngoskop herunterziehen der Kehldeckel. Legen Sie das Rohr durch die Stimmbänder. Manschette unter Stimmritze und aufblasen.
7. Lüften Sie mit 40 % Sauerstoff bei 20-26 Atemzüge/min und ein Tidalvolumen von 10 ml/kg um die Ende-Gezeiten teilweise Carbon Dioxide Spannung zwischen 36 und 42 mm Hg zu halten.
8. Pflegen Sie Anästhesie mit Isofluran in einer Konzentration von 1-1,5 % und Fentanyl bei einer Konzentration von 3 bis 4 µg/kg/h.
9. Lieferung von Ringer Laktat-Lösung mit einer ersten Rate von 4 mL/kg/h, und erhöhen Sie nach Laparotomie, ein konstanter Infusionsrate von 8 mL/kg/h.

3. Operation und Plasma Koagulation

1. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine standard-OP-Tisch.
2. Haut durch die Anwendung einer handelsüblichen chirurgischen Desinfektionsmittels desinfizieren (2-Propanol 45 g/100 g, 1-Propanol 10 g / 100g, APEO-2-Ol 0,2 g/100 g) mit einem chirurgischen Tupfer für 3 Mal.
3. Durchführen Sie eine breite Mittellinie Laparotomie aus dem Xiphoid Prozess, um das Schambein mit einem Skalpell und installieren Sie chirurgische Retraktoren zu.
4. Das Plasma Koagulation Gerät einschalten, Argon oder Helium Gasflasche, abhängig von der verwendeten Trägergas zu öffnen. Gasstrom 3 L/min. Wählen Sie Koagulation Gerät Ausgangsleistung wie gewünscht anpassen.
   Hinweis: Beide Edelgase Argon oder Helium, Plasma Koagulation einsetzbar. Koagulationseffekte sind vergleichbar. Siehe Referenz⁷ für Details.
5. Durchführen Sie Plasma-Koagulation auf der linke Lappen der Leber als zuvor beschriebenen⁷. Verwenden Sie eine Titan-Form (quadratische Blende 1 x 1 cm²) um den koagulationsbereich zu standardisieren. Gerinnen für 5 s mit einer Sonde Abstand von 1 cm. Die Coagulations mit verschiedenen Leistungsstufen können Seite an Seite mit einem kurzen Abstand zwischen den Coagulations von 5 mm (Abbildung 1) durchgeführt werden.
6. Teilen Sie für die Ernte der Leber alle Bänder-Verbindungen für die Leber. Isolieren Sie und teilen Sie der hepatischen pedikels oberhalb der überlegenen duodenalen Biegung lange Teile der Pfortader und choledochus verlassen. Teilen Sie die filterarme Vene oberhalb und unterhalb der Leber und Abrufen der Orgel.
7. Nach der Ernte der Leberzellkrebs wurden die Schweine durch intravenöse Gabe von 0,16 g/kg BW Pentobarbital eingeschläfert.
8. Resezieren Sie für die Burst-Druck-Experimente die Hälfte der linken medialen Leber Lappen mit einer scharfen Schere. Plasma-Koagulation den Schnitt Oberfläche (100W Ausgangsleistung) oder Versiegeln der Schnittflächen mit Fibrin Dichtstoff (Abbildung 2).

(4) Mikrozirkulation Messung

Hinweis: Laser-Doppler-Spektroskopie bestimmen Blutfluss im Gewebe durch die Messung des Doppler-Verschiebung verursacht durch die Bewegung der Erythrozyten. Das lasersignal korreliert mit der Anzahl der beweglichen Erythrozyten. Laser-Doppler-Spektroskopie ist in der klinischen Anwendung (z. B. Transplantationsmedizin) und wurde mehrere Male¹⁵validiert.

1. Schalten Sie den Laser-Doppler-Durchflussmesser und Spektralfotometer. Eine flache Sonde verwendet werden.
2. Baseline-Messungen für Durchfluss und Geschwindigkeit zu nehmen. Speichern Sie oder notieren Sie die Werte.
3. Führen Sie Koagulation, wie unter 3.5 beschrieben.
4. Legen Sie die flache Sonde auf Koagulation Websites und Maßnahme fließen und Geschwindigkeit. Wieder, speichern Sie oder beachten Sie die Werte.
5. Wiederholen Sie für alle Leistungsstufen des Coagulator Gerätes.

5. die Temperaturmessung

1. Schalten Sie die Anlage auf (Thermografische Kamera, Notebook und Infrarot-Thermometer) und mindestens 1 h laufen bevor Sie Messungen durchführen lassen.
2. Stellen Sie Fokus und Rahmen auf die Thermografische Kamera auf der Koagulation-Website. Infrarot-Sequenzen detektiert werden, mit der räumlichen Auflösung von 1024 x 768 Pixel mit einer Temperaturauflösung größer als 20 mK. Berücksichtigen, das der Region Koagulation und das umliegende Gewebe — Wärmeübertragung betroffen — liegt in der Mitte der Ansicht.
   Hinweis: Es sollten möglichst viele Pixel des Rahmens wie möglich für eine optimale räumliche Auflösung enthalten.
3. Koagulationsprozess mit der Plasma-Coagulator auf der Oberfläche der Leber mit der Thermografie Kamera über einen Zeitraum von 2-min aufnehmen.
4. Analysieren von Bildsequenzen mit der Thermografie-Analyse-Software: interessante Regionen zu definieren.
   Hinweis: Software berechnet den Kurs der entsprechenden mittleren Temperatur im Laufe der Zeit.

(6) Koagulation Tiefenmessung

1. Ernten Sie die linken mediale Leber Lappen mit einer scharfen Schere.
2. Verbrauchsteuern Sie die Gerinnung Websites mit 1 cm Dicke. Schneiden Sie in 3 mm Dicke längs-Segmente zur Weiterverarbeitung.
3. Fix Gewebeproben bei 4 ° C über Nacht mit neutralen 10 % gepuffert Formalin. Paraffin 2 ° C über dem Schmelzpunkt erhitzen und Scheiben einbetten. Prozess über Nacht.
4. Führen Sie Hämatoxylin/Eosin Färbung.
   1. Deparaffinize und Hydrat des Gewebes durch nachträglich Eintauchen in 2 x Xylol, 100 % igem Ethanol (EtOH), 95 % EtOH, 70 % EtOH, entionisiertem H₂O 2 min. lang.
   2. Führen Sie die Gewebeprobe mit Meyers Hämatoxylin Lösung für 3 min zu Flecken.
   3. Jetzt im Leitungswasser für 5 min spülen.
   4. Führen Sie das Gewebe mit Eosin-Lösung für 3 min zu Flecken.
   5. In 2 X EtOH 95 % und dann Xylol 3 min spülen. Montieren Sie mit dem standard-Montage-Medium.
5. Schalten Sie das System ein (Mikroskop angeschlossenen Kamera, imaging-Software). Alle Abschnitte mit 40 X Vergrößerung anzeigen.
6. Nehmen Sie ein Bild von einem Objekt Mikrometer bei einer Vergrößerung von 40 X. Drücken Sie Recalibrate im Fenster "Ziele". Wählen Sie Manuelle Kalibrierung. Zeichnen Sie eine Linie auf das Mikrometer Bild von 100 µm. Enter 0,1 mm in das Dialogfeld ein, und drücken Sie "OK".
7. Länge in der Ansicht auswählen > Analyse Kontrollen > Fenster Anmerkungen und Messungen. Messen Sie von der Leber Oberfläche der Koagulation Rand mit der Maus. Exportieren Sie oder notieren Sie das Ergebnis. Wiederholen Sie die Messung an einem anderen Speicherort auf derselben Folie.
   Hinweis: Koagulation Tiefe kann leicht von den normalen Lebergewebe durch den scharfen Rand zwischen der normalen Hepatozyten Schnüre und die Zone der Nekrose mit geschrumpften Zytoplasma, pyknotischen Kernen und Blutung Zonen unterschieden werden.
8. Berechnen Sie Mittelwert aus beiden Messungen.

(7) Burst-Druckmessung

1. Schalten Sie das System ein (automatische Pumpen, Druck-Messgerät). Bereiten Sie die Leber Proben nach der Schritt 3.7.
   Hinweis: Verwenden Sie zwei parallele Pumpen über ein 3-Weg-Ventil verbunden. Der maximale Druck von 1.500 mm Hg kann nicht mit einer einzigen Pumpe abgerufen werden.
2. Isolieren Sie gemeinsame leberarterie, Pfortader und Gallengang mit einer Schere in die haptische Knochenschrauben. Pfortader mit einer Overholt Zange Spannen und verbinden mit einer Naht Monofil 4-0. Klemmen Sie gemeinsame leberarterie eine Overholt-Zange und verbinden mit einer Naht Monofil 4-0.
3. Ch-16 Katheter in den choledochus einfügen und verbinden mit einer 2: 0 Seide Naht. Schließen Sie den Katheter an die automatische Pumpen, installieren Sie 3-Wege-Hahn mit Druck-Messgerät (Abbildung 3).
4. Füllen Sie die Spritze Perfusion mit Kochsalzlösung.
5. Beginnen Sie automatische Pumpen mit einer Förderleistung von 99 mL/h.
6. Überwachen Sie Leber geschliffenen Oberfläche und Druck Meter für Leckage und Datensatz Berstdruck.
   Hinweis: Für einfacher Erkennung von Leckagen kann patent blau Kochsalzlösung (2 mL patent blau + 18 mL Kochsalzlösung) hinzugefügt werden. Es ist einfacher, Berstdruck zu beobachten, durch die Zeit des Verlustes des Drucks auf das Druck-Messgerät zu bemerken.

Ergebnisse

Mikrozirkulation: Das Diagnosegerät für die Blutstillung Plasma Koagulation nach Nutzung kann durch Veränderungen der Mikrozirkulation nachgewiesen werden. Kapillarblut Strömung (angezeigt als willkürliche Einheiten (AE)) nimmt von einem Ausgangswert von 142.7 ± 76,08 AU 57.78 ± 49.57 AU bei 25 W Gerät Ausgangsleistung, 48,5 ± 7.26 AU bei 50 W und 5.04 ± 1.31 AU bei 100 W (Abbildung 4).

Diskussion

Nager-Modelle für die Leberchirurgie werden für eine lange Zeit¹⁶gebildet. Dennoch große Tiermodellen bieten gewisse Vorteile: keine mikrochirurgische Ausrüstung ist notwendig, da operative Standardausrüstung für Menschen angewendet werden kann, Operationstechniken vergleichbar mit klinischen Verwendung sind und klinische Standardauswertung Methoden können sein übertragen auf die Experimente. Beispielsweise können ohne die Notwendigkeit für spezielle Labor-Prüfverfahren (

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine 20 mg/mL	Vetoquinol GmbH	Xylapan
Ketamine 100 mg/mL	Ceva GmbH	Ceva Ketamine Injection
Atropine 100 mg / 10 mL	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH	Atropinsulfat Köhler 100mg Amp.
Propofol	Fresenius Kabi GmbH	Propofol 1% MCT Fresenius
Fentanyl	KG Rotexmedica GmbH	Fentanyl 0,5mg Rotexmedica
Isoflurane	Abbot GmbH	Forene 100% (V/V) 250 mL
Ringer's lactate solution	Baxter Deutschland GmbH		sodium 131mmol/l, potassium 5 mmol/l, calcium 2 mmol/l, cloride 111 mmol/l, lactate 29 mmol/l
Surgical disinfactant	Schülke & Mayr GmbH	Kodan Tinktur forte gefärbt 1l 104804
Motorized microscope	Nikon Instruments Europe	Eclipse TE2000-E
Microscope camera	Nikon Instruments Europe	Digitalsight DS-Qi1Mc
Imaging software	Nikon Instruments Europe	NIS elements Vers. 4.40
Plasma coagulator	Söring GmbH	CPC-1000
Argon gas	Linde AG	Argon 4.8
Helium gas	Linde AG	Helium 4.8
O2C	LEA Medizintechnik GmbH	O2C Version 1212	with LF-2 or LF-3 probe
Infrared thermometer	Voltcraft	VOLTCRAFT IR 260-8S
Thermographic camera	InfraTec GmbH	VarioCAM HD head 820
Thermographic analysis software	InfraTec GmbH	IRBIS 3
Mayer's Hematoxylin solution		Merck 1.09249
Eosin solution	VWR International GmbH	Merck 1.09844
Rollerpump Masterflex L/S easy Load	Cole-Parmer Instrument Company	model 7518-10
Perfusorpump	B. Braun Melsungen AG	Perfusor secura FT
Digital pressure meter	Greisinger electronic	GMH 3161
Perfusorsyringe, 50 mL	B. Braun Melsungen AG	REF 8728810 F
Perfusor line, Type IV Standard, PVC Luer lock	B. Braun Melsungen AG	REF 8722960
3-Way stopcock, Dicofix C35C	B. Braun Melsungen AG	REF 16494 C
Silk 2-0. 3 metric	Resorba	REF H5F
Vicryl 4-0 Sutupak	Ethicon	V1224H
NaCl 0.9 %	B. Braun Melsungen AG